Presentiamo le tecniche necessarie per isolare la frazione vascolare stromale (SVF) dai depositi di tessuto adiposo inguinale (sottocutaneo) e perigonadico (viscerale) di topo per valutare la loro espressione genica e l'attività collagenolitica. Questo metodo include l'arricchimento di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC)ad alto contenuto di Sca1 utilizzando la separazione cellulare immunomagnetica.
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Articolo metodologico
Separazione immunomagnetica di Sca1 Fat Depot-specifica
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'isolamento delle cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) è un metodo importante nel campo della biologia del tessuto adiposo, dell'adipogenesi e del rimodellamento della matrice extracellulare (ECM). In vivo, l'ambiente ricco di ECM costituito da collageni fibrillari fornisce un supporto strutturale ai tessuti adiposi durante la progressione e la regressione dell'obesità. Il rimodellamento fisiologico della ECM mediato dalle metalloproteinasi della matrice (MMP) svolge un ruolo importante nella regolazione delle dimensioni e della funzione del tessuto adiposo1,2. La perdita del fisiologico rimodellamento della ECM collagenolitica può portare a un eccessivo accumulo di collagene (fibrosi tissutale), infiltrazione di macrofagi e, infine, a una perdita dell'omeostasi metabolica, inclusa l'insulino-resistenza3,4. Quando si osserva un cambiamento fenotipico del tessuto adiposo in modelli murini geneticamente mirati, isolare le ASC primarie dai depositi di grasso per studi in vitro è un approccio efficace per definire il ruolo del gene specifico nella regolazione della funzione delle ASC. Di seguito, definiamo una separazione immunomagnetica di ASCalte Sca1.
Introduzione
Staminali antigene cella 1 (Sca1, o Ly6A / E) per la prima volta identificata come un marcatore di superficie cellulare espressa da ematopoietiche e mesenchimali staminali cellule 5,6. La frazione vascolare stromale (SVF) di tessuto adiposo ottenuto da depositi di grasso del mouse è una popolazione eterogenea di cellule che compongono dei fibroblasti, macrofagi, cellule endoteliali vascolari, cellule neuronali e cellule progenitrici degli adipociti 7. Cellule progenitrici degli adipociti, o le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (CSA) sono cellule non carichi di lipidi che si trovano nella matrice extracellulare perivascolare ricchi di....
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Protocollo
Etica Dichiarazione: L'Università del Michigan Comitato Uso e manutenzione degli animali (UCUCA) ha approvato tutti i metodi ei protocolli in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (Institute for Research Laboratory Animal, Consiglio Nazionale delle Ricerche). I topi sono mantenuti in una Università del Michigan Vivarium e sono dati il libero accesso a cibo e acqua e tenuti al / ciclo di luce 12 ore scuro.
1. preparati
- Preparare terreni di coltura primaria con DMEM, 10% FBS, 1x P / S / G, e 1x antibiotici / antimicotici. Questo verrà utilizzato per mantenere i tessuti nella digestione pr....
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Risultati
Arricchimento di alte ASC SCA1 provenienti da diversi cuscinetti di grasso.
Le cellule stromali vascolari isolati dalla visualizzazione grasso SQ fibroblasti-like, allungato la forma delle cellule indipendentemente dal livello di espressione Sca1 (Figura 1A). D'altra parte, VIS (EWAT-derivati) SCA1 alta e bassa Sca1 cellule mostrano netta differenza nella loro forma cellula.......
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Discussione
Qui dimostriamo l'isolamento e la separazione immunomagnetica cellule di ASC murine da diversi cuscinetti di grasso e il loro utilizzo per esperimenti in vitro. Il metodo presentato è efficace per la rapida isolamento di un gran numero di ASC SCA1-positivo, che è vantaggiosa sulla tecnicamente complessi e costosi isolamento FACS-mediata di ASC 9,14. Diversamente FACS, separazione immunomagnetica non consente l'uso di antigeni multipli per l'identificazione di una popolazione di cellule be.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto da NIH DK095137 (al THC). Ringraziamo i membri del laboratorio attuali ed ex che hanno contribuito allo sviluppo e alla sofisticazione dei metodi descritti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tipo 3 Collagenasi | Worthington Biochimico | LS004182 | Digestione dei tessuti |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Terreno di coltura ad alto contenuto di glucosio |
| Pen/Streptococco/Glutammina (100x) | Gibco | 10378-016 | Terreno antibiotico |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Terreno antimicotico |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7,4) | Gibco | 10010-023 | |
| Tripsina (0,05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Filtro cellulare | BD Bioscience | 352360 | 100-μ Filtro cellulare m |
| Piastre da 60 mm | BD Falcon | 353004 | |
| Forbici | FST | 14001-12 | |
| Forbici | FST | 14091-11 | Punta fine e curva |
| Pinze grandi | FST | 11000-12 | |
| Pinze fini | Qualsiasi fornitore | ||
| 25G 5/8" aghi | BD | 305122 | |
| Aghi da 22G 1,5" | BD | 305159 | |
| Provette coniche da 15 ml | BD | Falcon 352097 | |
| Provette coniche da 50 ml | BD Falcon | 352098 | |
| Colonne di separazione MACS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Kit microsfere Anti-Sca1 (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1º Microsfere anticorpi e anti-FITC 2º Ab |
| AutoMACS tampone di corsa | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Separatore MiniMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Cuscinetti chux blu | Fisher | 276-12424 | |
| Cuscinetti assorbenti | Fisher | 19-165-621 | |
| Pannello di polistirolo | Utilizzare da provette da 50 ml | ||
| Etanolo | |||
| Isoflurano | Qualsiasi fornitore | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-topo Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Tubo a fondo tondo | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (– Ca, – Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | Per soluzione di collagenasi |
| Collagene di tipo I (2,7 mg/ml in acido acetico da 37 mm | Preparare in casa12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0,34 N NaOH | Preparare in casa | ||
| Vetrini coprioggetti | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 acido carbossilico, estere succinimidilico, isomeri misti | Invitrogen | A-20004 | |
| 0,89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
Riferimenti
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover.
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Ristampe e permessi
