大鼠初次摄入糖和脂肪后从中脑边缘和中脑皮层多巴胺奖赏区域同时检测c-Fos激活

摘要

本研究的目的是通过建立一种可靠的免疫组织化学技术，利用细胞c-fos激活来检测大鼠首次摄入脂肪和糖后多巴胺通路及其终末位点的同步变化，从而鉴定与奖赏相关的分布式脑网络。

摘要

本研究利用细胞c-fos激活来评估大鼠初次摄入脂肪和糖类对脑内多巴胺（DA）通路的影响。糖类和脂肪的摄取行为既受其固有吸引力的驱动，也受到后天习得偏好的调节。脑内多巴胺，特别是源自腹侧被盖区（VTA）的中脑边缘和中脑皮层投射通路，已被证实参与介导这两种先天及后天的反应。尽管已有研究提出“分布式脑网络”的概念，认为多个脑区及神经递质/肽类系统相互作用以调节可口食物的摄入，但目前尚缺乏足够的实验证据来明确支持这一机制。因此，摄入糖类可引起多巴胺释放，并增加VTA多巴胺投射区域的c-fos样免疫反应性（FLI），这些区域包括伏隔核（NAC）、杏仁核（AMY）、内侧前额叶皮层（mPFC）以及背侧纹状体。此外，向上述脑区中枢给予特异性多巴胺受体拮抗剂，可差异性地降低由糖类或脂肪诱导的条件性风味偏好的获得与表达。为确定这些脑区是否在摄入糖类或脂肪后以分布式脑网络的形式协同作用，一种可行的方法是同步评估VTA及其主要中脑端脑多巴胺投射区（前边缘和下边缘mPFC、伏隔核核心与壳部、基底外侧及中央-皮质-内侧杏仁核）以及背侧纹状体，在口服摄入无条件刺激的玉米油（3.5%）、葡萄糖（8%）、果糖（8%）和糖精（0.2%）溶液后，是否表现出协调且同步的FLI激活。该方法是成功识别利用细胞c-fos激活在多个相关脑区同步研究啮齿类动物摄食奖赏相关学习可行性的第一步。

引言

脑内多巴胺（DA）被认为通过享乐机制^1,2、与努力相关的机制³以及基于习惯的作用机制^4,5 ，参与对可口糖类摄入的中枢反应。介导这些效应的主要DA通路起源于腹侧被盖区（VTA），并投射至伏隔核（NAC）的核心与壳部、基底外侧及中央皮质内侧杏仁核（AMY），以及前边缘和下边缘内侧前额叶皮层（mPFC）（参见综述^6,7）。VTA已被证实参与蔗糖摄入过程^8,9，且在糖摄入后可在NAC^10–15、AMY^16,17和mPFC^18–20中观察到DA的释放。脂肪摄入同样可刺激NAC中DA的释放²¹，而另一富含DA的投射区域——背侧纹状体（尾状壳核）——也与DA介导的摄食行为相关^22,23。Kelley^24–27提出，该DA介导系统的多个投射区域通过广泛而紧密的相互连接，构成了一个整合性、交互性的分布式脑网络^28–34。

除了多巴胺D1和D2受体拮抗剂能够减少糖类^35-37和脂肪^38-40的摄入外，多巴胺（DA）信号传导还被认为参与介导糖类和脂肪引发条件性风味偏好的能力（CFP）^41-46。将多巴胺D1受体拮抗剂微量注射至伏隔核（NAC）、杏仁核（A....

方案

这些实验方案已获得机构动物照护与使用委员会的批准，确认所有实验对象和操作均符合美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》的要求。

1. 受试者

1. 购买和/或繁育雄性Sprague-Dawley大鼠（260 - 300 g）。
2. 将大鼠单只饲养在金属丝网笼中。保持12小时光照/12小时黑暗循环，自由供应大鼠饲料和水 随意摄取.
3. 分配适当的样本量 （例如，n ≈ 6 - 8）随机分组。

2. 测试装置与进样程序

1. 使用带有橡胶塞和45°角金属吸管的校准离心管，以准确测量（± 0.1 ml）所提供的溶液。用一根拉紧的金属弹簧将其固定在动物饲养笼上，以便观察刻度。
2. 限制大鼠的食物供给量（约15 g/天），使其体重减少至原始体重的85%，以增强其摄入溶液的动机。注意：体重下降过程应在3至5天内完成。
3. 在训练前连续四天，每天提供一次1小时的预训练溶液（10 ml，0.2%糖精），以最大化大鼠在后续测试中快速（潜伏期小于1分钟）采样测试溶液的可能性。
4. 通过滴出少量液体来确认离心管中的液体流动通畅。
5. 每次实验前后均称量离心管重量，以获得摄入量数据。
6. 在第五天对接受以下六种溶液之一的亚组进行摄入测试（每种溶液10 ml，测试1小时）：a) 水，b) ....

结果

下文所述所有代表性结果此前均已发表⁶⁹，此处重新展示旨在提供“概念验证”，以说明该技术的有效性。

溶液摄入量
在实验开始的前四天中，所有动物的基础糖精摄入量存在显著差异（F(3,108) = 57.27，p < 0.001），摄入量呈显著（p < 0.05，Tukey HSD 检验）且逐步上升趋势（第1天：1.3 (± 0.2) ml；第2天：3.9 (± 0.4) ml；第3天：5.9 (± 0.6) ml；第4天：7.1 (± 0.6) ml）。与第4天的糖精摄入量相比，第5天的果糖和葡萄糖摄入量显著增加（p < 0.05，Tukey HSD 检验），而玉米油和糖精摄入量则无显著变化（p < 0.05，Tukey HSD 检验）；其中果糖（9.6 (± 0.4) ml）和葡萄糖（9.4 (± 0.6) ml）的摄入量显著高于糖精摄入量。此外，玉米油摄入量（7.4.......

讨论

本研究旨在利用细胞c-fos技术，确定大鼠初次摄入脂肪和糖后，多巴胺奖赏相关神经元的来源（腹侧被盖区，VTA）及其前脑投射靶区（伏隔核，NAC；杏仁核，AMY；内侧前额叶皮层，mPFC）是否同时被激活。本研究详细描述了先前发表的一项研究的实验方案⁶⁹。我们假设，VTA及其向 prelimbic 和 infralimbic 区域的mPFC、NAC的核心与壳部、AMY的基底外侧部及中央-皮质-髓质区，以及背侧纹状体的主要投射区域将构成一个分布式的脑网络^24–27，并在初次摄入葡萄糖（8%）、果糖（8%）或玉米油（3.5%）溶液后，相对于糖精（0.2%）、水及其他对照溶液，表现出协调且同步的即刻早期基因荧光激活（FLI）。结果表明，玉米油、葡萄糖和果糖的摄入均显著且差异性地激活了VTA、prelimbic和infralimbic mPFC、NAC的核心与壳部、AMY的基底外侧部和中央-皮质-髓质区以及背侧纹状体，而糖精摄入则未产生此类激活。除c-fos技术外，本研究还采用了行为学方法评估糖、脂肪和人工甜味剂的摄入情况。

一个关键步骤是及时采集摄.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器设备
Sprague-Dawley 大鼠	Charles River Laboratories	CD-1
金属丝网笼	Lab Products, Seaford, DE	30-Cage rack
大鼠饲料	PMI Nutrition International	5001
张紧金属弹簧	Lab Products, Seaford, DE	n/a
大鼠电子秤	Fisher Scientific Company	n/a
Nalgene 离心管	Lab Products, Seaford, DE	10-0501
橡胶塞	Lab Products, Seaford, DE	n/a
金属饮水管	Lab Products, Seaford, DE	n/a
糖精	Sigma Chemical Co	82385-42-0
Kool-Aid，樱桃味	Kool-Aid	Commercial
Kool-Aid，葡萄味	Kool-Aid	Commercial
果糖	Sigma Chemical Co	F0127
葡萄糖	Sigma Chemical Co	G8270
玉米油	Mazzola	Commercial
黄原胶	Sigma Chemical Co	11138-66-2
滑动式切片机	Microm International	n/a
Neurolucida 成像系统	MBF Bioscience	Software application
明胶包被载玻片	Fisher Scientific Company	12-550-343
盖玻片	Fisher Scientific Company	12-545-M
金色尼龙刷	Loew-Cornell	2037
天然毛松鼠毛刷	Loew-Cornell	2022
24 孔板	Fisher Scientific	3527
6 孔板	Fisher Scientific	3506
1 L Pyrex 瓶	Fisher Scientific	1395-1L
组织嵌入盒（组织筛）	Fisher Scientific	7200214
Eagle 移液器	World Precision Instruments	E10（1–10μl）
Eagle 移液器	World Precision Instruments	E100（20–100μl）
Eagle 移液器	World Precision Instruments	E200（50–200μl）
Eagle 移液器	World Precision Instruments	E1000（100–1000μl）
Eagle 移液器	World Precision Instruments	E5000（1000–5000μl ）
通用吸头 0.1–10 μl	World Precision Instruments	500192
通用吸头 5–200 μl	World Precision Instruments	500194
通用吸头 500–5,000 μl	World Precision Instruments	500198
Blade Vibroslice 100 刀片	World Precision Instruments	BLADE
DPX 封片剂	Electron Microscopy	13510
15 ml 离心管	Biologix Research Co.	10-0501
载玻片盒	Biologix Research Co.	41-6100
旋转摇床	Madell Corporation	ZD-9556
称量舟	Fisher Scientific	02-202-100
5 ml 一次性移液管	Fisher Scientific	13-711-5AM
Stereo Investigator 软件	Micro Bright Field	Software application
名称	公司	货号	备注
试剂
颗粒状多聚甲醛	Fisher Scientific	19210
NaCl	Fisher Scientific	S271-1
磷酸二氢钠	Fisher Scientific	S468-500
磷酸氢二钠	Fisher Scientific	BP332-500
过氧化氢	Fisher Scientific	H324-500
SafeClear II	Fisher Scientific	23-044-192
甲醇	Fisher Scientific	A412-1
正常山羊血清	Vector	S-1000
生物素化抗兔 IgG（H+L）	Vector	BA-1000
ABC 试剂盒（过氧化物酶标准型）	Vector	PK-4000
抗 c-Fos（Ab-5）兔单克隆抗体	EMD chem/Cal Biochem	PC38
吐温 X-100	SigmaAldrich	X-100
3,3' 二氨基联苯胺四盐酸盐	SigmaAldrich	D5905
氢氧化钠	SigmaAldrich	5881
一抗 TH 抗体	EMD Millipore	AB152
Euthosol	Virbac AH