Murine Hind Limb Lang Bone Dissektion og knoglemarv Isolation

Protocol

Alt dyret arbejde blev godkendt ved Institutional Animal pleje og Brug udvalg i overensstemmelse med anbefalingerne beskrevet i Guide for pleje og anvendelse af forsøgsdyr i National Institutes of Health.

1. Hind Limb Long Bone Dissection

1. Aflive musen efter institutionelle retningslinier.
2. Placer musen i liggende stilling og anbringer ved at fastgøre alle fire ben gennem mus Trædepuder under anklen fælles.
3. Spray mus med 70% ethanol, grundig dousing benene.
4. Lave et lille snit til højre for midterlinjen i underlivet, lige over hoften.
5. Forlæng snittet ned i benet og forbi ankelleddet.
6. Træk huden og sender en quadriceps muskel forankret til proksimale ende af lårbenet for at blotlægge den forreste side af lårbenet og pin ud fra benet, hvilket placerer stiften i en 45 graders vinkel fra brættet.
7. Med blade af saksen mod den bageste side af lårbenet, skæres hamstrings væk fra knæleddet.
8. Træk huden og forstrækning muskler forankret til proksimale ende af lårbenet til at afsløre den bageste side af lårbenet og pin ud fra benet, placerer stiften i en 45 graders vinkel fra bestyrelsen.
9. Med tangen, holde den distale ende af lårbenet, lige over knæleddet. Guide bladene på saks på begge sider af lårbensskaftet mod hofteleddet, og pas på ikke at skære i selve lårbenet.
10. Efter at have nået lårbenshovedet, angivet med saksen åbner lidt, vride saksen med toppen kniv af saksen bevæger direkte over lårbenshovedet at forskubbe lårben, og pas på ikke at snap knoglen under lårbenshovedet.
11. Tag fat i toppen af ​​lårbensskaftet med pincet, skæres det bløde væv væk fra femurhovedet at frigøre det fra acetabulum.
12. Træk hele benet knogle, herunderfemur, knæet, og skinneben, op og væk fra kroppen, omhyggeligt bortskære bindevævet og muskler forbinder benet til huden.
13. Overextend ankelleddet og igen bruge saksen i en drejebevægelse at forskubbe den skinneben.
14. Gribe distale ende af skinnebenet, pas på ikke at adskille de sener, træk tibia op og væk fra kroppen og opslagstavlen.
15. Skær eventuelt resterende bindevæv fastgørelse af lang knogle på musen ved knæet.
16. Fjern alle yderligere muskel eller bindevæv fastgjort til lårbenet og skinnebenet.
17. For alle applikationer, der kræver knoglen at forblive intakt (histologi, histomorfometri, biomekanisk testning osv.) Fortsætte med standard in-house-protokoller (som i ^4-7). For at isolere knoglemarv, gå videre til punkt 2.

2. Lang Bone Forberedelse Bone Marrow Isolation

1. Ved hjælp af pincet, tag fat i lårbenet med patella vender væk ennd den proximale ende (lårbenshovedet) ned.
2. Overextend knæleddet og bruge saksen i en drejebevægelse at forskubbe skinneben og lårben.
3. Skær enhver bindevæv holder lårben og skinneben sammen.
4. Brug af pincet, fat femur med den forreste side væk og den proximale ende (lårbenshovedet slut) ned.
5. Guide saksen op lårbensskaftet til kondylerne.
6. roterer forsigtigt saksen frem og tilbage for at fjerne kondyler, patella, og epifysen at eksponere metafysen.
7. Fjerne eventuelle yderligere muskel eller bindevæv fastgjort til lårbenet med pincet, sakse, og Kimwipes.
8. Under anvendelse tangen, fat tibia med den forreste side væk og den distale ende (ankel slut) ned.
9. Hvis tibial epiphysis er intakt, guide saksen op skinnebenet aksel til kondyler.
10. Drej forsigtigt saksen frem og tilbage for at fjerne kondyler og epiphysis at eksponere metaphysis.
11. Fjerne eventuelle yderligere muskel eller bindevæv fastgjort til tibia med pincet, sakse, og Kimwipes.

3. Bone Marrow Isolering

1. Skubbe en 18 G nål gennem bunden af ​​en 0,5 ml mikrocentrifugerør.
2. Placer de lange knogler (maks 2 lårben og 2 tibia) i røret, knæ-ende nedad ende ned og luk låget.
3. Nest 0,5 ml mikrocentrifugerør i en 1,5 ml mikrocentrifugerør.
4. Centrifuger indlejrede rør ved ≥10,000 xg i en mikrocentrifuge i 15 sek.
5. Kontrollere, at knoglemarven er blevet spundet ud af knoglerne ved visuel inspektion. Knoglerne skal vises hvide og der bør være en stor visuel pellet i større rør.
6. Kassér 0,5 ml mikrocentrifugerør i knoglerne.
7. Suspender knoglemarven i passende opløsning (f.eks PBS, dyrkningsmedier FACS-buffer) og fortsæt med eksperimentelle protokol (DNA, RNA, protein eller isolation,FACS-analyse, eller primær celle kultur).

Representative Results

Den her beskrevne protokol er optimeret til hurtig dissektion af muse lårben og skinneben med et minimum af beskadigelse af knoglevævet. Denne teknik er egnet til en række downstream analyser, herunder biomekanik undersøgelser, histomorfometri (figur 1A - B), og histologi (figur 1C) ^4,7. Det repræsentative histomophometric micoCT 3D-rekonstruktion (Figur 1A - B) viser, at både det spongiosaen og kortikal shell opretholdes, der giver mulighed for præcis kvantificering af de standardiserede strukturelle parametre for knoglehistomorfometri, herunder trabekulære tal, tykkelse og afstand; knoglevolumen; og kortikal tykkelse, blandt andre foranstaltninger ^8. Det repræsentative histologiske afsnit viser en H og E farvede formalin-fikseret, og afkalket skinneben (figur 1C). Billedet viser integriteten af ​​både den forkalkede Bén og cellulære knoglemarv til histologisk analyse.

Proceduren knoglemarven isolation bevarer steriliteten af ​​knoglemarven plads, har lav håndtering for at reducere forurening, og kræver ikke skæring af den lange knogle, hvilket reducerer tab af knoglemarv udbytte. Dette knoglemarv er velegnet til mange efterfølgende anvendelser, herunder flowcytometri ⁵ og PCR-analyser. Derudover kan denne procedure anvendes til at isolere knoglemarv til primær cellekultur af knoglemarvsceller, inklusive osteoklaster osteoblaster og figur 2a (B) - ^4,6.

Figur 1. histomorfologisk og histologiske analyser af Mouse Long Bone. Tredimensionale microCT rekonstruktion af en mus skinneben viser (A) den ydre kortikale skal og (B Trong>) trabekulær knogle (skala bar = 0,5 mm). (C) Histologisk H & E farvning af en afkalket og tværsnit tibia (4x). Billeder courtesy of Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. Klik her for at se et større version af dette tal.

Figur 2. Primær Bone Marrow Cell Culture for Differentiering af osteoklaster og osteoblaster. (A) TRAP farvning for flerkernede osteoklaster efter 7 dage i osteoclastogenic medier (4x). (B) Alkalisk phosphatase (lilla farve) for osteoblaster og alizarinrødt (rød farve) plet til mineralisering efter 21 dage i osteogent medier. Billeder udlånt af Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine USA.Iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinboard
Pins
70% Ethanol
Dissection scissors
Dissection forceps
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
16 G needle
1.5 ml Microcentrifuge tube
0.5 ml Microcentrifuge tube
Microcentrifuge