Murine Hind Limb Long Bone Dissection og benmarg Isolation

Protocol

Alle dyr arbeidet ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité i samsvar med anbefalingene som er skissert i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health.

1. Hind Limb Long Bone Dissection

1. Avlive mus i overensstemmelse med institusjonens retningslinjer.
2. Plasser musen i liggende stilling og fest ved å feste alle fire ben gjennom musetredeputer nedenfor ankelleddet.
3. Spray mus med 70% etanol, grundig gjengen bena.
4. Lag et lite snitt til høyre for midtlinjen i nedre del av magen, like over hoften.
5. Utvid snittet nedover beinet og forbi ankelleddet.
6. Trekk tilbake huden og skjær quadriceps muskel forankret til nærmeste enden av femur å avsløre fremre side av femur og pin ut fra beinet, plassere pinnen i en 45 graders vinkel fra brettet.
7. Med blade av saksen mot den bakre side av lårbenet, skjæres hamstrings bort fra kneleddet.
8. Trekk tilbake huden og hasesenemusklene forankret til nærmeste enden av femur å avsløre den bakre side av femur og pin ut fra benet, plassere pinnen i en 45-graders vinkel fra brettet.
9. Med pinsett, holder den distale ende av lårbenet, like over kneleddet. Guide bladene på saksen på hver side av femoral akselen mot hofteleddet, være forsiktig med å skjære i femur selv.
10. Etter å ha nådd lårbenshodet, angitt med saksen åpningen litt, vri saksen med toppen blad av saksen bevegelige direkte over lårbenshodet å forrykke femur, være forsiktig med å knipse beinet under lårbenshodet.
11. Ta tak i toppen av femoral akselen med pinsett, kutte bløtvev unna lårbenshodet for å løsne den fra acetabulum.
12. Trekk hele benet bein, inkludertfemur, kne, og tibia, opp og bort fra kroppen, forsiktig bortskjæring av bindevev og muskel som forbinder benet til huden.
13. Overutstrekke ankelleddet og igjen bruke saksen i en vridende bevegelse for å forrykke tibia.
14. Gripe den distale enden av tibia, tar seg ikke å kutte sener, trekke tibia opp og bort fra kroppen og pin bord.
15. Skjær eventuelle gjenværende bindevev feste lange ben til musen ved kneet.
16. Fjern alle ekstra muskel- eller bindevev festet til femur og tibia.
17. For noen applikasjoner som krever bein å være intakt (histologi, histomorfometri, biomekanisk testing, osv.), Fortsetter med standard in-house-protokoller (som i ^4-7). For å isolere benmargen, fortsett til punkt 2.

2. Langt Bone Forberedelse til Bone Marrow Isolation

1. Ved hjelp av pinsett, ta tak i femur med patella vender bort ennd proksimale ende (lårbenshodet) ned.
2. Overutstrekke kneleddet og bruke saks i en vridende bevegelse for å forrykke tibia og femur.
3. Skjær noen bindevev som holder femur og tibia sammen.
4. Ved hjelp av pinsett, ta tak i femur med fremre side vender bort og den proksimale enden (lårbenshodet slutten) ned.
5. Guide saksen opp femoral akselen til kondylene.
6. Forsiktig rotere saksen frem og tilbake for å fjerne kondylene, patella, og den epiphysis å eksponere metafyse.
7. Fjern alle ekstra muskler eller bindevev festet til femur ved hjelp av tang, saks, og Kimwipes.
8. Ved hjelp av pinsett, ta tak i tibia ved fremre side vender bort og den distale enden (ankel ende) ned.
9. Hvis tibial epifysen er intakt, veilede saksen opp tibia akselen til kondylene.
10. Forsiktig rotere saksen frem og tilbake for å fjerne kondylene og epifysen å eksponere metaphysis.
11. Fjern alle ekstra muskler eller bindevev knyttet til tibia ved hjelp av tang, saks, og Kimwipes.

3. Bone Marrow Isolation

1. Presse en 18 G nål gjennom bunnen av et 0,5 ml mikrosentrifugerør.
2. Plasser de lange knokler (maksimalt 2 lårben og to skinneben) inn i røret, kne-end ned ende ned og lukk lokket.
3. Nest 0,5 ml mikrosentrifugerør i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
4. Sentrifuger opplagrede rør på ≥10,000 xg i en mikro for 15 sek.
5. Kontroller at benmargen er skilt ut av knoklene ved visuell inspeksjon. Benene skal vises hvitt og det bør være en stor visuell pellet i det større rør.
6. Kast 0,5 ml mikrosentrifugerør med bein.
7. Heng benmargen i passende løsning (for eksempel PBS, dyrkingsmedier, FACS buffer) og fortsette med forsøksprotokoll (DNA, RNA, eller protein isolasjon,FACS-analyse, eller primær cellekultur).

Representative Results

Protokollen er beskrevet her er optimalisert for hurtig disseksjon av musen femur og tibia med et minimum av skade på benvev. Denne teknikk er egnet for en rekke nedstrøms analyser, inkludert Biomekanikk studier, histomorfometri (figur 1 A - B), og histologi (figur 1C) ^4,7. Den representative histomophometric micoCT 3D rekonstruksjon (figur 1 A - B) demonstrerer at både porøst ben og kortikale skall opprettholdes som gir mulighet for nøyaktig kvantifisering av de standardiserte konstruksjonsparametre for benhistomorfometri, inkludert trabekulært antall, tykkelse og avstanden; bein volum; og kortikal tykkelse, blant annet ved ^8. Representanten histologisk snitt viser en H & E beiset formalinfiksert og decalcified tibia (figur 1C). Bildet viser integriteten både forkalket ben og mobilnettet benmarg for histologisk analyse.

Benmargen isoleringsprosedyren bevarer sterilitet i beinmargen plass, har lav håndtering for å redusere forurensning, og krever ikke kutting av lange bein, og dermed redusere tap av beinmargen yield. Dette benmargen er egnet til mange nedstrøms applikasjoner, inkludert flowcytometri ⁵ og PCR-analyser. Dessuten kan denne fremgangsmåten brukes til å isolere benmarg for primær cellekultur av benmargceller, inkludert osteoklaster og osteoblaster (Figur 2A - B) ^4,6.

Figur 1. Histomorphological og Histologiske Analyser av Mouse Long Bone. Tredimensjonal microCT rekonstruksjon av en mus tibia viser (A) den ytre kortikale shell og (B trong>) trabekulært ben (skala bar = 0.5 mm). (C) Histologisk H & E flekken av en decalcified og seksjonert tibia (4x). Bilder gjengitt med tillatelse av Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 Primær Bone Marrow Cell Kultur for Differensiering av osteoklaster og Osteoblaster. (A) TRAP farging for multinucleated osteoklaster etter 7 dager i osteoclastogenic media (4x). (B) alkalisk fosfatase (lilla farge) for osteoblaster og Alizarin rød (rød farge) flekken for mineralisering etter 21 dager i osteogene media. Bilder gjengitt med tillatelse av Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg «target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinboard
Pins
70% Ethanol
Dissection scissors
Dissection forceps
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
16 G needle
1.5 ml Microcentrifuge tube
0.5 ml Microcentrifuge tube
Microcentrifuge