Summary
Denne artikel præsenterer en praktisk og hurtig metode til at visualisere forskellige neuronal cellepopulationer i centralnervesystemet af Xenopus embryoer hjælp immunfluorescensfarvning på sektioner.
Introduction
I hvirveldyr, udvikling af centralnervesystemet omfatter flere markante endnu konsekutive faser. Det første trin er neural induktion, når naive ektodermale celler er specificeret mod en neural skæbne snarere end en epidermal skæbne. Adskillige indbyrdes forbundne reguleringsmekanismer er involveret i denne fase i Xenopus og andre modelsystemer 1,2. Denne proces er primært koordineres af udskilte faktorer produceret af den underliggende mesoderm, såsom Chordin, noggin, og follistatin 3-7. Efter neural induktion, en delmængde af neurale stamceller forlade cellecyklen og begynder at differentiere i en proces, der betegnes primær neurogenese. Ikke alle neuronale precursorer differentiere på dette tidspunkt. De resterende neurale precursorceller fortsat formere sig, og dermed bevare den stamcelle pool nødvendig for fortsat vækst af centralnervesystemet i hele udviklingen og ind i voksenalderen.
Disse pRoliferating neurale precursorceller er kendetegnet ved deres ekspression af SRY (køn bestemmende region Y) -boks 3 (sox3) -gen 8-11. Den anden population af celler, som exit cellecyklus og forpligte sig til en differentieret skæbne, identificeres ved ekspression af differentiering genmarkører, tubulin, beta 2B klasse IIb (tubb2b, N-kar) og myelin transskription faktor 1 (myt1) 12-14. Sådanne differentierede neuronale celler vinder give anledning til forskellige kategorier af neuroner, herunder, men ikke begrænset til, motor, inter- og sensoriske neuroner placeret i særskilte områder inden neuralrøret 15-17.
Mens betydelig indsats er blevet afsat til at afdække de regulatoriske mekanismer, der styrer mønster og skæbne bestemme begivenheder i den forreste neuroectoderm, er mindre opmærksomhed foretaget på at undersøge de neurogene begivenheder, der opstår som følge afindledende mønsterdannelse fase. Faktisk signaltransduktion, transskriptionelle forskrifter, samt post-translationelle modifikationer er alle involveret i denne senere tidspunkt, styring af både timing og slægt specifikation under neurogenese 18-20. Yderligere undersøgelser disse mekanismer kræver en pålidelig metode til nemt visualisere og skelne mellem forskellige populationer af neuronale celler. Ovennævnte neurale markører, herunder, Sox3, Myt1, og N-tub, kan tilvejebringe et middel til identifikation af disse forskellige cellepopulationer, hvilket giver det nødvendige fundament til at afsløre de underliggende mekanismer af neuronal differentiering 21-23.
Selv differentiel mærkning af neuronale cellepopulationer er blevet påvist i andre modelorganismer, har relativt få undersøgelser udnyttes Xenopus systemet til sin fulde i denne henseende. Dette skyldes hovedsagelig en mangel på kompatible antistoffer, som pålideligt identificere de forskellige NEUROnal cellepopulationer i neuralrøret. Her beskriver vi en metode til at visualisere neuronal differentiering i tidlige Xenopus embryoner via immunfarvning, hvilket giver en robust og bekvem fremgangsmåde til undersøgelse af primær neurogenese i Xenopus. Denne protokol bør give tilstrækkelig vejledning for forskere interesseret i den tidlige udvikling af Xenopus centralnervesystemet mellem stadie 26 og scene 45.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt fra University of Manchester Animal Welfare Centre og var omfattet af en britiske indenrigsministerium Project License.
1. Indsamling og Fiksering af Xenopus embryoer
- Forbered reagenser og materialer til eksperimenter.
- Forbered 10x Marc Modified Ringers (MMR) ved opløsning 56,5 g NaCI i ca. 800 ml ultrarent vand og tilsætning stamopløsninger af 1 M KCI, 1 M MgSO4, 1 M CaCl2 og 1 M HEPES, pH 7,4 til opnåelse af en slutkoncentration 20 mM KCI, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl2, 50 mM HEPES. Indstil pH til 7,4 med 10 M NaOH og derefter det endelige rumfang justeres til 1 L.
- Steriliser 10x MMR opløsningen ved autoklavering ved 121 ° C i 20 minutter på en flydende cyklus. Ved hjælp, fortynd med Hedeselskabet 2 O til 0,1x slutkoncentration, og der tilsættes 20 mg / l gentamycin at inhibere mikrobiel vækst.
- Gør 10x TBS-opløsning ved at blande 24 g Tris-HCI, 5,6 g Tris-base, 88 g NaCl og opløsning i ca. 900 ml ultrarent vand. Den endelige opløsning har en pH-værdi omkring 7,6. Juster med enten 10 M NaOH eller koncentreret HCI til opnåelse af en endelig pH på 7,6 og slutvolumenet til 1 L.
- Ved hjælp, gør 1x TBS ved at fortynde 1 del 10x TBS-opløsning med 9 dele ultrarent vand.
- Gør 10x MEM Salt ved opløsning 209,2 g MOPS i ca. 800 ml ultrarent vand og tilsætning stamopløsninger af 0,5 M EGTA og 1 M MgSO4 til opnåelse af en slutkoncentration på 20 mM EGTA, 10 mM MgSO4. Indstil pH til 7,4 med 10 M NaOH og derefter det endelige rumfang justeres til 1 L.
- Steriliser MEM saltopløsningen ved autoklavering ved 121 ° C i 20 minutter på en flydende cyklus (opløsningen kan blive gul med nogle få måneders opbevaring ved stuetemperatur eller efter den er blevet autoklaveret, men denne ændring i farve påvirker ikke dets anvendelse ). Dog skal du ikke bruge løsningen efter længere tids opbevaring (mere end 6 måneder).
- Make 1x MEMFA-opløsning ved at fortynde 1 del MEM Salte, 1 del 37% formaldehyd med 8 dele ultrarent vand (volumen / volumen, stabile ved 4 ° C i mindst 1-2 uger).
- Forbered 4% paraformaldehyd i TBS (til efterfølgende farvning involverer phalloidin) ved opløsning af 4 g paraformaldehyd pulver i 100 ml 1x TBS-opløsning opvarmes opløsningen til 60 ° C og tilsæt et par dråber 10 M NaOH for at hjælpe opløsning. Portion i 5-10 ml volumen og fryse i -20 ° C. Må ikke nedfryses igen, når optøet.
ADVARSEL: Paraformaldehyd pulver er et irritationsmoment, og er giftigt ved indånding, og dermed vejningen trin skal udføres i et stinkskab. - Mærk så mange 4 ml hætteglas med skruelåg forud for prøvetagning.
- Forbered 15% gelatine / 15% saccharose ved at hælde 20 ml 40% fiskegelatine (præ-varme i en 50 ° C vandbad) i et 50 ml centrifugerør. Tilføj 8 g saccharose og fylde røret til 50 ml linje med 1x TBS.
- Placer gelatine røret på en roterende mixer eller rullende sengat blande natten over ved stuetemperatur. Denne gelatine opløsning er stabil ved 4 ° C i 1 uge. Brug ikke udløbet løsning og ikke fryse-tø.
- Forberede og Fix X. laevis eller X. tropicalis Embryoner Cultured til ønskede Stages.
- Kultur det befrugtede X. laevis eller X. tropicalis embryoner i 0,1x MMR med gentamycin, indtil de ønskede trin.
BEMÆRK: Generelt indsamle embryoner mellem trin 23 og 40. Senere samling af embryoner efter etape 40 er muligt, især når observere axonal vækst fra rygmarven, men husk på, der kan kræves yderligere gelatine penetration tid. Embryonerne kan være vild-type, transgene, mutant, inhibitor-behandlede, morpholino (MO) -injiceret, eller elektroporeret 23,24. - Saml 20-50 embryoner i hver 4 ml hætteglas, fjerne så meget medie som muligt og erstatte med MEMFA.
BEMÆRK: Hvis efterfølgende farvning involverer phalloidin, bruge 4% paraformaldehydi stedet for MEMFA siden kommercielle leveret formaldehydopløsninger sædvanligvis indeholde op til 10% methanol som stabilisator, der vil forstyrre phalloidin-farvning. - Fix natten over ved 4 ° C eller, hvis der i en hastende ved stuetemperatur i 2 timer på en roterende blander. Embryonerne vil være stabil i fiksering opløsning i mindst 1 uge ved 4 ° C.
- Efter fiksering vaskes embryonerne 3 gange i 20 min ved anvendelse 1x TBS med 0,05% Triton X-100. Efter den sidste vask, fjerne så meget TBS-Triton som muligt, og der tilsættes 3 ml 15% gelatine / 15% saccharose i hvert hætteglas.
- Placer hætteglassene på en rullebane natten over ved stuetemperatur. For embryoner ældre end stadie 40, bruger mindst 24 timer af penetration tid. Efter penetration, gå straks til afsnit 2.2 på den næste dag.
- Kultur det befrugtede X. laevis eller X. tropicalis embryoner i 0,1x MMR med gentamycin, indtil de ønskede trin.
2. Montering og Cryosectioning af Xenopus embryoer
- Forbered reagenser og materialer til eksperimenter.
- Tag en kasse med positivt charged dias, ideelt uåbnet.
BEMÆRK: Hvis åbnet, holde objektglassene i en tør tilstand (såsom en tør kasse) og brug inden for 1 måned for at sikre den statiske ladning på objektglassene opretholdes. Brug ikke udløbne slides, da prøver vil falde i løbet af immunfarvning. - Pre-chill kryostatkammeret til -30 ° C. Indstil instrumentets parametre som -35 ° C i mikrotom og 12 um sektion tykkelse. Installer tykt dække glasplade på scenen og lad kryostat ligevægt i mindst 30 minutter før afsnit starter.
- Forbered maleri pensler til at flytte afsnit strimler, holde inde i kryostatkammeret.
- Forbered blyanter til at skrive på dias, sætte dem ved stuetemperatur.
- Brug handsker under kryosektion. Brug ikke bare hænder.
- Tag en kasse med positivt charged dias, ideelt uåbnet.
- Montering Xenopus Embryoner
- aspirere omhyggeligt 5-10 embryoner ud af hætteglas ved anvendelse af en plast eller glas pipette uden at introducere luftbobler. Overfør embryoner itil montage kammer og observere under en Stereoskopet. Fyld op monterings kammer med gelatineopløsning at sikre stivheden af sektionen blok.
- Arranger embryoner som pr figur 1 ved hjælp af et par fine-tip pincet. Markere orienteringen af hoveder ved at tegne en pil på kanten af kammeret ved anvendelse af en kryogen-kompatibel markør. For multiple grupper af embryoner, nedskrive beskrivelse af alle grupper på randen af den tilsvarende kammer samt.
- Placer forsigtigt kammeret vandret i en skum boks halvt fyldt med tøris og luk låget. Vær opmærksom på at montere kammer fryse i 5-10 min. Proces hvert kammer serielt (dvs. placere forrige kammer på tøris før du fortsætter til den næste), da dette vil efterlade tilstrækkelig tid til hvert kammer til at fryse og forhindre tøris boksen bliver overfyldte.
BEMÆRK: Frosne montering kamre behøver ikke at stå horisontalt og kan stables op inde i boksen. - Fortsæt med cryosectioning eller, hvis det kræves, opbevare frosne prøver ved -80 ° C i mindst 1-2 uger uden at miste immunogenicitet.
- Kryosektion af Monteret Xenopus embryoer
- Fjern en frossen prøveblok fra kammeret ved at trykke på bunden af kammeret ved hjælp af en stump pind (såsom en blyant).
- Tilsættes nogle dråber tissue-frysemedium, (en polyethylenglycol og polyvinylalkohol-holdige medium) ned på prøven bedrift disken og montere prøveblokken med den forreste ende af embryonerne peger op (figur 2). Tillad mounted- blok stå inde i kryostatkammeret i ca. 1 min eller indtil vævet-frysemedium bliver uigennemsigtig.
- installere straks prøven bedrift disk mikrotomen med undersiden af prøveblokken opad. Skær en del af prøveblokken ved anvendelse af en kniv, når prøveblokken er stadig relativt "bløde" at reducere længden af hver sektion(Om ønsket). Lad prøven bedriften disken på den mikrotom i mindst 5 minutter for at tillade dens temperatur at nå ligevægt.
- Gradvist trimme prøven blok ned, indtil lederne af haletudser er synlige gennem den gennemsigtige gelatine. For at øge trimning hastighed, anvende en højere indstilling af § tykkelse (f.eks 20-25 uM) (tykkere) på dette tidspunkt (f.eks muliggøre "trimme" option), men ikke for tyk, fordi prøven blok kan falde fra prøven bedriften disken . Observere opfyldelsen af kryostat, såsom skarphed og vinklen af bladet på dette trin for at sikre dannelsen af en lang strimmel af efterfølgende afsnit.
- Når haletudse hoveder bliver synlige, justere indstillingerne for kryostaten tilbage til normal (f.eks 10-12 uM) og rene både mikrotomen og scenen ved hjælp af en pensel. Forsigtigt gøre 2-3 sektioner som et forsøg ved hjælp af håndhjulet indstillingen (brug ikke den motoriserede indstilling) for at sikre, at færdige skiver kan danne strips, ikke overlappende eller stikning til bladet.
- Fortsæt trimning indtil lederne af haletudser næsten eksponerede (dette kan have brug for nogle erfaringer, men opnåelige). Børst eventuelle rest sektioner på scenen og indsamling af prøven sektioner vil begynde.
- Gør cirka 10-15 sektioner og lad dem danne en lang strimmel.
- Flip over tykt dække glasplade til siden og fjern forsigtigt strimlen fra kniven med en fin-spids pensel og arrangere det på scenen med lange akse parallel med klingen.
- Vælg en positivt ladet dias ved stuetemperatur, mærke det med en blyant (som ikke vil vaskes af under efterfølgende farvning behandlinger), trykke det hurtigt, men fast på striben med mærkaten nedad og fjern dias fra kryostatkammeret. Hvis det gøres korrekt, bør strimlen straks holde sig til den positivt ladede dias (figur 3A).
- Gentag dette trin for at have 20-30 skiver på hver glede og anbragt i parallel (figur 3B). Dette er tilstrækkeligt til at dække hele hjernen region X. tropicalis embryoner og de fleste af forhjernen og midthjernen regioner i X. laevis-embryoner.
- Air-tørre slides i 10 min, gå straks eller, opbevare dias i et dias boks ved -80 ° C i mindst 3-6 måneder uden at miste immunogenicitet.
3. immunfarvning af gennemskåret Xenopus embryoer
- Forbered reagenser og materialer til eksperimenter.
- Forbered 0,05% TBS-Triton X-100 ved tilsætning af Triton X-100 i 1x TBS til opnåelse af en slutkoncentration på 0,05%. Denne opløsning er stabil ved stuetemperatur i 3-4 dage. Brug ikke udløbet løsning.
- Forbered 5% varmeinaktiveret gedeserum eller 5% BSA i TBST som blokeringsbuffer. For det første varme-inaktivering af ged / lammeserum ved at placere ca. 20-30 ml serum i en 65 ° C vandbad i 30-60 min. Alikvot i 1,5 ml centrifugerør og fryse i -20 ° C. Ingen re-inaktivering er påkrævet ved brug af.
- Fortynd varmeinaktiveret serum eller BSA i TBST at opnå en endelig koncentration på 5% før brug.
- Udarbejde passende primære antistoffer ifølge fortyndinger i blokerende buffer (f.eks 1: 500 anti-Sox3 10,25 / 1: 250 anti-Myt1 26 / anti-acetyleret tubulin). Brug ca. 100 ul antistof løsning på hvert dias.
- Udarbejde passende fluorescerende antistoffer (fx anti-mus / kanin rød fluorescerende farvestof-konjugerede antistoffer) i blokerende buffer (sædvanligvis 1: 500).
- (Valgfrit) Tilføj rødt fluorescerende farvestof-konjugeret Phalloidin (1: 500) i sekundært antistof mix at afsløre actin netværk.
- (Valgfrit) Tilføj DAPI (0,5 ug / ml endelig koncentration) i sekundært antistof mix at visualisere nukleare lokalisering.
- Tag den anti-fade montering medium ud af fryseren og tø i rum-temperatur vandbad.
- immunfarvning
- Fjern de frosne slides fra -80 ° C og læg dem på et stykke håndklæde papir inde i en emhætte i mindst 1 time for at eliminere eventuelle kondenserede vanddråber, derefter bage de tørrede slides på en 85-90 ° C varme blok med skiver opad i 15 minutter for at aktivere adhæsionsmekanisme. Endelig vil objektglassene køle ned til stuetemperatur (mindst 10 minutter).
- Fyld farvningen krukke med ren acetone og inkuber objektglassene i acetone i 10 minutter til fjernelse fiskegelatine. Hvis flere objektglas skal behandles, arrangere dem på en farvning rack. Air-tørre de behandlede-slides i 15 minutter i en emhætte. Må ikke genbruge acetone.
- trække forsigtigt en ring omkring prøverne på objektglasset ved hjælp af en PAP pen uden at røre prøverne. Sørg for, at ringen er selv-lukket, ellers antistof løsning vil flyde ud under farvning. Fuldt tørre PAP pen ring.
- Fyld en anden farvning krukke med 1x TBS uden Triton X-100. insert de tørrede-glider ind i farvningen krukke og tillade rehydrering i mindst 1 time. I mellemtiden forberede blokeringspuffer ved at fortynde enten varmeinaktiveret gedeserum eller BSA til 5% slutkoncentration hjælp 1x TBS med 0,05% Triton X-100.
- Lav en våd boks ved at placere 1-2 6-brønds plader inde i et klik-lås madkasse og fylde brøndene halvvejs med ultrarent vand. Fjern rehydrerede slides fra farvningen jar og placere dem vandret på plader med 6 brønde (uden pladen låg).
- Derefter tilsættes forsigtigt 300-600 ul blokerende buffer inden i PAP ring. Forsegl våde kasse ved at låse låget på plads og inkuberes ved stuetemperatur i mindst 1 time.
- Fortynd de passende primære antistoffer i blokerende buffer. Generelt bruge 100-150 pi fortyndet antistof opløsning pr dias. Hvis flere dias behandles, opskalere proportionalt.
- Efter blokering forsigtigt fjerne blokerende buffer fra lysbilleder ved aspiration og hurtigt at tilføje primær antistofopløsning at forhindre udtørring og derefter forsegle den våde kasse og inkuberes ved 4 ° C natten over.
- Den næste dag, fjerne det primære antistofopløsning fra objektglassene ved aspiration. Vask objektglassene ved indsættelse i farveskålene fyldt med 1x TBS med 0,05% Triton X-100, 3 gange, 15 minutter hver. I mellemtiden fortyndes passende fluorescerende sekundære antistoffer med blokerende buffer (med eller uden DAPI eller phalloidin).
- Derefter tilsættes forsigtigt 100-150 pi sekundært antistof løsning på dias. Objektglassene anbringes inde i våde boksen og forsegle låget. Glassene inkuberes tildækket i 1-2 timer ved stuetemperatur.
- Vaskes objektglassene i farveskålene fyldt med 1x TBS med 0,05% Triton X-100, 3 gange, 15 minutter hver. Ved den sidste vask tø anti-fade montering medium i en 50 ° C vandbad i 10 min ved opbevaring ved -20 ° C. Køl ned montering medium til stuetemperatur før brug.
- Der tilsættes ca. 20 pi (én dråbe) af monteringsmedium pådias og anvende en stor dækglas (mindst 22 mm x 64 mm) i løbet af prøverne. Overhold med fluorescerende eller konfokalmikroskop inden 6 timer efter montering.
- Hvis imaging ikke kan gøres på samme dag, forsegle dias ved hjælp neglelak og placere dem inde i våde boks ved 4 ° C natten over.
BEMÆRK: anti-fade montering medium vil gradvist blive oxideret efter et par dage (og drej brunlig), så det anbefales at tage billederne så hurtigt som muligt.
- Hvis imaging ikke kan gøres på samme dag, forsegle dias ved hjælp neglelak og placere dem inde i våde boks ved 4 ° C natten over.
Representative Results
De repræsentative resultater viser tværsnit af trin 30 Xenopus embryoner på forskellige niveauer, nemlig forhjernen, midthjernen, baghjerne, og rygmarven, farvet med forskellige antistoffer (figur 4). Som nævnt Sox3-mærket neuronal stamcelle population lokaliserer i nærheden af hulrummet i neuralrøret, mens MyT1-mærket opdelte primære neuroner migrere udad og lokalisere nær den marginale lag (basal lamina) af neuralrøret. Anti-acetyl-tubulin etiketter axoner i differentierede neuroner, der kan observeres i hele neurale rør.
Side-specifikt gen knockdown eller overekspression er en bredt anvendt fremgangsmåde i neurobiologi at vurdere, om modulering af ekspressionen af specifikke gen (er) forstyrrer vækst og differentiering af neuronale celler. I sådanne tilfælde enten morpholinoer (MOS) eller DNA-konstruktionen (er), der bærer pro moter-drevne gen (er) injiceres i en af de to blastomererne på to-celle stadium 23. Alternativt kan de injiceres i hjerneventriklen efterfulgt af elektroporation, som vil resultere i knockdown eller over-ekspression af ønskede gen (er) 27. I begge tilfælde vil virkningen være begrænset til den ene side af embryonet, hvilket gør den modsatte side af embryoet som ubehandlet intern kontrol.
Efter fiksering, sektionering og immunfarvning, er virkningerne af gen knockdown / overekspression kvantificeret ved at tælle og sammenligne celle antal forskellige populationer på begge sider af embryo. Ved at akkumulere disse data fra flere embryoner, kan udføres statistisk analyse. I vores repræsentative resultater, blev ingen forstyrrelse foretaget i embryonerne. Eksempler på gen-forstyrrelse og deres virkninger på forskellige neuronale cellepopulationer kan findes i henvisningerne 20,23.
t "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 1:. Embryo arrangement og orientering i afsnittet formen (A) En tegneserie skildring viser montering forsamling, bemærk bakken er blevet mærket med dato, tidspunkt, og orienteringen af embryoner. (B) Et billede der viser den naturlige udseende montering forsamling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Orienteringen og placering af gelatine blokken på prøven bedriften skiven (A) En tegneserie skildring viser afsnittet blok forsamling, opmærksom på, at fostre er i en "heads up" position, og gelatine blok sidder fast onto prøven bedrift disken ved vævs-frysemedium i bunden (se Figur 2B). (B) Et billede der viser den naturlige udseende af sektionen blok samling, bemærk ophobning af vævet indefrysning medium mellem gelatine blokken og prøven bedriften disken. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: (A) Model af en sektion kammer Kontinuerlig sektionering.. Prøven beholdning disk skal drejes og fastgøres til den position, embryo side vender opad. Efter et par (6-10) sektioner, er det lange stykke af kontinuerlige sektion fliser forsigtigt adskilt fra bladet (blå) med en fin pensel, og derefter vendte 90 ° på bedriften pladen. Så et værelse-temp positivt ladede dias erfast presset på afsnittet stribe nedad og straks løftet op til indsamlede færdige strimler. (B) Normalt kan hver slide rumme 2 parallelle strimler, som vist. Husk at gøre detaljeret registrering på diaset label med blyant. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Tværsnit af fase 30 X. laevis haletudser og farvning i det neurale væv, 20X. (A) Skema angiver de relative positioner (forhjernen, midthjernen, baghjerne, og rygmarv), fra afsnittet fly på Xenopus haletudser. (B) Tilsvarende tværsnit farvet med anti-Sox3 (rød), anti-acetyleret-tubulin (Green), og DAPI (blå), der viser de relative placeringer af neural stamcelle puljer samt neurofilamenter inden neuralrøret. (C) Tilsvarende tværsnit farvet med anti-MyT1 (rød) og DAPI (blå), der viser de relative placeringer af differentierede primære neuroner i neuralrøret. Scale bar = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her demonstrerer vi en bekvem og effektiv metode til at visualisere primære neurogenese i Xenopus embryoer. Denne metode tillader vurdering af forskellige typer af neurale celler, herunder neuronale stamceller og differentierede primære neuroner bruger celle typespecifikke markører.
Protokollen er generelt robust med meget høje reproducerbarhed. For embryoner, der er på forhånd udrugning etaper (dvs. op til fase 28), anbefaler vi manuelt at fjerne vitellinmembranen forud for fiksering, da dette giver embryoner til fuldt ud at uncurl før fiksering. Dette er især vigtigt ved indsamling embryoner ved relativt tidlige faser (før udklækning), da bøjede embryoner er yderst vanskeligt at arrangere på den ønskede orientering inden i monterings kammeret. Vi har ikke oplevet et tab af immunogenicitet efter MEMFA eller PFA fiksering dermed yderligere antigen hentning trin er ikke nødvendigt for denne protokol. Desuden er denneimmunfarvning procedure kan udføres i prøver fra kromogene / fluorescerende in situ-hybridisering. I et sådant scenario, anbefales det at springe protease K trinnet behandling under in situ hybridisering protokol. Efter chromogent / fluorescerende substrat reaktion kan prøverne vaskes med TBS og indlejret i fiskegelatine opløsning på en lignende måde at MEMFA / PFA faste prøver. Prøvehætteglas kan beskyttes mod lys ved indpakning hætteglassene i aluminiumsfolie, hvis fluorescerende in situ hybridisering vil blive afbildet sammen med immunfluorescensfarvning senere.
I nogle tilfælde kan embryoner skrumpe overdrevent efter gelatine penetration. Dette er højst sandsynligt forårsaget af enten utilstrækkelig fiksering eller utilstrækkelig TBS-Triton udvinding. Sørg for, at embryoner rettet i PFA / MEMFA i mindst 2-3 timer eller helst natten over ved 4 ° C. Hvis problemet fortsætter, øge vasketiden af TBS-Triton til 3 i 1 time.
Under cryo-sektionning, kan stivheden af prøveblokken variere som forskellige partier af fiskegelatine har forskellige egenskaber. Dette problem kan delvis kompenseres ved indstilling af temperaturen af mikrotomen. En lavere temperatur vil resultere i en "hårdere" prøveblok dog under overdreven lav temperatur prøveblokken bliver sprød og vanskelig at sektionen. Nogle finjustering eller praksis (ved hjælp af mock sample blokke uden embryoner) før hver sektionering kan være gavnligt før brug på særligt værdifulde prøver.
Et almindeligt stødt problem under sektionering er de tynde sektioner tider tendens til at holde på den tykke glasplade snarere end bo fladt på stål scenen. Dette kan være særligt forstyrrende, da det hele tiden afbryder den kontinuerlige skæreproces. Sådanne tilfælde er normalt forårsaget af en af to grunde: afsnittet kammer og (især) tyk glasplade ikke være kold nok, eller overdreven statisk ladning på maskinen og operator, især i tørt vejr. Førstnævnte kan løses ved at skrue ned for temperaturen af sektionen kammeret og forlader glaspladen inden for ekstra tid (muligvis natten over); og sidstnævnte ved korrekt jordforbindelse kryostaten. Tilslutning af metaloverfladen af kryostaten til et metal hane eller lignende vand rørsystem lavet af metal kan være en alternativ måde at frigive de statiske ladninger. Efter hver brug skal tyk glasplade vaskes godt med ikke-korroderende detergent (såsom opvaskemiddel), skyllet med ultrarent vand, sprøjtes med ren ethanol, og pakket ind i håndklæde papir for at beskytte overfladen og kanterne ved skadelig.
De er anført i protokol antistoffer er generelt specifikke og vi sjældent støder uspecifik adsorption eller høj baggrund signal. Det skal bemærkes, at hvis hjælp varmeinaktiveret ged / lammeserum som blokerende middel, stærk varme-inaktivering (som visualiseret ved dannelsen af fluffy fældningsmiddel i serum) børundgås, da dette præcipitant er meget attraktiv for sekundære antistoffer og kan bidrage til en kilde med høj baggrund.
Det er muligt, og undertiden ønsket at udføre dobbelt-farvning til visualisering forskellige populationer af neuronale celler samtidigt. En sådan dobbelt-farvning er muligt og generelt giver tilfredsstillende resultater med følgende kombinationer: Sox3 / N-badekar eller Myt1 / N-badekar. Imidlertid er dobbelt-farvning af Sox3 og Myt1 kompliceres af, at de to antistoffer er begge fra kanin oprindelse. Vi har testet en række antistof direkte kits mærkning, men ingen tilfredsstillende resultater blev observeret (lavt signal-støj-niveau), muligvis på grund af manglende signal forstærkning fra sekundære antistoffer. En mulig fremgangsmåde til at omgå dette problem ville være at øge transgene linjer i Xenopus, som diskuteret nedenfor.
En af de vigtigste begrænsninger af denne protokol er, at mens denne protokol kunne tilstrækkeligt distinguish to vigtigste puljer af neuronale celler, nemlig Sox3-udtrykkende neural stamcelle pool og Myt1-udtrykkende differentierede neuroner, det mangler evnen til at afsløre forskellige subpopulationer af differentierede neuroner. Sådanne subpopulationer, som herunder, men ikke begrænset til, primære motoriske neuroner, interneuroner og sensoriske neuroner, er normalt kendetegnet ved deres differentielt udtrykte markørgener 28-30. Som nævnt ovenfor kan de seneste fremskridt i udviklingen af flerfarvet in situ hybridisering kombineret med antistof-baserede immunfluorescenspåvisningen metode i Xenopus embryoer udfylde hullet for at afsløre disse under-populationer af differentierede neuroner for potentiel undersøgelse 31. Alternativt, som er blevet påvist i mus model, vil det også være ønsket at rejse en mere omfattende sæt af celletype-specifikke antistoffer til at skelne sådanne forskellige cellepopulationer i Xenopus.
det erogså værd at nævne, at som et tillæg til denne metode, seneste fremskridt i optisk billeddannelse og billedanalyse, såsom multifoton mikroskopi, 3D-rekonstruktion, og segmentering, kan også anvendes efter indledende vurderinger til at opnå mere omfattende observationer af Xenopus oocytter samt tidlige embryoner, især under en live indstilling 32,33. Derfor, for at spore proliferation, differentiering, og flytning af neuronale celler i levende dyr, det ville være ønskeligt at etablere en eller flere transgene linjer, der huser fluorescerende proteiner drevet af celletype-specifik promotor for at tillade levende observation af sådanne cellepopulationer i begyndelsen Xenopus embryoner. Etableringen af et X. laevis linje med neuro-specifikke β-tubulin-promotor kørsel tauGFP og dens applikationer har givet en flot eksempel 23,34. Med de fulde promotorsekvenser både sox3 og myt1 kendetegnet ved hvirveldyr 35-37, er det shOuld være forholdsvis let at etablere yderligere transgene linjer i Xenopus som bør bidrage udstrakt grad til både Xenopus samfund og en mere generel felt af primær neurogenese forskning.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker professor Michael Klymkowsky i University of Colorado i Boulder og Prof. Nancy Papalopulu i University of Manchester for venligt at give anti-Sox3 og anti-Myt1 antistoffer hhv. Vi takker medlemmerne af Papalopulu laboratorium for deres indsigtsfulde forslag i at udvikle denne protokol. Dette arbejde blev støttet af to Healing Foundation stipendier til SZ og JL, to projekttilskud fra Healing Foundation til SZ / EA og JL / EA henholdsvis ét program bevilling fra Wellcome Trust til EA (WT082450MA), og en institutionel strategisk Support tilskud fra Wellcome Trust [097.820 / Z / 11 / Z].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| 37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
| Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
| Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
| Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Gloves | |||
| Dry Ice | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 85-90 °C Heat block | |||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Acetone, analytical grade | |||
| Staining jar with slide racks | |||
| Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
| anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
| Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
| Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |
References
- De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
- Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Dev Cell. 6, 167-181 (2004).
- Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise. Cell. 88, 13-17 (1997).
- Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus. Cell. 77, 273-281 (1994).
- Fainsod, A., et al. The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4. Mech Dev. 63, 39-50 (1997).
- Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86, 589-598 (1996).
- Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4. Cell. 86, 599-606 (1996).
- Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages. Gene. 188, 101-107 (1997).
- Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives. Mech Dev. 126, 42-55 (2009).
- Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation. Development. 130, 5609-5624 (2003).
- Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis. Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).
- Bellefroid, E. J., et al. X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation. Cell. 87, 1191-1202 (1996).
- Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period. J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).
- Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization. Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).
- Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta. Nature. 375, 761-766 (1995).
- Roberts, A. Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates. Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).
- Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
- Hirabayashi, Y., et al. The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells. Development. 131, 2791-2801 (2004).
- Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors. J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).
- Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop. Cell Rep. 2, 10-18 (2012).
- Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis. Dev Cell. 20, 19-32 (2011).
- Munoz, R., et al. Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells. Dev Biol. , (2015).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development. Development. 141, 4794-4805 (2014).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8, e79469 (2013).
- Wang, T. W., et al. Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones. J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).
- Sabherwal, N., et al. The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis. Development. 136, 2767-2777 (2009).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).
- Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain. Brain Res. 1239, 92-99 (2008).
- Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis. J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).
- Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus. Dev Biol. 362, 65-75 (2012).
- Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections. Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).
- Canaria, C. A., Lansford, R. Advanced optical imaging in living embryos. Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138, 5451-5458 (2011).
- Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity. Gene. 344, 287-297 (2005).
- Wang, S., et al. Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation. Dev Biol. 317, 531-540 (2008).
- Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo. Dev Biol. , 307-319 (2008).
