Abstract
Todo el montaje hibridación in situ (WMISH) es una técnica que permite la resolución espacial de las moléculas de ácido nucleico (a menudo ARNm) dentro de una preparación de tejido "todo monte ', o etapa de desarrollo (tal como un embrión o larva) de interés. WMISH es extremadamente potente, ya que puede contribuir de manera significativa a la caracterización funcional de los metazoos genomas complejos, un reto que se está convirtiendo en un cuello de botella con el diluvio de datos de secuencias de próxima generación. A pesar de la simplicidad conceptual de la técnica mucho tiempo es a menudo necesaria para optimizar los distintos parámetros inherentes a los experimentos WMISH para nuevos sistemas de modelo; diferencias sutiles en las propiedades celulares y bioquímicas entre tipos de tejidos y etapas del desarrollo significa que un único método WMISH puede no ser apropiada para todas las situaciones. Hemos desarrollado una serie de métodos para WMISH las reemergentes modelo gasterópodo Lymnaea stagnalis que generan consistente yseñales WMISH claras para una gama de genes, y en todas las etapas de desarrollo. Estos métodos incluyen la asignación de las larvas de la edad cronológica desconocido a una ventana ontogénica, la eliminación eficiente de los embriones y larvas de sus cápsulas de huevos, la aplicación de un tratamiento de proteinasa-K apropiado para cada ventana ontogénica, y la hibridación, después de la hibridación y la inmunodetección pasos. Estos métodos proporcionan un fundamento a partir del cual la señal resultante de una transcripción de ARN dada puede ser refinado con ajustes específicos de la sonda (sonda principalmente la concentración y la temperatura de hibridación).
Introduction
Los moluscos son un grupo de animales que mantienen el interés de una amplia diversidad de disciplinas científicas. A pesar de su diversidad morfológica 1, la riqueza de especies (en segundo lugar solamente a los artrópodos en términos de número de especies 2) y relevancia para una amplia gama de comerciales 3, 4 médicos y científicos cuestiones 5-8, hay relativamente pocas especies de moluscos que puede presumir de ser ambos modelos científicos bien equipados y fácil de mantener en un entorno de laboratorio. Uno de moluscos que se utiliza mucho por disciplinas como la neurobiología 9, 10 ecotoxicología y más recientemente la biología evolutiva 11,12, es Lymnaea stagnalis, sobre todo debido a su amplia distribución y la extrema facilidad de mantenimiento. A pesar de su popularidad como un organismo "modelo" y su larga historia de uso por los biólogos del desarrollo 13-19, el alcance y la potencia de las herramientas moleculares disponibles para el L. StAGNalis comunidad científica se encuentra muy por detrás de la de los modelos más tradicionales de origen animal (Drosophila, el ratón, el erizo de mar, nematodos).
Nuestro deseo de desarrollar Lymnaea como un modelo molecular se debe a un interés en los mecanismos moleculares que guían la formación de la cáscara. Esto nos ha motivado para filtrar un conjunto de técnicas que permitan la visualización eficiente, consistente y sensible de la expresión génica durante el desarrollo de Lymnaea 's. Todo el montaje hibridación in situ (WMISH) se emplea extensamente para una variedad de organismos modelo y ha estado en uso durante más de 40 años 20. En sus diferentes aspectos, ISH puede emplearse para localizar espacialmente loci específicos en los cromosomas, rRNA, mRNA y micro-ARN.
Uno de los retos que se necesita para responder antes de perfeccionar un método para L. WMISH stagnalis fue el tema de la extracción con suavidad y eficacia embriones y larvas para distintas etapas de tél cápsulas de huevos en los que se depositan. Esta extracción, o 'decapsulación', que se debe lograr de manera eficiente con el fin de recoger el material adecuado para un determinado experimento in situ, mientras que al mismo tiempo mantener la integridad morfológica y celular. Mientras que otros organismos modelo también se someten a desarrollo encapsulado, en nuestras manos ninguno de los métodos informados para aquellas especies podría emplear con éxito en L. stagnalis.
Los objetivos generales de este método son, por lo tanto: para extraer L. stagnalis embriones y larvas de sus cápsulas en una forma de alto rendimiento, que se aplican tratamientos de pre-hibridación que optimizan la señal WMISH, para preparar embriones y larvas con WMISHsignals satisfactorios para la formación de imágenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Los siguientes pasos se describe nuestro método para llevar a cabo un experimento in situ en las fases embrionarias y las larvas de L. stagnalis. Cuando un paso implica el uso de un producto químico peligroso esto se indica mediante la palabra "PRECAUCIÓN" y todos los procedimientos de seguridad adecuados debe ser adoptada. Los enlaces a las hojas MSDS representativos de los productos químicos peligrosos están dentro de Archivo 1. Recetas para todos los reactivos están dentro del archivo complementaria 2.
1. Montaje de Decapsulation Aparato
- Para ello, conectar una jeringa desechable ml 20 a un tubo de silicio (con un diámetro interior de 1 mm y un diámetro exterior de 3 mm) utilizando un corte de punta P1,000 a una longitud adecuada como se muestra en la Figura 2A.
- Cinta de un portaobjetos de microscopio estándar a una placa de Petri grande invertida. Tape el tubo de silicona inmediatamente adyacente al portaobjetos de microscopio como se muestra en la figura60; 2C y 2D.
- Descansar un aguja de vidrio tirado en el portaobjetos de un microscopio y suavemente insertarlo en el tubo de silicona hasta que la punta de la aguja sobresale aproximadamente el 20% del camino a través del diámetro interior del tubo (véase la Figura 2C y 2D). Una vez que la aguja está en posición de la cinta hacia abajo a la placa de Petri.
- Deje que el extremo libre del tubo de silicona para descansar en otra placa de Petri que recogerá el material decapsulado.
2. Recolección de muestras, fijación y Decapsulation
NOTA: Todos los pasos se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.
- Recoger con cuidado cadenas de huevo de las paredes de un acuario. Para ello, utilice una pieza plana de plástico flexible, como una espátula para raspar la cadena de huevo del sustrato, y el uso de un colador de té de plástico para pescar la cadena de huevo flotando fuera del agua. Escenario y clasificar el material bajo un microscopio utilizando la guía proporcionada en la figura1.
- Coloque la cadena de huevo sobre una toalla de papel y hacer una incisión longitudinal a lo largo de la masa de huevos usando las pinzas de peso pluma. Rollo de las cápsulas de huevos fuera de la cadena de huevo y eliminar la mayor cantidad del material gelatinoso como sea posible de cada cápsula empujándolos alrededor de la toalla de papel utilizando las pinzas de peso pluma.
- El uso de las pinzas de peso pluma, transferir las cápsulas de huevos en una placa de Petri que contiene 5 ml de agua del grifo. Continuar para recoger cápsulas de huevos de-gelatina de las etapas de desarrollo deseados en este plato. Recoger suficientes cápsulas de todas las etapas de desarrollo para el experimento WMISH previsto a continuación, proceder al siguiente paso.
- Cuando se trabaja con larvas más desarrolladas (5 días después de la primera división (CPFD) y mayores) anestesiar a ellos antes de la fijación.
NOTA: Esto evitará que los músculos se contraigan lo que hace que la interpretación de los patrones de tinción in situ en muy difíciles.- Relax larvas (mientras que todavía están en su capsules) en una solución de 2% w / v de MgCl 2 • 6H 2 O durante 30 min antes de la fijación.
- Evaluar el grado de relajación después de 30 minutos, sumergiendo varios mientras que las larvas todavía en sus cápsulas de huevos en la solución de fijación y el seguimiento de su respuesta bajo un microscopio. Incompletamente larvas relajado se retraerá en sus conchas, mientras que las larvas totalmente relajado no responderá. Una vez que estas larvas se han relajado proceder al siguiente paso.
- Transferir las cápsulas de huevos usando una amplia pipeta de plástico orificio en un tubo sellable que proporciona 10 veces el volumen de cápsulas de huevos (por ejemplo., 1 ml de cápsulas asentado requeriría un tubo 10+ ml).
- Aspirar tanto líquido como sea posible desde el tubo y reemplazarlo con un volumen de solución de fijación que es 10 veces el volumen de las cápsulas de huevos asentadas. Gire suavemente las cápsulas de huevos en fijador a temperatura ambiente durante el tiempo apropiado para cada etapa de desarrollo (ver Figura 1).
- Discontinue la rotación y permitir que las cápsulas se hunden y aspirar la solución de fijación en un recipiente apropiado para desechos.
- Se lavan las cápsulas de huevos mediante la sustitución de la solución de fijación con salina tamponada con fosfato con 0,1% Tween-20 (PBTw) y girando a TA durante 5 min. Aspirar el PBTw y repetir dos veces.
- Eliminar embriones y larvas de sus cápsulas utilizando el aparato (véase la sección 1 para más detalles) se muestra en la Figura 2. Dibuje las cápsulas en la jeringa de 20 ml, conectar el tubo y luego disipar las cápsulas a través de la tubería y más allá de la aguja de vidrio hacia el plato de recogida.
NOTA: Normalmente, la mayoría (> 90%) de todas las cápsulas debe necesitar solamente un paso a través del dispositivo. En muchos casos, la membrana de la cápsula está dañado pero embriones y larvas permanecen dentro de la cápsula rota. Reprocesar este material simplemente su elaboración en la jeringa y disipar nuevo. - Recoger los embriones y larvas decapsulados en un tubo de 1,5 ml usando un micrófonoropipette (a P20 para el 0 - larvas de 3 días, y P200 para las larvas mayores con el extremo de la punta cortados).
NOTA: Una pausa (hasta varios meses) en el protocolo se pueden hacer en esta etapa. Si esto es necesario, el material decapsuled se debe recoger en un tubo de 1.5 ml para el almacenamiento (continuar con el paso siguiente). De lo contrario seguirá inmediatamente al Protocolo 3. - Permitir que los embriones y larvas se hundan a la parte inferior del tubo y aspirar el sobrenadante. Reemplazar con 33% de etanol (EtOH) en PBTw y dejar reposar durante 5 - 10 minutos a. Repetir con 66% de EtOH en PBTw y EtOH al 100%. Lavar las larvas de dos veces en 100% de EtOH a TA. Almacenar el material a -20 ° C en EtOH al 100%.
- Cuando esté listo para continuar, re-hidratar las muestras mediante la eliminación del 100% de EtOH y reemplazar con un 66% de EtOH en PBTw, deje reposar durante 5 - 10 minutos a. Repetir con 33% de EtOH en PBTw, deje reposar durante 5 - 10 minutos a. Finalmente se lava con 3 x 5 min lavados de PBTw para asegurar que todos EtOH se retira.
3. proteinasa-K, TEA y Post-fijación
NOTA: nos encontramos realizando los pasos siguientes en pequeñas cestas con un suelo de malla, el método más eficiente y suave para intercambiar rápidamente soluciones de tiempo crítico. Mientras que éstos se pueden hacer en casa, utilizamos cestas (tamaño mediano) que son compatibles con la manipulación de líquidos robot Intavis InSituPro -Vsi (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Tales cestas pueden ser rápida y fácilmente movidos entre los pocillos de una placa de cultivo tisular bien 12 (TCD) con el fin de soluciones de intercambio, o la solución pueden ser aspiradas desde el pozo utilizando una pipeta. Alternativamente, todos los intercambios de solución se pueden realizar sin estas cestas simplemente aspirar el sobrenadante de las larvas. En este caso un movimiento de remolino suave se concentrará todos los embriones y larvas al centro del plato permite que el sobrenadante a ser retirado del borde del pozo. Lo siguiente asume que el usuario está empleando cestas para el intercambio de soluciones.
- Usando una pipeta, Embriones y larvas de transferencia en una cesta que se sienta en un TCD 12 bien con 2 ml de PBTw.
NOTA:. El número de embriones y / o larvas que se pueden añadir depende de la etapa de desarrollo siendo investigado, sin embargo, una regla general es la de mantener al menos el 25% de la superficie de suelo libre de embriones / larvas (es decir, no hacer saturar la canasta). - Preparar una adyacente bien con 2 ml de la solución de proteinasa-K apropiado (véase la Figura 1), y otro 2 pocillos con 2 ml de 0,2% de glicina cada uno. Mover cada cesta dentro del pozo que contiene la concentración apropiada de la proteinasa-K e iniciar inmediatamente la sincronización.
- Después de 10 min mover cada cesta en un pozo que contiene 0,2% de glicina y se incuba durante 5 min. A continuación, pasar cada cesta en el segundo bien con 0,2% de glicina y se incuba durante 5 min. Lavar la glicina con 3 x 5 min intercambios de 3 ml PBTw.
- Eliminar la solución de PBTw y tratar las muestras una vez con sol recién preparada trietanolamina (TEA)lución durante 5 min PRECAUCIÓN: No agite. Reemplazar con 3 ml de solución de TEA recién preparado durante 5 min. No agite. Aspirar la mayoría de la solución de TEA de las muestras. Añadir la trietanolamina recién preparada con una solución de anhídrido acético (TEAAA) e incubar durante 5 min. PRECAUCIÓN! No agite.
- OPCIONAL - Si bien el paso anterior está incubando, preparar otro lote de solución TEAAA y repita el paso anterior.
NOTA: Este segundo tratamiento con TEAAA es opcional, pero puede ayudar a eliminar por completo todos los antecedentes con sondas con tendencia a la generación de fondo. - Eliminar la solución de TEAAA mediante la aspiración del pozo, y reemplazar con 3 ml de PBTw. No agite. Retire el PBTw y aplicar 3 ml de formaldehído al 3,7% en PBTw. Hacer girar suavemente de vez en cuando durante una incubación de 30 min.
- Retire el fijador mediante la aspiración del pozo, y reemplazar con 3 ml de PBTw. Transferir el material en un tubo de 1,5 ml. REColoque la PBTw con tampón de hibridación y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente - PRECAUCIÓN.
- Colocar los tubos en un bloque caliente a temperatura ambiente, y ajustar la temperatura a la temperatura de hibridación deseada.
NOTA: La temperatura de hibridación es la sonda específica y tendrá que ser optimizado empíricamente, sin embargo, nos encontramos con 55 ° C a ser una buena temperatura al principio de prueba. Deje que el bloque para llegar a la temperatura de hibridación, y permitir que las muestras de pre-hibridan durante aproximadamente 15 minutos (es decir, el tiempo que se necesita para preparar las ribosondas, ya no es necesario). Preparar volúmenes adecuados (normalmente 100 mu l) de las ribosondas diluidas. Nos típicamente concentraciones de sonda de prueba de 100 y 500 ng / ml como un rango inicial. Preparamos ribosondas de acuerdo con la 12. - Retire el tampón de hibridación de las muestras y añadir la sonda en tampón de hibridación a las muestras. Overlay con 100 l (o un volumen adecuado para formar una fase por encima de la buffe hibridaciónr) de aceite mineral.
NOTA: El aceite mineral impide extensa condensación que se forma durante la larga etapa de hibridación. Amplia condensación alterará significativamente tanto la química de la solución de hibridación y la concentración de la sonda. - Desnaturalizar la sonda y el ARN diana mediante el calentamiento de las muestras a 75 ° C durante 10 min, a continuación, reducir el calor a la temperatura de hibridación deseada. Permitir la hibridación de proceder durante un mínimo de 12 horas (O / N) o más largo (24 a 48 h).
- Durante la hibridación eliminar un solo tubo del bloque de calor, girar rápidamente entre el pulgar y el dedo índice de suspender las larvas sin molestar a la fase de aceite, y reemplazarlo en el bloque de calor. Repita esto una vez cada 6 - 12 horas más o menos.
4. Se lava y calientes inmunodetección
NOTA: Mientras se utiliza un robot de manejo de líquidos para los pasos siguientes, éstas también pueden ser fácilmente realizan manualmente. En este caso, los embriones y larvas shoULD se mantendrá en los tubos de 1,5 ml que se hibridan en. Todos los intercambios de soluciones posteriores se aspiran y se añadió con una pipeta P1,000. Cuando se realiza manualmente cada uno de los siguientes pasos se deben emplear 1 ml de cada solución.
- volúmenes adecuados de calor (3 ml cada una para cada muestra) de la 4x, 2x y 1x soluciones de lavado a la temperatura de hibridación.
- Lavar todas las muestras tres veces en tampón de lavado 4x para 15 min cada uno a la temperatura de hibridación. Lavar todas las muestras tres veces en tampón de lavado 2x durante 15 min cada uno a la temperatura de hibridación. Lavar todas las muestras tres veces en tampón de lavado 1x durante 15 minutos cada uno a la temperatura de hibridación.
- Lavar todas las muestras una vez con tampón 1x de cloruro de sodio Citrato de sodio + 0,1% Tween (SSC + 0,1% de Tween) a la temperatura de hibridación. Dejar que las muestras se enfríen a temperatura ambiente.
- Lave todas las muestras dos veces en 1x SSC + 0,1% Tween durante 15 min Reemplazar esta solución SSC 1x con el tampón de ácido maleico (MAB) y dejar reposar durante 10 minutos Repetir el MAB wceniza. Reemplazar el MAB con solución de bloqueo y se incuba durante 1,5 horas.
- Intercambiar la solución de bloques para la solución de anticuerpo (1: 10.000 dilución de anticuerpo en solución de bloqueo) y se incuba durante 12 hr (O / N) a TA con agitación suave.
5. El desarrollo del color y de montaje
- Aspirar la solución de anticuerpo y lavar 15 veces con PBTw de 10 min cada uno. Reemplazar PBTw con 1x tampón de fosfatasa alcalina (AP) y se incuba durante 10 min.
- Mientras que la etapa de incubación superiores a los ingresos, preparar la solución de tinción de AP (ver archivo complementaria 2) - PRECAUCIÓN. Transferir el material en un TCD bien y reemplazar la solución de AP 1x con solución de tinción AP. Tenga en cuenta el tiempo para que la longitud de tiempo que la reacción de color se lleva a cabo para se pueden grabar. Supervisar el desarrollo de el patrón de tinción hasta que la relación de señal a fondo es óptima.
- Para detener el desarrollo del color, eliminar la solución de tinción 1x AP (disponer en el que eras apropiadae contenedor), y aplicar 2 ml de PBTw y tenga en cuenta la hora actual. Enjuague dos veces más con PBTw de 5 min cada uno. Utilice uno de estos enjuagues para transferir el material en un tubo de 1,5 ml.
- Eliminar la PBTw y aplicar 1 ml de 3,7% de formaldehído en PBTw y agitar o girar para menos 30 minutos a temperatura ambiente (esto también se puede hacer O / N).
- Lavar el fijador con 3 lavados de PBT (deseche el fijador de residuos en un recipiente apropiado para desechos). Se lavan las muestras 3 veces a 50 ° C en agua desionizada.
NOTA: Estos lavados eliminan la precipitación de sales que pueden ser visibles durante la limpieza y los pasos de visualización. - Decidir si las muestras se deben montar en benzoato de bencilo: Alcohol bencílico (BB: BA, también conocido como clara de Murray) o glicerol.
NOTA: Preferimos el más poderoso agente de eliminación BB: BA como L. embriones stagnalis son algo opaca. Las muestras que se montan en BB: BA primero tendrá que estar deshidratado a través de una serie de etanol. Las muestras para ser montado en el 60%glicerol se puede montar inmediatamente. - La transferencia de las muestras en la solución de montaje (BB: BA o glicerol al 60%) con una pipeta.
NOTA: Si se monta el BB: BA esto debe hacerse en un vaso bien (BB: BA va a derretir el plástico de policarbonato). - Dejar que las muestras para despejar el 5 - 10 minutos, y luego montarlos en un portaobjetos utilizando un número apropiado de cubreobjetos apilados como espaciadores (1 cubreobjetos para muestras <1, 2 CPFD cubreobjetos para muestras> 1 CPFD).
NOTA: su conjunto se monta ahora se pueden obtener imágenes con un microscopio compuesto con DIC óptica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los patrones de tinción WMISH representativo mostrado en la Figura 3 se generaron utilizando la técnica descrita anteriormente, y reflejan una variedad de patrones de expresión espacial de genes implicados en una serie de procesos moleculares que varían de formación de la cáscara (gen Novel 1, 2, 3 y 4), a la señalización célula-célula (Dpp) para regulación de la transcripción (Brachyury) a través de una gama de etapas de desarrollo. Si bien no hemos cuantificado los niveles de expresión de estos genes que esperamos que también lo harían variar significativamente, lo que indica que nuestro método puede ser aplicado contra una amplia variedad de productos de los genes expresados en todas las etapas de desarrollo en los distintos niveles. Sólo uno de los genes que aquí se presentan (DPP) se ha descrito previamente en L. stagnalis 21,22. Los resultados que presentamos aquí son en gran parte de acuerdo con estos informes anteriores, pero con significativamente mayor reso espacial lución. El patrón de expresión espacial de Brachyury se ha descrito en abulón 23 y lapa 24 y en ambos casos también se detectó en las células del manto encontremos para L. stagnalis (Figura 3F). Se aislaron los genes novedosos de 1 - 4 (de una pantalla proteómico diseñado para identificar productos génicos implicados directamente en la formación de la cáscara, y por lo tanto sus patrones de expresión espacial asociada a la glándula de la cáscara (Figura 3A y B) o el campo de comandos (Figura 3C y D) son completamente congruentes con las funciones que forman el revestimiento. Estos resultados indican que la técnica de alto rendimiento de que hemos desarrollado para la eliminación de los embriones y larvas de la cápsula de huevo, y los tratamientos de permeabilización etapa específica posteriores, generan muestras de todo el montaje que producirán alta calidad en la tinción situ las pautas de una amplia variedad de genes para todas las etapas del desarrollo embrionario y larval.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figura 1. Un Sintético La ontogenia de Lymnaea stagnalis y fijación correspondiente y proteinasa-K tratamientos. Imágenes representativas de los embriones y larvas de los primeros 7 días de desarrollo muestran un aumento significativo en el tamaño (fila 1) y la complejidad morfológica (filas 2 y 3) . Estos cambios en el desarrollo se traducen en grandes diferencias en el tiempo de fijación adecuado y las concentraciones de proteinasa-K que generan señales WMISH óptimos. Para WMISH todas las etapas deben ser fijadas en el 3,7% de formaldehído en PBS a temperatura ambiente con agitación suave dentro de sus cápsulas de huevos. Todas las etapas a continuación, deben ser tratadas con la concentración de proteinasa-K apropiado para 10 min. Tenga en cuenta que se observa una variación significativa entre lotes en la actividad de la proteinasa-K nuestro proveedor. Esta variación debe ser explicada por performing una ronda de calibración '' experimentos WMISH donde la actividad de la nueva proteinasa-K es determinado empíricamente. Por lo tanto, las concentraciones de proteinasa-K indicados en la figura deben ser tratados como una guía inicial, sin embargo, las concentraciones relativas entre las etapas de desarrollo (por ejemplo, embriones de 2 día requieren una concentración de proteinasa-K 3 veces más altos que los días 1 embriones) se establecen. Por favor, clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Los aparatos utilizados para Decapsule L. stagnalis embriones. (A) Una descripción general del aparato que puede eliminar eficazmente L. stagnalis embriones y larvas de sus cápsulas. (b) una vista ampliada deel área amarilla en caja en (A). Una aguja de vidrio fuerte se coloca en el portaobjetos de microscopio y se inserta en el tubo de silicona (diámetro interno 1 mm, diámetro externo de 3 mm) de manera que la punta sobresalga aproximadamente 20% de la forma en la cavidad del tubo. La aguja de vidrio es entonces también con cinta al portaobjetos de microscopio y la placa de Petri. A la vista 'plan esquemático de la sección en caja amarilla en cápsulas de huevo A. contienen embriones y larvas fijos (C) están en primer lugar se separan usando la jeringa de 20 ml. La jeringa se une después a la tubería de silicio y las cápsulas expulsado a través de la tubería y más allá de la aguja. Membranas de las cápsulas de huevos se rompen por la aguja y el material embrionario y larval liberada se pueden recoger en el plato de recogida utilizando una micropipeta. (D) Una vista esquemática 'sección' de la sección en caja amarilla en A. El portaobjetos de microscopio asegura que el aguja entra en el tubo de silicona a la altura correcta.
Figura 3. Imágenes representativas de los patrones de expresión WMISH contra una variedad de genes entre una gama de L. . Etapas del Desarrollo stagnalis generada por el método aquí descrito Todas las etapas de desarrollo se procesaron tal como se describe en el método anterior y se han montado y fotografiado en BB: BA (de Murray claro). edades aproximadas se indican en el quep derecha de cada panel y la orientación se indica en la parte inferior derecha. orthology gen (si se conoce) se indica en la parte inferior izquierda de cada panel. Abreviaturas: glándula de la cáscara (SG); campo de la cáscara (sf); manto (MT); pie (ft); Decapentaplegic (DPP); CPFD (días después de la primera segmentación). Todas las barras de escala son de 20 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El método aquí descrito permite la visualización eficaz de transcritos de ARN con presumiblemente diferentes niveles de expresión dentro de todas las etapas de desarrollo de Lymnaea stagnalis. Para eliminar los embriones y larvas de sus cápsulas que probó una variedad de productos químicos, choque osmótico y tratamientos físicos reportados para otro encapsulated- el desarrollo de organismos modelo. Sin embargo, en nuestras manos el método que describimos aquí es la única técnica de alto rendimiento que elimina la membrana capsular dura sin dañar los embriones y larvas. Después de desencapsulación, el material o bien se puede almacenar, o tratados con un régimen específico etapa de proteinasa-K y después se hibridó con una ribosonda. pueden ser necesarios esfuerzos de optimización empíricos adicionales (que típicamente se enfocan en la concentración de la sonda y la temperatura de hibridación) para cada sonda / diana. Estos parámetros (además de la pauta de fijación y tratamientos proteinasa-K) son típicamente los parámetros más influyentesde cualquier experimento in situ (suponiendo que la calidad del material fija y la sonda de ARN son de un alto nivel).
La importancia de un tratamiento de proteinasa-K apropiado para el resultado final de un experimento in situ es de suma importancia para L. stagnalis. Esto se refleja en la amplia gama de concentraciones de proteinasa-K requeridas por las etapas de desarrollo distintas (que van desde 0 mg / ml a 500 mg / ml). Por tanto, es importante ser capaz de asignar una cadena de huevo dado a una ventana ontogénica. Con este fin, la directriz que proporcionamos en la figura 1 permite la puesta en escena de material de desarrollo de edades desconocidas (una versión para imprimir imprimir de esta figura está disponible en el Archivo suplementario 3 que los usuarios pueden encontrar útil tener en el microscopio cuando puesta en escena de materiales) . Observamos que para otras especies de gasterópodos tratamientos proteinasa-K para WMISH o bien se puede mantener constante para una amplia gama de Developmental etapas 8,25,26, o se puede omitir por completo 27. Esto está en marcado contraste con la situación en L. stagnalis. Además, mientras que otros grupos de investigación han informado anteriormente de los patrones de expresión WMISH por varios genes en L. stagnalis larvas (ver 22,28,29) el método que describimos aquí produce patrones de resolución espacial significativamente mayor. Finalmente, se ha observado una variación significativa entre lotes en la actividad de la proteinasa-K nuestro proveedor. Esta variación debe tenerse en cuenta mediante la realización de una ronda de experimentos WMISH '' de calibración, donde se determina empíricamente la actividad de la nueva proteinasa-K. Todos los experimentos posteriores con alícuotas de la proteinasa-K de ese lote entonces se pueden realizar libremente.
Hemos descrito previamente un método alternativo para WMISH L. stagnalis embriones y larvas de otros lugares 12. Ese método se detalla el uso de la mucolytagente ic N-acetil-L-cisteína (NAC), un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) y un tratamiento de pre-hibridación con dodecil sulfato de sodio (SDS). Encontramos esos tratamientos mejorados los patrones de tinción de algunos genes para algunas etapas de desarrollo. La estrategia de fijación que hemos desarrollado recientemente y describimos aquí (larvas dentro de sus cápsulas de fijación) simplifica y acelera los pasos necesarios para preparar material para un experimento in situ, y al parecer niega la necesidad de determinar empíricamente tratamientos de pre-hibridación óptimas adicionales con NAC, la TDT o SDS. Mejoras futuras a la técnica aquí descrita podría incluir la visualización de los microARN (después de las modificaciones a los protocolos estándar WMISH se informó anteriormente 30), el etiquetado doble o triple de ARNm se dirige a 31, y la visualización de las señales fluorescentes WMISH 32. Podría decirse que la mayor limitación de la técnica es la longitud total de tiempo que se necesita para pasar de colectinag del material, a una imagen digital que representa un patrón de expresión génica dado. Debido a la naturaleza de los eventos bioquímicos y biofísicos que deben tener lugar durante un proceso tal, esta es una característica inherente a la mayoría de los protocolos de hibridación in situ.
Lymnaea ocupa una posición dentro de la Metazoa que es muy poco representadas en términos de organismos modelo. Como representante Spiralian, Lymnaea puede aportar información sobre la evolución de las características morfológicas distintas, tales como la formación de la cápsula 12 y el cuerpo lateralidad 33-35 y es también una valiosa neuroetología 36 y la neurofisiología modelo de 9,37. Técnicas de gran alcance, tales como la capacidad de visualizar de manera eficiente los patrones de expresión génica in situ aumenta la funcionalidad de Lymnaea como organismo modelo, y amplía la variedad de preguntas que puede ser usado para responder. En un momento en que la generación de grandes dat secuenciaasets (transcriptomes completos e incluso genomas) es relativamente de rutina, tales métodos serán más relevantes para los investigadores que deseen interpretar el flujo de datos de secuencias de tales modelos. Mientras Lymnaea es un gasterópodo relativamente derivado 38, y posee lo que se consideraría un genoma grande en comparación con otros organismos modelo (1,22 Gb 39), que tiene muchas características prácticas e interesantes que lo convierten en un sistema modelo atractivo. Los métodos que describimos aquí expanden la caja de herramientas a disposición de Lymnaea y pueden ser de utilidad para otras especies que se someten a encapsulan el desarrollo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos a través de DJJ proyecto DFG # JA2108 / 2-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
| Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
| Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
| Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
| Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
| Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
| Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
| Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
| Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
| Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
| Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
| N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
| Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
| Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
References
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. , Sinauer. Sunderland. (2002).
- Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. , Available from: http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en (2013).
- World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
- Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).
- Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
- Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
- Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).
- Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).
- Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).
- Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15 (1), 19 (2015).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).
- Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).
- Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
- Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183 (1), (1973).
- Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).
- Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35 (1), 29 (1973).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).
- Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).
- Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).
- Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7 (1), 160 (2007).
- Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
- Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. , (2015).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).
- Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
- Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).
- Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).
- Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).
- Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).
- Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).
- Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).
