El objetivo de este protocolo es proporcionar a los usuarios un conjunto de métodos para la desencapsulación de alto rendimiento de embriones y larvas de Lymnaea stagnalis en preparación para la hibridación in situ de montaje completo, y para posteriores tratamientos de pre y post-hibridación.
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En este artículo
Resumen
Resumen
Todo el montaje hibridación in situ (WMISH) es una técnica que permite la resolución espacial de las moléculas de ácido nucleico (a menudo ARNm) dentro de una preparación de tejido "todo monte ', o etapa de desarrollo (tal como un embrión o larva) de interés. WMISH es extremadamente potente, ya que puede contribuir de manera significativa a la caracterización funcional de los metazoos genomas complejos, un reto que se está convirtiendo en un cuello de botella con el diluvio de datos de secuencias de próxima generación. A pesar de la simplicidad conceptual de la técnica mucho tiempo es a menudo necesaria para optimizar los distintos parámetros inherentes a los experimentos WMISH para nuevos sistemas de modelo; diferencias sutiles en las propiedades celulares y bioquímicas entre tipos de tejidos y etapas del desarrollo significa que un único método WMISH puede no ser apropiada para todas las situaciones. Hemos desarrollado una serie de métodos para WMISH las reemergentes modelo gasterópodo Lymnaea stagnalis que generan consistente yseñales WMISH claras para una gama de genes, y en todas las etapas de desarrollo. Estos métodos incluyen la asignación de las larvas de la edad cronológica desconocido a una ventana ontogénica, la eliminación eficiente de los embriones y larvas de sus cápsulas de huevos, la aplicación de un tratamiento de proteinasa-K apropiado para cada ventana ontogénica, y la hibridación, después de la hibridación y la inmunodetección pasos. Estos métodos proporcionan un fundamento a partir del cual la señal resultante de una transcripción de ARN dada puede ser refinado con ajustes específicos de la sonda (sonda principalmente la concentración y la temperatura de hibridación).
Introducción
Los moluscos son un grupo de animales que mantienen el interés de una amplia diversidad de disciplinas científicas. A pesar de su diversidad morfológica 1, la riqueza de especies (en segundo lugar solamente a los artrópodos en términos de número de especies 2) y relevancia para una amplia gama de comerciales 3, 4 médicos y científicos cuestiones 5-8, hay relativamente pocas especies de moluscos que puede presumir de ser ambos modelos científicos bien equipados y fácil de mantener en un entorno de laboratorio. Uno de moluscos que se utiliza mucho por disciplinas como la neurobiología 9, 10 ec....
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Protocolo
NOTA: Los siguientes pasos se describe nuestro método para llevar a cabo un experimento in situ en las fases embrionarias y las larvas de L. stagnalis. Cuando un paso implica el uso de un producto químico peligroso esto se indica mediante la palabra "PRECAUCIÓN" y todos los procedimientos de seguridad adecuados debe ser adoptada. Los enlaces a las hojas MSDS representativos de los productos químicos peligrosos están dentro de Archivo 1. Recetas para todos los reactivos están dentro del archivo complementaria 2.
1. Montaje de Decapsulation Aparato
- Para ello, conectar una jering....
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Resultados
Los patrones de tinción WMISH representativo mostrado en la Figura 3 se generaron utilizando la técnica descrita anteriormente, y reflejan una variedad de patrones de expresión espacial de genes implicados en una serie de procesos moleculares que varían de formación de la cáscara (gen Novel 1, 2, 3 y 4), a la señalización célula-célula (Dpp) para regulación de la transcripción (Brachyury) a través de una gama de etapas de desarrollo. S.......
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Discusión
El método aquí descrito permite la visualización eficaz de transcritos de ARN con presumiblemente diferentes niveles de expresión dentro de todas las etapas de desarrollo de Lymnaea stagnalis. Para eliminar los embriones y larvas de sus cápsulas que probó una variedad de productos químicos, choque osmótico y tratamientos físicos reportados para otro encapsulated- el desarrollo de organismos modelo. Sin embargo, en nuestras manos el método que describimos aquí es la única técnica de alto rendimiento que elimina .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por fondos a través de DJJ proyecto DFG # JA2108 / 2-1.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pinza de peso pluma | Ehlert & Socio | #4181119 | |
| Tubo de silicona | Glasgerä tebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Capilares de vidrio | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 placas de cultivo de tejidos de pocillos | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldehído | Carl Roth | P733.1 | PRECAUCIÓN - Puede causar cáncer. Tóxico por inhalación, en contacto con la piel y si se ingiere. Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación, en contacto con la piel y en caso de ingestión. |
| Ácido etilendiamina tetraacético | Carl Roth | CN06.3 | PRECAUCIÓN - CAUSA IRRITACIÓN OCULAR. PUEDE CAUSAR IRRITACIÓN DE LAS VÍAS RESPIRATORIAS Y DE LA PIEL. Evite respirar polvo. Evite el contacto con los ojos, la piel y la ropa. Úselo solo con ventilación adecuada |
| Cloruro de magnesio | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | PRECAUCIÓN - Puede ser dañino si se inhala. Puede causar irritación de las vías respiratorias. Puede ser perjudicial si se absorbe a través de la piel. Puede causar irritación de la piel. Puede causar irritación en los ojos. Puede ser perjudicial si se ingiere. |
| Cloruro de sodio | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll tipo 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polivinilpirrolidona K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | PRECAUCIÓN - Puede ser perjudicial si se inhala. Puede causar irritación de las vías respiratorias. Puede ser perjudicial si se absorbe a través de la piel. Puede causar irritación de la piel. Puede causar irritación en los ojos. Puede ser perjudicial si se ingiere. |
| Libre de nucleasaAlbúmina sérica bovina | Carl Roth | 8895.1 | |
| Esperma de salmón | Carl Roth | 5434.2 | |
| Heparina | Carl Roth | 7692.1 | PRECAUCIÓN - LOS EFECTOS ADVERSOS INCLUYEN HEMORRAGIA, IRRITACIÓN LOCAL. POSIBLE REACCIÓN ALÉRGICA EN CASO DE INHALACIÓN, INGESTA/CONTACTO. IRRITANTE DE OJOS/PIEL/VÍAS RESPIRATORIAS. POSIBLE HIPERSENSIBILIZACIÓN. SE HA REPORTADO QUE DURANTE EL EMBARAZO AUMENTA EL RIESGO DE MUERTE FETAL |
| Proteinasa-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glicina | Carl Roth | 3790.2 | |
| Formamida desionizada | Carl Roth | P040.1 | PRECAUCIÓN - Irritante para los ojos y la piel. Puede ser perjudicial por inhalación, en contacto con la piel y si se ingiere. Puede causar daño al feto. Higroscópico. |
| Formamida estándar | Carl Roth | 6749.3 | PRECAUCIÓN - Irritante para los ojos y la piel. Puede ser perjudicial por inhalación, en contacto con la piel y si se ingiere. Puede causar daño al feto. Higroscópico. |
| Trietanolamina | Carl Roth | 6300.1 | PRECAUCIÓN - Evite respirar vapor o neblina. Evite el contacto con los ojos. Evite el contacto prolongado o repetido con la piel. Lavar bien después de la manipulación. |
| Anhídrido acético | Carl Roth | 4483.1 | PRECAUCIÓN - CAUSA QUEMADURAS GRAVES EN LA PIEL Y LOS OJOS. REACCIONA VIOLENTAMENTE CON EL AGUA. DAÑINO SI SE INGIERE. VAPOR IRRITANTE PARA LOS OJOS Y LAS VÍAS RESPIRATORIAS |
| Ácido maleico | Carl Roth | K304.2 | PRECAUCIÓN - Muy peligroso en caso de contacto con los ojos (irritante), de ingestión, . Peligroso en caso de contacto con la piel (irritante), de inhalación (irritante pulmonar). Ligeramente peligroso en caso de contacto con la piel (permeador). Corrosivo para los ojos y la piel. |
| Benzoato de bencilo | Sigma | B6630-250ML | PRECAUCIÓN - Puede ser dañino si se inhala. Puede causar irritación de las vías respiratorias. Puede ser perjudicial si se absorbe a través de la piel. Puede causar irritación de la piel. Puede causar irritación en los ojos. Nocivo si se ingiere. |
| Alcohol bencílico | Sigma | 10,800-6 | PRECAUCIÓN - Nocivo si se ingiere. Nocivo si se inhala. Causa irritación ocular grave. |
| Glicerol | Carl Roth | 3783.1 | |
| Polvo bloqueador | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab fragmentos AP conjugados | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro azul cloruro de tetrazolio en dimetilformamida | Carl Roth | 4421.3 | PRECAUCIÓN - Puede causar daño al feto. Nocivo por inhalación y en contacto con la piel. Irritante para los ojos. |
| 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato | Carl Roth | A155.3 | PRECAUCIÓN - Potencialmente dañino si se ingiere. No entre en contacto con la piel, los ojos ni la ropa. Posible irritante de la piel y los ojos. |
| N-acetilcisteína | Carl Roth | 4126.1 | |
| Ditiotreitol | Carl Roth | 6908.1 | PRECAUCIÓN - Puede causar irritación en los ojos y la piel. Puede causar irritación del tracto respiratorio y digestivo. Las propiedades toxicológicas de este material no se han investigado a fondo. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | PRECAUCIÓN - Puede ser perjudicial si se inhala. Puede causar irritación de las vías respiratorias. Puede ser perjudicial si se absorbe a través de la piel. Puede causar irritación de la piel. Puede causar irritación en los ojos. Puede ser perjudicial si se ingiere. |
| Sulfato de dodecilo de sodio | Carl Roth | CN30.3 | PRECAUCIÓN - Nocivo si se ingiere. Tóxico en contacto con la piel. Causa irritación de la piel. Causa daños oculares graves. Puede causar irritación respiratoria. |
| Cloruro de potasio | Carl Roth | 6781.1 | |
| hidrogenofosfato disódico dihidratado (Na2HPO4• 2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
| Dihidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
| Citrato de sodio tri dihidratado (C6H5Na3O7• 2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | PRECAUCIÓN - Puede causar irritación de los ojos, la piel y las vías respiratorias. Las propiedades toxicológicas de este material no se han investigado a fondo. |
| Aceite mineral | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
Referencias
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. , Sinauer. Sunderland. (2002).
- Food and Agriculture Organisation of the Uni....
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Reimpresiones y permisos
