Abstract
内皮细胞排列的血管的内壁，并在血管张力，血管通透性，及新血管形成的调节中起重要作用。内皮细胞功能障碍在许多心血管疾病，包括缺血性心脏疾病的发生和发展有关。审查功能和冠状内皮细胞的表征，细胞分离是第一步，它需要高纯度和数量进行随后的实验。这个协议描述了一种有效的方法，以分离成年鼠冠状内皮细胞。小鼠心脏解剖，切碎成小块。用分散酶和胶原酶II心脏的消化后，将细胞洗涤并与缀合有抗CD31抗体的磁珠孵育。与内皮细胞的珠洗涤几次，并准备在各种应用中，包括成像和分子生物学experime使用NTS。高效分离得到每一心脏大约10 4细胞有超过90％的纯度。
Introduction
各种心血管疾病和代谢性疾病的小鼠模型承受其类似于那些在患者中发现的生理和分子变化。此外，老鼠的基因的改变是一个强大的工具，使我们能够调查疾病发生和发展的特定基因的致病作用。时下，细胞类型特异性基因敲入或-out小鼠容易在特定的细胞类型许多实验室和mRNA的测定和蛋白水平产生在确定是否将小鼠真正遗传修饰的第一步。
内皮是内皮细胞（EC），该线的内血管壁的薄单层。内皮细胞在调节血管张力，血管通透性，及新血管形成1,2-关键作用。内皮功能障碍是许多病理学病症和血管内皮功能的改变的标志可导致各种汽车diovascular疾病3,4。它是这样显著研究生理和病理生理条件下的内皮细胞的功能。
有几种方法来分离内皮5-8和隔离方法具有这取决于组织和物种将被用来进行优化。这是因为来自不同组织的EC显示异质性的高水平的相对于它们的表面标记和蛋白质表达9。内皮细胞的成功分离往往是具有挑战性的，需要一定程度的培训和实践。一旦实现，在该协议提出隔离的方法证明是稳定的和有效的。
这种方法的总体目标是获得鼠标冠状动脉内皮细胞（MCECs）的高品质和数量。即使细胞从心脏采集的量小于从使用其他技术的其他组织中收集的细胞，该技术仍然提供赌注之三的品质。内皮细胞在所得人口的纯度为大于90％。因此，这种技术将是理想的，依赖于纯粹分离的内皮细胞，如细胞成像应用。
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Protocol
对小鼠研究批准了亚利桑那大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC），并根据美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针进行。
注：第1，第2和第3应的实验，安装前进行了一天。
1.准备解决方案
- CD31缓冲液（50ml）中
- 加入50mL 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），以50毫升管中。权衡0.05克牛血清白蛋白（BSA）和0.037克乙二胺四乙酸（EDTA），并加入到50毫升管，并把管子转动约1小时，直至粉末溶解。调节pH至7.4，通过0.2微米的过滤器过滤到一个新的50ml管中，并在4℃直至使用存储。
- Hank氏平衡盐溶液（HBSS）以HEPES（500毫升）
- 添加1.1915克HEPES，使在HBSS溶液10毫米的HEPES拌匀。测量pH值调整至7.4。过滤器和储存在4C。
- 1倍的Kreb氏溶液（1L）
- 加入100毫升10×的Kreb氏溶液[ 表1]在1升烧瓶中以双蒸水。权衡2.1克碳酸氢钠和2克D-葡萄糖，并加入到烧瓶中。混合并调节总体积至1L
- 用95％ 的 O 2/5％CO 2的气泡溶液的罩内30分钟，并过滤溶液。存放在4℃和实验过程中保持在冰上。
2.准备磁珠
- 加入1 ml的CD31缓冲器内每次1.5毫升管（每采样1管）。混合羊抗大鼠IgG珠和适量添加到每个样品[ 表1]。摇试管大力的30倍，并将其放置在磁板晃动1分钟。打开而上盘管和转储解决方案集成到一个桶里。
- 加入1 ml的CD31缓冲到每个管中。添加2微升大鼠抗小鼠CD31抗体向每个管中并在4ºC旋转管O / N。
3.高压灭菌
- 高压灭菌所有的手术工具和枪头。切枪头的端部，以便有4种不同直径的提示，从最宽到最窄。的提示近似直径3毫米，2,5 mm开始，2毫米，并分别为1.5毫米。切割尖端，并在121°C的温度下具有杀菌30分钟，然后高压灭菌的一天。
注：第4 - 11应在实验当天进行。
4.准备解决方案
- 准备含2％铁强化小牛血清（IFCS）的M199洗涤液。对于成像，准备为30 mL /鼠标。
- 制备的酶溶液（10毫升/样品）。称量0.6单位/ ml分散酶和1mg / ml的胶原酶II型的到50毫升管中。添加M199，并在4ºC旋转管15分钟。通过0.2微米的滤膜过滤到一个新的50ml管中insidË罩，并保持在4℃直至使用。
- 准备HBSS / HEPES肝素。有10mM HEPES加入10 mL的HBSS在15毫升管中。加入100微升肝素到管，并保持在4℃直至使用。
5.洗涤珠
- 取出与来自旋转器珠粒的管，在4ºC并带至机罩。放置管在磁性板振摇1分钟。转储溶液和加入1 ml的CD31缓冲到每个管中。
- 就拿管出来的磁板和用力振摇30倍。放管放回磁性板并重复总共3次洗涤。建成后，将管道回4C和保持旋转，直到使用。
6.解剖
- 用0.1ml肝素腹膜内注入小鼠，以防止血液凝固。等待10分钟，然后麻醉使用的0.01毫升戊巴比妥腹膜内注射小鼠。检查鼠标的感觉按捏脚的疼痛。
- 广场上有头聚苯板鼠标并用针持有武器。使用镊子和强硬的切剪刀剪开在上胸区皮肤到喉咙。
- 使在左肋只是隔膜上方的中心的切口。侧身向上切骨朝喉咙一起组成一个三角形暴露心脏和肺部。刚切膈上的主动脉。
- 握住钳胸腺不拉并用剪刀小心切割任意的结缔组织去除肺部和心脏一起。在烧杯中的地方组织与1×克雷布斯的，握钳和转让〜6厘米培养皿1×克雷布斯的。
- 删除使用剪刀和镊子的肺叶。插入一个20G的无菌导管进入主动脉。冲洗血液在用HBSS /肝素冠状循环系统。使心室一小截，摇心脏和转移到M199的样品管。置于冰上管。
- 的心脏转移到一个直径6cm培养皿填充用10ml酶溶液，并剁碎成用剪刀小块。放置在37ºC孵化的菜15分钟。通过与一切割端的前端上下吹打30次，以允许所述组织通过容易搅动消化的材料。
- 把它放回在37ºC孵化了15分钟。重复搅拌三次，用枪头从最大开口每次最窄，每间15分钟孵化。
- 过去的15分钟温育后，取样品并到罩。吸管溶液和使用吸管尖与最窄开口并通过40微米的细胞滤网到一个新的50ml管中下降了30倍。
- 使用10毫升吸管洗净用10ml洗涤液的培养皿转移到细胞过滤。放置在离心机和自旋的50ml试管在400克在RT 10分钟。
- 而不破坏沉淀除去上清液。洗用5毫升洗涤缓冲液细胞两次。
- 获取先前一次中制备的1.5毫升管珠和工作在一个管。放一只1.5mL管中的磁板，摇3次，并打开它。
- 最后离心后，取出尽可能多上清尽可能不中断沉淀。通过大力弹撇清的细胞团块。
- 加入1ml洗涤缓冲液到50毫升管，将细胞用1毫升吸管混合。转储从1.5毫升管的溶液，并从50ml管中的珠加入1 ml的细胞悬浮液。振动小管的30倍，然后旋转，在4ºC30分钟。
9.准备细胞培养/影像
- 准备室电镀细胞。添加明胶溶液（5％重量/体积，300微升）到室以及涂覆表面，并在37ºC孵育30分钟。孵育后，REMOVE明胶和干燥的表面上。
- 取出含珠/细胞的试管旋转后的30分钟，并把在发动机罩内的磁板。振摇2分钟，转储和加入1ml洗涤液。
- 就拿出来管板，用力振摇30次，然后一抖30倍。将它们放回磁板，振摇1分钟。重复4次，总共5次洗涤的，但与上板1分钟进行摇动培养。
- 最后一次洗涤后，取出一管并在每次打开一个管工作之一。摇30次，然后轻弹30倍。把它放在磁板，振摇1分钟。转储和加入1ml 20％乳油IFCS介质（37ºC预热）。
- 剧烈摇晃30次，然后轻弹30倍。调整吸管500微升和吸管上下10次。转移500μl到每个室。
- 把在37ºC孵化器，并留下O / N。第二天，洗涤细胞，用10％FBS的乳油介质。
10.准备Western印迹（WB）样品
- 德Ë出珠/细胞管旋转后的1小时。把它们放在磁板振摇2分钟。转储上清液，加入1毫升冷HBSS。剧烈摇晃30次，然后轻弹30倍。重复两次洗涤3次，但与上板1分钟进行摇动培养。
- 最后一次洗涤后，把磁板管和振摇1分钟。使用移液管除去缓冲液和使用方法先前描述11,12裂解细胞为WB。收集裂解液中通常含有蛋白质约30微克。
11.成像
- 清洗细胞3次，用媒体，具有用于腔室的250微升最终体积。添加1.5微升语-acLDL的细胞中。从这一点来说，使细胞保持在黑暗中。
- 在37℃孵育3.5小时。添加1.5微升Hoechst公司的，拌匀，并在37˚C.Wash细胞用PBS孵育30分钟，并用4％多聚甲醛（PFA）在室温20分钟固定。
- 用PBS洗两次，并用5％的方框BSA-PBS进行30英里北，RT。用1％BSA-PBS中洗两次。稀释，用1％BSA-PBS BS-凝集素FITC至2微克/ ml的浓度，并添加300微升到每个室。
- 放腔室上的轨道摇床在RT 30分钟。用PBS洗涤3次。
- 可视化与FITC（凝集素染色，欧共体标志，激发/发射488纳米/ 519纳米），用于DAPI（赫斯特，核染色，激发/ 358 nm发射/ 30毫秒的200毫秒的曝光时间的荧光显微镜下观察细胞461纳米），并在557毫微米/ 576毫微米）300毫秒TRITC（acLDL染色，欧共体盯防，激发/发射。获得使用20X物镜图像。
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Representative Results
从小鼠心脏冠状内皮细胞的成功分离通常产生约10 4个细胞，纯度用鹅卵石形状90％以上。对内皮细胞的纯群体，应谨慎整个协议注意保证不受任何污染的无菌环境。细长细胞或群体内放大细胞的出现指示与其他细胞类型，平滑肌细胞和成纤维细胞的污染。内皮细胞的纯度试验是通过染色细胞与内皮细胞表面标记物，BS-凝集素和acLDL（ 图1）执行的。表现出两种颜色阳性细胞的比例超过了90％MCEC。这样的结果表明，该技术已成功执行。
| PBS（10×）（1L） | </ TD> | ||
| 材料 | MW | 量（g） | |
| 氯化钠 | 58.44 | 80 | |
| 氯化钾 | 74.55 | 2 | |
| 的 Na 2 HPO 4 | 141.96 | 6.1 | |
| KH 2 PO 4 | 136.08 | 2 | |
| 克雷布斯（10倍）（1升） | |||
| 材料 | MW | 浓（MM） | 量（g） |
| 氯化钠 | 58.44 | 118 | 69 |
| 氯化钾 | 74.56 | 4.7 | 3.5 |
| 氯化钙2•2H 2 O | 147 | 1.8 | 2.6 |
| 硫酸镁4•7H 2 O | 246.5 | 1.2 | 2.96 </ TD> |
| 加入NaH 2 PO 4 | 120 | 1.2 | 1.44 |
| EC介质（20％）（500毫升） | |||
| 材料 | 量 | ||
| M199 | 444.5毫升 | ||
| 10 - 20 U / ml肝素 | 500微升 | ||
| D-缬氨酸 | 25毫克 | ||
| 政府间化学品安全论坛 | 100毫升 | ||
| EGS | 10毫克 | ||
| 青霉素/链霉素 | 5毫升 | ||
| 用于一只小鼠的珠量 | |||
| 对于成像 | 5微升 | ||
| F或WB / PCR | 10微升 | ||
表1.用于解决方案的化学成分。
图1. MCECs。荧光图像的代表图像显示，从心脏分离的小鼠冠状动脉内皮细胞（MCEC）表现出EC人口的纯度高。纯度通过的红色（A）和凝集素染色在MCEC绿色（B）的两acLDL摄取测试。细胞核被Hoechst公司在蓝色（C）的染色。表现出两种颜色阳性细胞的比例超过了90％MCEC。酒吧代表20微米。 请点击这里查看大VERS这个数字的离子。
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Discussion
在研究中最广泛使用的血管内皮细胞，因为它们方便和易于培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。然而，大量的研究，需要由内皮细胞从其它特定器官10的隔离达到生理模型的可用性。内皮细胞弥补心脏组织细胞的一个很小的群体;其分离和培养可以证明是非常困难的。
有此协议中的三个关键步骤。第一是冲洗血液良好。这是必要的，因为血液中的白细胞也表达CD31作为细胞表面标记物，和将竞争的EC为CD31抗体的结合。作为其他的内皮细胞还可以是存在于血液中，冲洗是必不可少的，以防止污染由这样的细胞。第二个关键步骤是维持整个分离过程中的无菌环境。任何污染地区环境部门一道LTS中获得的细胞的数量急剧减少。最后，第三个关键步骤是调整CD31缓冲液的pH，如不这样做会降低隔离的效率。
小区质量是此分离过程中最重要的。平滑肌细胞的生长可通过加入肝素的适当量与培养基被抑制。成纤维细胞增殖可以通过添加D-缬氨酸向媒体减慢。内皮细胞可以通过语-AcLDL和共染色使用BS-凝集素的摄取，以测试对于population.The内皮细胞表型的纯度来表征是不稳定的，它们的行为可以更改迅速一次取出的原始组织的并培养。该技术的一个限制是，细胞不应该后培养5天被用来确保它们仍然保留它们的表型。强烈建议不要通过细胞。主细胞将提供一致的地区环境部门一道LT。
总体而言，该技术会导致一个好的一批优秀的纯度细胞。随着所需技能，隔离过程可能6小时内完成。它提供了一种获取鼠标冠状动脉内皮细胞或者细胞培养或分子生物学实验一个伟大的方法。
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Acknowledgments
这项工作是由卫生（HL115578到A牧野）全国学院的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Rat anti-mouse CD31 Antibody | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
References
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