Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo per la sintesi di particelle virus-simili che utilizzano sia baculovirus o sistemi di espressione di mammifero, e la purificazione ultracentrifugazione. Questo approccio altamente personalizzabile viene utilizzato per identificare antigeni virali come bersagli vaccino in modo sicuro e flessibile.
Abstract
particelle virus-simili (VLP) e particelle subvirale (SVP) sono un approccio alternativo per la progettazione di vaccini virali che offre i vantaggi di una maggiore sicurezza biologica e stabilità oltre l'uso di agenti patogeni dal vivo. Non infettive e di auto-assemblaggio, VLP sono utilizzati per presentare proteine strutturali come immunogeni, bypassando la necessità di agenti patogeni dal vivo o vettori virali ricombinanti per la consegna antigene. In questo articolo, abbiamo dimostrato le diverse fasi di progettazione VLP e sviluppo per applicazioni future in sperimentazione animale preclinico. Il procedimento comprende le seguenti fasi: selezione di antigene, espressione dell'antigene in linea cellulare di scelta, purificazione di VLP / SVP, e quantificazione per il dosaggio dell'antigene. Dimostriamo uso di entrambe le linee cellulari di mammiferi e insetti per l'espressione dei nostri antigeni e dimostrare come le metodologie differiscono nella resa. La metodologia presentata può applicare a una varietà di agenti patogeni e può essere ottenuto sostituendo gli antigeni con str immunogenicoproteine uctural di microrganismo dell'utente di interesse. VLP e SVP assistono con caratterizzazione dell'antigene e la selezione dei migliori candidati vaccini.
Introduction
particelle virus-simili (VLP) sono una tecnologia approvata per la vaccinazione umana. In effetti, alcuni dei vaccini più contemporaneamente in licenza, tra cui il papillomavirus umano (HPV) e l'epatite Β (HepΒ) vaccini impiegano questo metodo. VLP sono formate da proteine strutturali in grado di auto-assemblaggio. Le particelle assemblate imitano morfologie virali, ma non possono infettare o replicare perché non hanno genomi virali. VLP possono essere espressi e purificati da un certo numero di sistemi procariotici ed eucariotici. Una revisione della letteratura ha rivelato che diversi sistemi di espressione sono impiegati alle seguenti tariffe: batteri - 28%, lievito di birra - 20%, impianto - 9%, insetto - 28%, e di mammiferi - 15% 1. Da segnalare, vaccini HPV a base di proteine del capside L1 sono prodotte nel lievito (Gardasil) o in un sistema di cellule di insetto (Cervarix) 2. Vaccini HepΒ, Recombivax e Engerix-Β, sono prodotti anche nel lievito, e sono composti da HepΒ antigene di superficie 3, 4.
Usiamo sistemi di espressione di cellule di mammiferi e insetti per la produzione di VLP che richiedono co-espressione di molteplici proteine strutturali per il montaggio. Il nostro lavoro si concentra sulla progettazione, produzione, e di vaccini VLP-based di depurazione contro gli agenti patogeni umani: virus dell'influenza, virus respiratorio sinciziale (RSV), virus della dengue (DENV), e virus Chikungunya (CHIKV). I nostri metodi sono sufficientemente flessibili per permettere co-espressione delle molteplici proteine strutturali da più plasmidi di espressione, o un singolo plasmide di espressione (Figura 1). In precedenza, abbiamo prodotto e purificato H5N1 VLP assemblato dalla co-espressione di plasmidi che codificano emoagglutinina influenza (HA), neuraminidasi (NA), e matrice (M1) in embrionali cellule 293T renali umane 5,6. I geni sono stati codone-ottimizzati per l'espressione in cellule di mammifero e clonati in pTR600, un vettore di espressione eucariotica contenente i citomegalovirus immediato inizio promotore più INTRON A per avviare transcrizione di inserti eucariotiche e il segnale di poliadenilazione ormone della crescita bovina per la terminazione della trascrizione 7. Un approccio simile utilizzando tre plasmide co-espressione di HA, NA (Figura 1A) e una proteina della matrice virale alternativa, HIV Gag p55, è stato utilizzato per la generazione di influenza stagionale sottotipo umana H3N2 VLP in questo studio e ha dimostrato di generare VLP di dimensioni simili come particelle influenzali 8. Anche se vaccini contro l'influenza prevalentemente suscitano anticorpi anti-HA, l'aggiunta di neuraminidasi dell'influenza media attività sialidasi per consentire VLP in erba da cellule trasfettate 9 e presenti anche gli obiettivi immunogenico aggiuntivi. Per produrre RSV VLP, abbiamo anche scelto il nucleo non collegato di HIV Gag per progettare vaccini prototipo che presentano glicoproteine di superficie esclusivamente RSV per dimostrare ulteriormente la flessibilità della formazione VLP con HIV Gag, come descritto in precedenza e caratterizzato da microscopia elettronica 6,10. Altrihanno precedentemente dimostrato che VLP presentando glicoproteine RSV possono essere assemblati utilizzando vari componenti virali da virus della malattia di Newcastle (NDV) 11, e l'influenza di matrice 12. Full-length sequenze glicoproteina di superficie sono stati utilizzati in questo studio per mantenere conformazioni nativi che possono essere necessari per il recettore funzionale di legame e il dosaggio degli anticorpi riconoscimento attraverso test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
I nostri esempi di utilizzo di sistemi di singola espressione plasmide per generare particelle sono DENV e CHIKV. Nel caso di DENV, possiamo produrre particelle subvirale (SVP) senza capside in cellule 293T da un singolo plasmide contenente un PRM / E gene strutturale cassetta di espressione 13. Il termine SVP viene usato per indicare la mancanza di una proteina core o capside nell'assemblaggio di proteine strutturali virali. CHIK VLP può anche essere prodotto utilizzando un singolo plasmide contenente un CHIKV cassette gene strutturale, capside codifica e busta proteine, o in icellule nsect infettando con un baculovirus ricombinante che codifica per la stessa cassetta gene strutturale ottimizzato per l'espressione di cellule di insetto (Figura 1B - C).
Il risultato finale dell'espressione approcci sopra discusso è il rilascio di VLP nel mezzo di coltura cellulare che possono poi essere purificato mediante ultracentrifugazione attraverso un cuscino glicerolo 20%. In questo rapporto, presentiamo i metodi per esprimere e purificare queste VLP da sistemi cellulari di mammiferi e insetti.
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Protocol
1. sistema mammifero di espressione per la generazione di influenza H3N2 VLP
- Sottoclone virale glicoproteine strutturali emoagglutinina (HA), neuraminidasi (NA), e il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) Gag p55 in vettori di espressione eucariotica, come descritto in precedenza pTR600. 7
- Amplificare il DNA in Escherichia coli chimicamente competente (ad esempio, DH5α) e isolare trasfezione-grade plasmide utilizzando un kit di purificazione plasmide secondo le istruzioni del produttore. Quantità di DNA dipende dalla resa e le esigenze degli utenti.
- Mantenere linea cellulare di mammifero, 293T, in terreni di coltura contenente 10% di siero fetale bovino (FBS) a 37 ° C con 5% di CO 2 in un incubatore umidificato.
- Crescere le cellule in modo che un pallone di coltura tissutale T-150 contiene 45-75 x 10 6 cellule per fiasco tale che matraccio ottiene completa adesione delle cellule e cellule confluenza 85-95% entro il giorno successivo. Ispezionare le cellule sotto il microscopio per conflu desideratorenza.
Nota: ad alta densità cellulare è in genere consigliato di cedere l'espressione della proteina ottimale con il minimo citotossicità utilizzando reagenti di trasfezione commerciali comunque un eccesso di confluenza può causare l'accumulo di rifiuti cellulari sottoprodotti e ridurre la vitalità cellulare. - Il giorno della transfezione, preparare liposomi e la miscela di DNA secondo le raccomandazioni del costruttore e trasfezione le cellule del DNA con una composizione del DNA di 1: 1: 2 di HA: NA: Gag con una quantità di DNA totale di 40 mcg per pallone T-150. Diluire soluzioni di DNA e liposomi in mezzi trasfezione privo di siero senza antibiotici tale che ciascun pallone contenente un volume totale di 20-30 ml.
Nota: Rapporto tra costrutti genici può richiedere l'ottimizzazione degli utenti. Sebbene non dimostrato qui, una procedura di trasfezione simile è stata eseguita con il virus respiratorio sinciziale (RSV) F e HIV Gag ad un rapporto 1: 1. Per DENV e CHIKV plasmidi singola espressione, per un totale di 20 mg di DNA per T-150 pallone sono utilizzati per la ottimale eXpression. DNA: transfezione rapporti reagenti sono ottimizzati utente. Uso consigliato media transfezione basato sul metodo di trasfezione, vale a dire, trasfezioni lipidi policationici raccomandano riduzione o assenza di siero fetale bovino in tal modo i media possono essere completate con ormoni della crescita e oligoelementi per sostenere la crescita in assenza di siero. - Rientro palloni a 37 ° C con 5% di CO 2 incubatore. Per un volume di 200 ml, utilizzare 9 T-150 palloni. Le cellule vengono mantenute in mezzo di coltura trasfezione fino al giorno del raccolto VLP.
- Harvest cultura surnatante dalle cellule dopo 72-96 ore dopo la trasfezione seconda antigene, o quando vitalità cellulare è sceso a 70-80%, come stimato mediante ispezione al microscopio. Trasferire il surnatante in 50 ml provette coniche e far girare le celle in basso a 500 g per 5 minuti a 4 ° C per far sedimentare i detriti cellulari.
Nota: La sostituzione di tre giorni surnatante con pre-riscaldato, privo di siero dei media trasfezione fresco di cellule aderenti saranno yielda secondo lotto di VLP con rendimento simile o leggermente ridotto e deve essere ottimizzato dall'utente. - Pool surnatante e filtro attraverso una membrana 0,22 micron pori prima sedimentazione tramite ultracentrifugazione.
- Testare l'attività emoagglutinazione dei VLP HA-esprimono mediante test di emoagglutinazione standard di 14 utilizzando lo 0,8% di tacchino o di globuli rossi dei mammiferi o procedere con ELISA antigene-specifica. Vedere la Figura 2 per i risultati rappresentativi.
2. CHIK VLP espressione utilizzando Baculovirus / Insect Cell System
- Generare baculovirus ricombinanti che esprimono capside del virus Chikungunya e proteine dell'involucro (C-E3-E2-6K-E1) da S-27 ceppo utilizzando un sistema commerciale di espressione baculovirus.
- Cellule Sf9 Cultura Spodoptera frugiperda in terreno di crescita Sf9 privo di siero con 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina a 28 ° C. Utilizzare 3-5 x 10 5 c / ml di avviare culture pallone filatore per suspensla crescita delle cellule di ioni. Passaggio routine quando raggiungono densità di cellule di 2-4 x 10 6 c / ml (ogni 3-4 giorni).
- cellule Culture Sf9 in sospensione in flaconi filatore con agitazione a 130 rpm in un sistema multipunto piatto agitatore. Per una corretta aerazione, mantenere volumi di coltura a non più di metà del volume del pallone filatore.
- Per l'espressione di CHIK VLP, infettare le cellule Sf9 ad una densità di 2 x 10 6 cellule / ml con baculovirus ricombinante ad una molteplicità di infezione di 1 e tornare a 28 ° C incubatore. In genere, infettare una o due palloni filatore, contenenti 250 ml cellule Sf9.
Nota: Anche se non utilizzare questo metodo, le cellule Sf9 possono essere coltivate in fiaschi di vibrazione a 28 ° C utilizzando una piattaforma shaker. - culture raccolto dopo 72-96 ore dopo l'infezione, o quando la vitalità delle cellule è diminuito al 70-80%, come determinato dal Trypan Blue esclusione secondo il protocollo del produttore.
Nota: le cellule continuano a proliferare, mentre infetto e vi èun ~ 80% vitalità nelle culture Sf9 infettate con baculovirus ricombinanti CHIK VLP a 3 giorni dopo l'infezione (dpi). cellule baculovirus infettate sono più grandi in apparenza. Morfologia può anche cambiare da rotondo a oblunga. Alla fine di stadi di infezioni baculovirus, le cellule hanno cominciato a lisare. - culture trasferire direttamente dal coltura in sospensione in 50 ml provette coniche e spin giù le cellule a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Raccogliere surnatanti e filtrare attraverso una membrana da 0,22 micron pori prima sedimentazione tramite ultracentrifugazione.
3. La sedimentazione / Purificazione di VLP / SVP
- Sterilizzare tubi ultracentrifuga open-top 25 mm x 89 mm con il 70% di etanolo in cappuccio biosicurezza. Assicurarsi che l'etanolo è asciugata prima dell'uso.
- Caricare fino a 32 ml di surnatante in una provetta pulita. Si raccomanda un volume minimo di 25 ml per prevenire il collasso e il danno di tubi riempiti ultracentrifuga adeguatamente.
- underlay attentamente surnatanti ingegnoh sterile 3 ml 20% glicerolo in PBS (v / v). Assicurarsi che i tubi sono equilibrati.
- Spin a 135.000 xg per 4 ore a 4 ° C.
- Aspirare il surnatante, garantendo il pellet non sloggiare dal tubo.
- Risospendere sedimentato VLP nella parte inferiore dei tubi con PBS sterile vigorosamente pipettando su e giù. La quantità di PBS necessaria per risospendere VLP dipende dalla resa di proteine totali VLP e applicazioni a valle. In genere, risospendere ogni pellet VLP in almeno 100 ml.
- Conservare i campioni a 4 ° C per una conservazione a breve termine e di stoccaggio -80 ° C per una conservazione a lungo termine.
4. determinazione delle rese di proteine e rendimenti antigene specifico
- Determinare il contenuto proteico totale utilizzando un metodo proteina quantificazione commerciale, come ad esempio test BCA come da protocollo del produttore.
- Per valutare il contenuto antigene specifico, eseguire diretta enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) rivestendo diluizioni seriali di antigene standard e 2-51; g di campione proteico totale a una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto ELISA.
- Seguire con anticorpi antigene-specifici per sondare la presenza degli antigeni sulla piastra e utilizzare substrati sviluppo ELISA convenzionali per produrre assorbanza rilevabili per lettore di micropiastre. Vedere la Figura 2 per i risultati rappresentativi di test HA e ELISA per un campione HA-esprimendo VLP; molte combinazioni di HA e NA sono forse, ma i rendimenti possono essere diverse su HA-NA compatibilità 15.
Nota: gli anticorpi antigene-specifici hanno affinità variabili e si raccomanda che la diluizione endpoint-titolazione degli anticorpi essere determinata prima di eseguire VLP quantificazione. anticorpi commerciali avranno intervalli di concentrazione o diluizione consigliato per l'uso in ELISA, così come protocolli suggerite.
- Seguire con anticorpi antigene-specifici per sondare la presenza degli antigeni sulla piastra e utilizzare substrati sviluppo ELISA convenzionali per produrre assorbanza rilevabili per lettore di micropiastre. Vedere la Figura 2 per i risultati rappresentativi di test HA e ELISA per un campione HA-esprimendo VLP; molte combinazioni di HA e NA sono forse, ma i rendimenti possono essere diverse su HA-NA compatibilità 15.
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Representative Results
rendimenti VLP erano variabili in base alla progettazione di antigene virale costrutto. In questo protocollo, abbiamo dimostrato l'uso di cellule di insetto e di mammiferi per la produzione di SVP o VLP nel surnatante e purificazione da ultracentrifugazione. Quattro sottotipi di DENV PRM / E gene strutturale cassette di espressione sono stati usati per costruire le versioni di DENV SVP (delimitate da 1-4) nella tabella 1 e dimostrare un range compreso tra 1,1-2,6 mg di proteine totali in 0,6 ml di volume. Per VLP che richiedono un tre costrutti genici, abbiamo trovato il rapporto di trasfezione di DNA ottimizzato di 1: 1: 2 per HA: NA: Gag, rispettivamente, di sintetizzare VLP influenzali; al contrario, un singolo plasmide esprimente più proteine virali Chikungunya era adeguata per la generazione di baculovirus ricombinante e mammiferi CHIK VLP. Inoltre, una procedura di trasfezione dual-plasmide è possibile anche con cellule di mammifero, come tale con RSV F e Gag transfettate in un rapporto 1: 1, e produce approxinell'intervallo 0,01 mg / ml del totale del supernatante di coltura cellulare. Come mostrato nella Tabella 1, CHIK resa SVP da cellule Sf9 può variare tra 0,008-0,016 mg di proteine totali / ml di volume di supernatante, mentre la produzione attraverso mammiferi 293T produce una riduzione di 10 volte di proteine. Tra le due versioni di H3N2 VLP che utilizzano diverse wild-type, full-length plasmidi HA, l'H3N2 VLP Esempio 2 ha avuto un rendimento ridotto di due proteine totali e contenuti specifici di HA. Altro esempio VLP quantità di HA sono illustrati nelle figure 2 e 3 ed illustrano come HA e ELISA sono usati per stimare il contenuto di superficie sulle VLP. Come con un metodo ELISA diretta convenzionale, una curva standard viene generata utilizzando concentrazioni note di una HA ricombinante per confrontare ELISA reattività per assaggiare H3 VLP caricato su una piastra ELISA. ELISA o immuno-simili sono raccomandati per la quantificazione di VLP che hanno prontamente disponibili anticorpi monoclonali con crossreattività nota ad un epit ben conservatoOPES, ma potrebbe non essere disponibile per tutti gli antigeni. RSV F è ben caratterizzata, quindi un ELISA con anticorpo monoclonale anti-RSV F è applicabile anche per la quantificazione della superficie F su pellettato RSV F VLP. In aggiunta alla funzionalità antigene e riconoscimento dell'antigene da anticorpi specifici, preparazioni VLP possono essere strutturalmente valutati mediante microscopia elettronica. La Figura 4 è una immagine rappresentativa che mostra che HA (Gag-core) VLP influenzali sono espressi con successo, assemblati, e purificato come VLP.
| Descrizione | Cultura Vol (ml) | raccolto un | Volume totale | Resa Proteine totali (mg) | Resa (mg) / Vol (ml) | Contenuti specifici antigeni |
| DENV1 SVP | 293T186 | 4 d | 0,6 ml | 1.115 | 0.006 | ND |
| DENV2 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 ml | 2.5 | 0,0134 | ND |
| DENV3 SVP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 ml | 1.536 | 0,0083 | ND |
| DENV4 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 ml | 2.613 | 0.014 | ND |
| CHIK VLP | SF9 / 186 | 3 dpi | 0,6 ml | 1.503 | 0,0081 | ND |
| CHIK VLP | SF9 / 500 | 4 dpi | 2,0 ml | 8,276 | 0.0166 | ND |
| CHIK VLP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 ml | 0,296 | 0,0016 | ND |
| H3N2 VLP 1 | 293T /216 | 3 d | 0,6 ml | 1.25 | 0,0058 | 1,9 ug HA / pl |
| H3N2 VLP 2 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 0,956 | 0,0044 | 0,96 ug HA / pl |
| H3N2 VLP 3 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 1.6 | 0,0074 | 1,2 ug HA / pl |
| H3N2 VLP 4 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 1.54 | 0,0071 | 0,98 ug HA / pl |
| RSV F VLP | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 2.3 | 0,0106 | 0.15 mg RSV F / ml |
| un d = giorni dopo la trasfezione, dpi = giorni dopo l'infezione | ||||||
Tabella 1: subvirale e v i rendimenti delle particelle IRU-come di costrutto. dati rappresentativi dei volumi VLP, resa totale di proteine (determinato mediante test BCA convenzionale) o il contenuto antigene specifico (determinato mediante ELISA) è indicato tra una varietà di costrutti SVP / VLP. I rendimenti sono variabili a causa della differenza di SVP di montaggio / VLP e tipo di cellula, e massimi rendimenti possono richiedere l'ottimizzazione degli utenti. Le varie versioni di entrambi i DENV1-4 variano in base sierotipo, mentre il CHIK VLP utilizzare la stessa sequenza, ma i preparativi differiscono in volume o tipo di coltura cellulare. Le diverse versioni di H3N2 VLP (1-4) esprimono quattro sequenze uniche HA che condividono una HA-specifica ELISA epitopo reattivo e sono stati co-espressi con lo stesso nucleo NA e Gag. La RSV F VLP, che viene generato da un trasfezione dual-plasmide di RSV F e Gag, è stato sintetizzato e contenuti RSV F è stata approssimata mediante saggio ELISA specifico RSV F.
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Figura 1:. Approach - VLP progettazione, la sintesi e la purificazione Rappresentazione schematica di disegni gene plasmide per l'espressione di proteine strutturali virali che formerà VLP: (A) co-espressione di più proteine strutturali mediante co-trasfezione di tre plasmidi in cellule 293T , (B) espressione delle proteine strutturali da una singola cassetta gene codificato in un singolo plasmide in cellule 293T, e (C) codifica baculovirus ricombinante CHIK proteine strutturali viene utilizzato per infettare cellule Sf9 coltivate in fiaschi filatore per promuovere alta densità crescita delle cellule in sospensione . Le VLP sono raccolte dai mezzi di coltura cellulare, ha chiarito di detriti cellulari, e separati dai non-particelle tramite sedimentazione da ultracentrifugazione su un cuscino glicerolo 20%. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
. Figura 2: saggio Esempio emoagglutinazione di H3 VLP Un saggio di emoagglutinazione convenzionale è stato effettuato su un campione rappresentativo di H3N2 VLP e il suo corrispondente surnatante chiarificato; assay H3N2 HA può essere eseguita utilizzando 0,8% tacchino globuli rossi o globuli rossi cavia (non mostrato). contenuto proteico totale è stimato utilizzando il test BCA standard sul VLP purificato e non è stata eseguita o raccomandata per surnatante chiarificato. ELISA è stata eseguita sul VLP purificata e il contenuto di HA è stato stimato utilizzando un ricombinante HA standard di concentrazione nota. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Ex ampio H3 ELISA per la quantificazione del contenuto H3 in lamiera H3 VLP. Un ELISA è stato rivestito con diluizioni seriali di un ricombinante HA standard a concentrazione nota e diluito campioni H3N2 VLP generati da diverse sequenze HA (campioni 1-9). Correlare la concentrazione (mg / mL) dello standard per i valori di densità ottica a 492 nm ottenuti (OD), le concentrazioni sono ottenute deducendo il valore x che interseca la porzione lineare della curva standard. Le diluizioni di campioni standard e sconosciuti HA ricombinanti sono stati caricati in duplicato nei pozzetti A & B o, rispettivamente, C & D. La concentrazione finale del campione VLP è determinata moltiplicando la concentrazione per il fattore di diluizione del campione VLP. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4: La microscopia elettronica di HA-VLP usando Gag-core immagine al microscopio elettronico rappresentante purificata influenza HA VLP.. VLP assemblano in particelle sferiche rivestite con HA. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo usato le tecniche sopra descritte per esprimere con successo e purificare SVP e VLP composti da più proteine strutturali di vari agenti patogeni. In generale, usiamo sistemi di espressione di mammifero per generare i nostri VLP. Tuttavia, nelle nostre mani, dei mammiferi cellule derivate Chik rendimenti VLP erano bassi. CHIK resa VLP è stato più robusto quando si utilizza un sistema di celle baculovirus-insetto ricombinante. In generale, baculovirus-insetti sistemi cellulari producono una maggiore quantità di proteine ricombinanti, che possono derivare da densità delle celle superiori che possono essere coltivate in fiaschi filatore rispetto fiasche di coltura dei tessuti, e anche a causa di alto livello di espressione dei geni estranei, mentre sotto il controllo del promotore poliedrina baculovirus. 16 Tuttavia, uno svantaggio di usare baculovirus è la presenza di baculovirus in preparati VLP, che ha l'attività adiuvante, ed i risultati immunologici inclinazione a vaccino studies 17 Abbiamo anche trovato la variabilità del rendimento di influenza VLP seconda delle combinazioni HA e NA utilizzati; H3N2 VLP2 era relativamente ridotto rendimento rispetto al H3N2 VLP1, potenzialmente causa di assemblaggio VLP meno efficiente o NA-compatibilità 15 e rimane per essere ulteriormente approfondito. Ottimizzazione dei costrutti di DNA e di rapporti di trasfezione rimangono passaggi critici per garantire rendimenti VLP ottimali. Abbiamo scelto di utilizzare un vettore pTR600 mammiferi costantemente tra i nostri VLP mammiferi a base perché l'espressione è generalmente efficiente e subcloning è conveniente con più enzimi di restrizione. Rapporti di plasmidi possono essere regolati per le esigenze degli utenti per migliorare i rendimenti VLP. Tuttavia, come discusso, le attuali limitazioni della produzione VLP mammiferi rimangono con il costo di trasfezione e la capacità di crescita delle cellule in fiasche di coltura tissutale attuali. Anche se non è eseguita in questo protocollo, abbiamo osservato produzione aggiuntiva di successo di VLP in cellule trasfettate quando il supporto viene rifornito con i media di crescita fresco (ad esempio, OptiMEM) dopo gli abetit raccolta 72 ore e successiva raccolta di VLP, dopo un ulteriore 72 ore, anche se i rendimenti possono essere leggermente ridotta rispetto alla prima raccolta di VLP.
Dimostriamo una procedura per esprimere proteine strutturali virali sia in colture cellulari di insetto o di mammiferi di rilasciare VLP nel surnatante per semi-purificazione mediante ultracentrifugazione. L'UDC / VLP sono generalmente stabili per l'uso in test immunologici antigene e studi di vaccinazione, e rappresentano un minor numero di minacce alla sicurezza rispetto a vivere particelle virali, in particolare per selezionare agenti o l'influenza aviaria ad alta patogeno (HPAI) ceppi 8,18, che richiedono livello di biosicurezza 3 condizioni (BSL-3) di laboratorio 19. produzione di VLP è relativamente semplice e spesso produce particelle che possono essere riconosciuti da anticorpi contro le proteine strutturali suscitato virali native, non esclusivamente epitopi lineari denaturati. VLP fungere da piattaforma utile per suscitare risposte immunitarie specifiche per l'antigene e maggioessere un candidato promettente per lo sviluppo di vaccini.
Questo protocollo illustra due approcci per trasfezione geni virali nel sistema mammiferi. In questa illustrazione, due geni influenza, HA e NA, sono co-trasfettate con il Gag HIV per generare un VLP che ha un nucleo interno Gag, con HA e NA montati sulla superficie. La sostituzione di Gag invece di influenza Matrix 1 (M1) dimostra la flessibilità di VLP Gag-based con glicoproteine virali non correlate, come la RSV F e potenzialmente altri. In alternativa, la sintesi di CHIKV utilizza una cassetta gene strutturale, che esprime le componenti necessarie per SVP autoassemblaggio, con proteine CHIKV E presentati sulla superficie di un centro composto di proteina C. Questi due approcci dimostrano la flessibilità della sintesi VLP, che richiede proteine virali strutturali minime per assemblare da cellule transfettate.
Infine, mentre abbiamo presentato protocolli generali e Resul rappresentantets per l'espressione e la purificazione di H3N2, RSV, DENV, e CHIKV, queste procedure sono facilmente suscettibili per la generazione di VLP che utilizzano altre proteine virali. Queste procedure sono state utilizzate con successo dal nostro gruppo nella generazione di altri sottotipi di virus influenzali, tra cui H1, H5, H7 e virus. Inoltre, il singolo plasmide, PRM / E di progettazione utilizzato per la generazione di DENV SVP può essere adattato per la generazione di SVP per gli altri membri della famiglia flavivirus che includono West Nile virus e encefalite giapponese. Allo stesso modo, i metodi di produzione di VLP CHIK possono essere utilizzati per altri membri della famiglia Togaviridae, tra cui il venezuelano, Oriente, e virus encefalite equina occidentale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vogliamo riconoscere i membri precedenti del laboratorio Ross che hanno contribuito a ottimizzare il protocollo per la massima efficienza e rendimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
References
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