Summary
De cryosfeer biedt toegang tot bewaarde organismen die bleef onder het verleden omgevingsomstandigheden. Een protocol wordt gepresenteerd te verzamelen en te ontsmetten permafrost kernen van de bodem en ijs. De afwezigheid van exogeen DNA kolonies en suggereren dat microorganismen gedetecteerd vertegenwoordigt de theorie en minder contaminatie door boren of verwerking.
Introduction
De cryosfeer (bijv permafrost bodems, ijs eigenschappen, ijzige sneeuw, firn en ijs) biedt een kijkje in welke soorten organismen bleef onder het verleden omgevingsomstandigheden. Aangezien deze substraten tientallen kan zijn om honderden duizenden jaren oud, hun microbiële gemeenschappen, wanneer bewaard gebleven bevroren sinds de afzetting, weerspiegelen de oude milieu-omstandigheden. Om adequaat te analyseren deze ecosystemen en extract zinvolle biologische informatie van bevroren bodems en ijs, een goede inzameling en verwerking van de bevroren monsters nodig. Dit is van groot belang als het klimaat prognoses voor de 21e eeuw geven het potentieel voor een uitgesproken opwarming in arctische en sub-arctische gebieden 1. In het bijzonder, Interior Alaska en Groenland zullen naar verwachting op te warmen ongeveer 5 ° C en 7 ° C, respectievelijk in 2100 2,3. Dit zal naar verwachting grote invloed bodem en het aquatische microbiële gemeenschappen, en dus, aanverwantebiogeochemische processen. De warmere temperaturen en veranderde neerslag regime wordt verwacht dat permafrost afbraak in veel gebieden 2-5 kan leiden tot een dikkere, seizoen ontdooid (actieve) laag 6,7, het ontdooien van bevroren bodems, en het smelten van de massale ijs organen zoals initiëren gemalen ijs, ijs wiggen, en segregatie ijs 8. Dat zou dramatisch de biogeochemische attributen veranderen in aanvulling op de biodiversiteit van planten en dieren in deze ecosystemen.
Gletsjerijs en syngenetische permafrost sediment en ijs functies zijn gevangen chemische en biologische bewijs van een omgeving die wat daar woonde op het moment dat de functies gevormd. Bijvoorbeeld, in Binnenlands Alaska, zowel Illinoisan en Wisconsin jaar permafrost aanwezig zijn en deze permafrost in het bijzonder biedt unieke locaties daterend van modern tot 150.000 jaar voordat de huidige (YBP), die de biologische en geochemische bewijs van de Impa bevattenct van vroegere klimaatveranderingen op de biodiversiteit. Als gevolg van deze sedimenten geven een overzicht van de biogeochemie en de biodiversiteit gedurende vele duizenden jaren. Omdat het gebied heeft een lage sedimentatie tarieven en is nooit glaciated, ongestoorde monsters zijn toegankelijk voor het verzamelen en analyseren, ofwel boren verticaal in het bodemprofiel of boren horizontaal in tunnels. Wat nog belangrijker is, uitgebreide verslagen bestaan die vooral wijzen op de unieke biogeochemische kenmerken van permafrost in deze regio 9-14. Met name de toepassing van DNA-onderzoek om de aanwezigheid en de omvang van de biodiversiteit te schatten, zowel in bestaande en oude ijs en permafrost samples maakt verkenning van de koppeling van de oude milieu-omstandigheden en de habitat aan bezetting door specifieke organismen.
Eerdere studies hebben klimatologische effecten op zoogdieren, planten en micro-organismen uit monsters dating tot 50k YBP 11, 15-19 geïdentificeerd, hoewel elk onderzoek gebruik gemaakt van een different methodologie voor het verzamelen en ontsmetten van de permafrost of ijskernen. In sommige gevallen werden de boorkernen gesteriliseerde 16, 20-21, hoewel de specifieke methodologie niet duidelijk of vreemde nucleïnezuren ook werden uit de monsters. In andere studies, bacteriële isolaten 15 (bijvoorbeeld Serratia marcescens) en fluorescente microsferen 22 zijn gebruikt om de effectiviteit van zuiveringsmethoden meten.
Dit experiment was onderdeel van een groter onderzoek naar microbiële gemeenschappen van permafrost monsters die teruggaat tot ongeveer 40k YBP. De specifieke doelstelling van dit deel van het onderzoek was om met succes te ontsmetten ijs en permafrost kernen. Voor zover wij weten, is er geen methode het gebruik van oplossingen volgens vreemde nucleïnezuren en geassocieerde nucleasen verwijderen uit het buitenste gedeelte van de bevroren kernen geïntegreerd. Dit ondanks het feit dat deze oplossingen commonly gebruikt om laboratoriumapparatuur decontamineren voor moleculaire experimenten.
Zodra de kernen werden gedecontamineerd, werd genomisch DNA geëxtraheerd met behulp van protocollen ontwikkeld door Griffiths et al. 23 en towe et al. 24, gekwantificeerd onder toepassing van een spectrofotometer en verdund met steriel, DNA-vrij water tot 20 ng per reactie te bereiken. Bacteriële 16S rRNA genen werden geamplificeerd met primers 331F en 797R en sonde BacTaq 25 en Archaea 16S rRNA genen werden geamplificeerd met primers Arch 349F en Arch 806R en sonde TM Arch 516F 26 onder de volgende voorwaarden: 95 ° C gedurende 600 seconden, gevolgd door 45 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 57 ° C gedurende 60 sec en 72 ° C gedurende 25 sec met een laatste verlenging bij 40 ° C gedurende 30 sec. Alle qPCR reacties werden uitgevoerd in tweevoud. De 20 pi reactievolume inbegrepen 20 ng DNA, 10 uM primers, 5 uM van de sonde en 10 pl van het reactiemengsel qPCR. normen for bacteriën en archaea qPCR werden bereid met behulp van genoom DNA van Pseudomonas fluorescens en Halobacterium Salinarum, respectievelijk. Beiden werden gekweekt tot fase in te loggen. Plaattellingen uitgevoerd en DNA werd geïsoleerd uit de kweken. Genoom DNA werd gekwantificeerd met een spectrofotometer met de aanname van één en zes exemplaren van de 16S rRNA gen per genoom voor H. Salinarum en P. fluorescens, respectievelijk 27-28. Kopieaantallen van de bacteriën en archaea genen werden berekend op basis van de standaardcurve, log-getransformeerde om rekening te houden ongelijke verschillen tussen behandelingen, en beoordeeld door ANOVA.
Community samenstelling werd bepaald door het sequencen van het 16S rRNA-gen met behulp van stroom cellen en de brug versterking technologieën en analyseren van de gemeenschappen 'kwantitatieve inzichten in microbiële ecologie' (QIIME) 29. Vooruit en achteruit leest werden samengevoegd en vervolgens sequenties werden gefilterd, geïndexeerd,en vertegenwoordigers van hoge kwaliteit werden geselecteerd voor de novo operationele taxonomische eenheden (OTU) toewijzing door middel van sequentie-uitlijning met een referentie-database. Gealigneerde sequenties werden vergeleken met een afzonderlijke referentiedatabank voor taxonomische opdracht. Een phylum niveau OTU tafel werd opgericht om de algemene gemeenschap samenstelling te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. apparatuur Voorbereiding en Permafrost Core Collection
- Apparatuur voorbereiding en veldmonster verzamelen en bewaren gear
- Monteer vijzel voor het monster collectie door het plaatsen van de drive-adapter in de bovenkant van het vat en het draaien van de hendel om het te vergrendelen. Speld de adapter slang op de drive-adapter en pin de motor op de adapter buis. Plaats de messen op het vat.
- Draag lichte pakken, nitril handschoenen en maskers om verontreiniging om de monsters te verminderen. Draag oorbeschermers en een helm voor de veiligheid bij het binnenkomen Permafrost Tunnel (figuur 1).
- Ga de tunnel in en selecteer een locatie om de monsters (Figuur 1B) te verzamelen.
Opmerking: Voor verticale of horizontale boringen plaats, selecteert u een gebied waar kan worden aangetoond dat het materiaal is bevroren (bijvoorbeeld ijs of permafrost) bekend is, is er geen bekende grote wortel systemen, en er is geen bekende gravel. alles verwijderenlevend plantenmateriaal van het gebied voor het verzamelen van een monster. Als verticaal of horizontaal boren, selecteer een gebied dat is relatief vlak en toegankelijk met de vijzel. - Bereid een werkstation van de grond lagen een kunststof materiaal dat is gesteriliseerd met 70% isopropanol, DNA decontaminatie oplossing en RNase decontaminatie oplossing.
- Plaats een 10 cm diameter polyvinylchloride (PVC) pijp gesneden in de lengte op het werkstation om een trog te bieden aan de kernen in bezit als van de grondboor worden verwijderd. Ontsmet de PVC-buis met 70% isopropanol, DNA decontaminatie-oplossing, en RNase decontaminatie oplossing.
- In de buurt van de werkplek, ontsmetten de boor door te besproeien met 70% isopropanol, DNA decontaminatie-oplossing, en RNase decontaminatie oplossing. Verwijder oplossingen van de vijzel met een doekje.
- Ijs en permafrost kerncollectie en opslag
- Selecteer een gebied van de wand monster (zie 1.2.1Notitie).
- Ontsmet ongeveer 10 cm diameter van bevroren muur gebied schoon met 70% isopropanol, DNA decontaminatie-oplossing, en RNase decontaminatie oplossing.
- Verhoog de gedecontamineerd vijzel om het gebied van belang, dat deze loodrecht op het monster stippellijn beginnen boren in de gereinigde van de wand (figuur 1C, D).
- Haal de boor uit monstername omgeving. Koppel de vijzel van de motor en plaats de boor boven het steriele PVC pijp in de schone werkplek. Kantelen vijzel zorgvuldig zodanig dat de bevroren kernen glijden op de steriele PVC-buis (figuur 1E).
- Ontsmet handschoenen met 70% isopropanol, DNA decontaminatie-oplossing, en RNase decontaminatie oplossing.
- Pick-up het ijs en permafrost kernen met steriele handschoenen en plaats ze in steriele zakken.
- Plaats de kernen in een koeler of koude kamer tot ze worden verzonden of verwerkt.
- Ship de bevroren kernen middels droogijs te handhaven bij een temperatuur onder 0 ° C.
- Onmiddellijk slaan de kernen bij -80 ° C.
2. Permafrost and Ice Core Processing
- materiaal Voorbereiding
- Bereid steriele nucleïnezuur vrij zware aluminiumfolie, metalen rekken, glaswerk, metaal tang en glaswol door bakken in een oven bij 450 ° C gedurende 4 uur. Zet opzij deze materialen tot gebruik.
- Steriliseren 95% ethanol en ultrapuur water door het passeren van de oplossingen door een 0,22 pm filter.
- WINKEL ethanol oplossing bij -20 ° C en water bij 4 ° C.
- Steriliseren een plastic liniaal worden bespoten met 70% ethanol, DNA decontaminatie oplossing en RNase decontaminatie oplossing onmiddellijk afvegen na elke oplossing.
- Bacteriekweek Bereiding
- Bereid bouillon platen en Serratia marcescens groeien.
- Voor de bouillon, combineer 5 g tryptone, 1 g glucose, 5 g gistextract en 1 g kalium dibasisch en voeg gedestilleerd water tot 1 L. bereiken om platen te maken, voeg 15 g agar de bovenstaande mix. Voor medium en platen, de pH instellen op 7 en autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten.
- Bereid 1x fosfaat afgeslepen zoutoplossing (PBS) door het combineren van 8 g natriumchloride, 0,2 g kaliumchloride, 1,44 g dibasisch natriumfosfaat en 0,24 g monobasisch kaliumfosfaat en gedestilleerd water tot 800 ml te bereiken. Stel de pH tot 7,4 en voeg gedestilleerd water tot 1 L. Autoclaaf bereiken op 121 ° C gedurende 15 min.
- Inoculeren bouillon met een steriele lus door dompelen in de S. marcescens cultuur die eerder opgeslagen werd bevroren bij -80 ° C. Onder aseptische omstandigheden, seriële verdunde de cultuur door het toevoegen van 1 ml van de cultuur tot 9 ml PBS en handmatig keren de oplossing. Voeg 1 ml van deze verdunning met 9 ml PBS en de oplossing handmatig omdraaien. Herhaal dit nog acht keer, totdat een 10 -9 Dilutie wordt bereikt.
- Spreid de 10 -6, -7 10, 10 -8, 10 -9 en oplossingen op agarplaten door het verspreiden van 1 ml bouillon op de plaat en verspreiden met een mobiele spreader. Doe dit in drievoud per verdunning. Bewaar de oorspronkelijke cultuur bij 4 ° C.
- Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 24 uur. Tel het aantal kolonies tot het aantal cellen berekenen de oorspronkelijke cultuur. Opmerking: Het aantal kolonies in de oorspronkelijke cultuur is afhankelijk van de groeisnelheid van de bacteriën.
- Pipetteer 250 ul van de oorspronkelijke kweek in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis. Verdun oorspronkelijke cultuur met voldoende volume van de 1x PBS voegen zoals bepaald met kiemgetal in de vorige stap tot ongeveer 10 9 cellen / ml te verkrijgen. Pellet de cellen in een microcentrifugebuis door centrifugeren bij 2500 xg gedurende 10 min.
Opmerking: Het volume van 1x PBS is afhankelijk van de groeisnelheid van de bacteriën. - Steriel biohood, Pipet uit de bouillon en resuspendeer de cellen in 1 ml 1x PBS-buffer. Bewaren bij 4 ° C tot gebruik of ongeveer twee maanden.
- Op de dag van verwerking verdunnen S. marcescens kweek uit stap 2.2.7 door toevoeging van 1 ml van de oorspronkelijke S. marcescens cultuur 39 ml 1x PBS buffer in een 50 ml centrifugebuis.
- Bereid bouillon platen en Serratia marcescens groeien.
- Bereid koude ruimte voor core processing en bewaring gear
- Voorafgaand aan het koelen de koude kamer, schoon muren, vloeren en metalen tafel met een 1% bleekwater oplossing.
- Ingestelde temperatuur van de koelruimte tot ongeveer -11 ° C.
- Zodra de koude kamer de gewenste temperatuur heeft bereikt, slijtage lichte kostuums, nitril handschoenen en maskers om verontreiniging aan de koude kamer en de monsters te verminderen.
Opmerking: Twee correct gekleed personen nodig zijn voor deze procedure. - Breng de steriele materialen (bv, aluminiumfolie, metalen rekken, glaswerk, dienblad, S. marcescens cultuur, en microtome mes) en samples in de koude kamer en plaats op de steriele tafel.
- Permafrost en ijs core processing in een koude kamer faciliteit
- Plaats een permafrost kern op een steriele, nucleïnezuur vrij vel aluminiumfolie.
- Licht enten de buitenkant van de kern met de verdunde kweek van S. marcescens met een steriele schuimplug (figuur 2B).
- Plaats de kern van de steriele metalen rek die zit boven een lade.
- Steriliseer de stalen microtoom mes met 70% ethanol, DNA decontaminatie-oplossing, en RNase decontaminatie oplossing.
- Hebben individuele Een schone nitril met 70% ethanol, DNA decontaminatie-oplossing, en RNase decontaminatie oplossing en houdt de kern in een hoek van 45 ° boven de lade.
- Hebben individuele B voorzichtig schrapen ongeveer 5 mm van de buitenzijde van de gehele kern, met inbegrip van de uiteinden met behulp van de steriele mes terwijl bij particuliere A draait de kern na elke schrapen (
- Hebben individuele B pour-filter gesteriliseerde 95% ethanol over de kern zorgvuldig en snel, terwijl de persoon Een draait de kern als de oplossing wordt uitgegoten (Figuren 2D, 3C).
- Hebben individuele B de kern met filter gesteriliseerd water onmiddellijk te spoelen.
- Vervang de gebruikte metalen rek op dienblad met een nieuwe steriele metalen rek.
- Hebben persoon Een schoon te maken zijn of haar nitril met 70% ethanol, DNA decontaminatie-oplossing, en RNase decontaminatie oplossing en houdt de kern in een hoek van 45 ° boven de lade.
- Hebben individuele B spuit de hele kern met DNA decontaminatie-oplossing.
- Hebben individuele B de kern met filter gesteriliseerd water onmiddellijk te spoelen.
- Hebben individuele B spuit de hele kern met RNase decontaminatie oplossing.
- hebben IndividuB al onmiddellijk spoelen de kern met filter gesteriliseerd water.
- Plaats de kern op een steriel vel aluminiumfolie en licht wrap.
- Dooi buitenkern
- Plaats een steriele metalen rek over een steriele glazen schaal in een steriele biohood met laminaire stroming.
- Plaats twee agarplaten specifieke S. marcescens in de glazen schaal onder de steriele rek vloeistof te verzamelen van de kern (figuur 2E).
- Plaats de kern van de steriele metalen rek.
- Rekening met ongeveer 2-5 mm van het buitenoppervlak van de kern te ontdooien bij 23 ° C (gemiddeld zal dit gebeuren binnen ongeveer 10 min). Draai de kern ongeveer 90 ° verder 2 min.
- Zwabberen gehele oppervlak van de kern met behulp van een steriel pincet en steriele glaswol en het enten van twee agarplaten die specifiek zijn voor S. marcescens zwabberen van deze materialen op het oppervlak van de platen. Enten twee nieuwe platen met de oorspronkelijke cultuur gebruikt om de buitenkant van de dopekern, die werd blootgesteld aan lage temperaturen van de koude kamer.
- Meet buitenafmetingen van ontdooid cilindrische kern door het plaatsen van een steriel heerser in de buurt, maar de kern niet te raken.
- Plaats de kern in grote steriele zak en het op -80 ° C.
- Controleer op groei
- Incubeer agarplaten bij 23 ° C gedurende één week.
- Onderzoek agarplaten groei van S. marcescens kolonies.
- Als er geen zichtbare kolonies op de plaat, ga dan naar stap 2.5.3.
- Als kolonies verschijnen op de plaat, herhaal stap 2.1.1 in hoofdstuk 2 "Permafrost en ijskern processing".
- Het verkrijgen van de kern van de vriezer en aseptisch overbrengen naar een steriele zak.
- Bewaar de kern in een steriele zak bij 4 ° C gedurende ongeveer 24-48 uur om de gehele kern ontdooien.
3. Zorg deelsteekproef voor Nucleic Acid Extraction uit ijskernen en Permafrost
- Nucleïnezuur extractie uit ijskernen
- Meng de ontdooide materiaal uit de ijskern door voorzichtig schudden van de zak (figuur 2G).
- Giet het ontdooide materiaal in een steriele fles met een 0,22 urn filter onder vacuüm microorganismen verzamelen.
- Aseptisch verwijder het filter met steriel pincet en plaats deze in een steriele 2 ml keramische kraal buis (1,4 mm).
- Bewaar het filter bij -80 ° C.
- Nucleïnezuur extractie uit permafrost kernen
- Meng de ontdooide materiaal uit de permafrost kern door zachtjes te kneden de zak.
- Nadat de permafrost is goed gemengd, het verkrijgen van een subgroep van ongeveer 0,5 g bulk bodem met een steriele scoopula en plaats deze in een getarreerd steriele 2 ml kraal keramiek schroefdop buis (1,4 mm) die rechtop zit op een evenwicht.
- Store subsamples bij -80 ° C.
- Verkrijgen gravimetrische watergehalte van de monsters.
- Maatregel 10 g van de permafrost met een sterielee scoopula en plaats in een getarreerde tin op een evenwicht. Meet natte massa van de permafrost en tin.
- Incubeer permafrost in een oven ingesteld op 105 ° C gedurende 24 uur. Meet de droge massa van de permafrost en tin.
- Bereken de gravimetrische watergehalte door het aftrekken van de natte massa van permafrost van het drooggewicht van de permafrost en te delen door het drooggewicht van permafrost.
- WINKEL permafrost bij -80 ° C.
4. Uittreksel nucleïnezuren uit Permafrost en Ice Cores
- materiële voorbereiding
- Bereid amberkleurige flesjes oplossingen houden door behandeling met 0,1% diethylpyrocarbonaat (DEPC), incuberen O / N bij 37 ° C, en autoclaaf.
- Bereid 240 mM kaliumfosfaat bufferoplossing. 2. Voeg 5 g monobasisch kaliumfosfaat en 38,7 g dibasisch kaliumfosfaat. Pas uiteindelijke volume tot 500 ml door het toevoegen van steriel water.
- Bereid hexadecyltrimethylammoniumbromide (CTAB) extractie buffer door het oplossen van 4,1 g natriumchloride in 80 ml water langzaam toevoegen van 10 g CTAB onder verwarming en roeren. Pas uiteindelijke volume tot 100 ml door het toevoegen van steriel water.
- Voeg gelijke volumes fosfaatbufferoplossing en CTAB-buffer en filter gesteriliseerd met een 0,22 urn filter. Bedek fles met aluminiumfolie en bewaar bij kamertemperatuur.
- Bereid 1,6 M natriumchloride (NaCl) door het combineren van 9,35 g NaCl en 100 ml steriel water. 10 g polyethyleenglycol 8000 met de 1,6 M NaCl-oplossing en filter steriliseren. Bewaren bij 4 ° C.
- Nucleïnezuur extractie volgens een gemodificeerde versie van Griffiths et al. 22 en towe et al. 23
- Draag lichte pakken, nitril handschoenen en maskers. Schone laboratoriumruimte en pipetten met 70% ethanol, DNA decontaminatie oplossing en RNase decontaminatie oplossing.
- Verwijder deelmonster (filter uit ijskern of permafrost bodemmonster) in 2 ml kraal keramiek schroef-cap buis van -80 ° C vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur.
- Voeg 0,5 ml van hexadecyltrimethylammoniumbromide (CTAB) extractie buffer en vortex kort.
- Voeg 0,5 ml fenol-chloroform-isoamylalcohol (25: 24: 1) (pH 8) en schud buizen horizontaal gedurende 10 min met behulp van een vlakke plaat adapter op een vortexer.
- Na kraal-beating centrifugebuizen bij 16.100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Verwijderen waterlaag een nieuwe steriele buis van 1,5 ml en meng met een gelijk volume chloroform-isoamylalcohol (24: 1). Centrifugeer bij 16.100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Verwijderen waterlaag een nieuwe steriele 1,5 ml buis en voeg twee volumes van 30% polyethyleenglycol 8000 en 1,6 M NaCl. Incubeer gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Centrifugeer bij 16.100 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Was nucleïnezuur pellet met ongeveer 500 ul ijskoude 70% ethanol en centrifugeer bij 16.100 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Air droge pellet in een steriele biohood gedurende 2 uur. Resuspendeer in 50 ul DNase / RNase-vrij TE buffer (pH 8,0). DNA is klaar voor verdere toepassingen zoals PCR en qPCR.
- Bepaal de concentratie van DNA met een spectrofotometer.
- Verdun DNA met steriel, DNA-vrij water tot 20 ng per reactie te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De onderhavige methode kan worden gebruikt om ingevroren monsters uit verschillende milieus cryosfeer saneren van glacial ijs permafrost. Hier presenteren we data specifiek verzameld van ijs en permafrost monsters van de Engineering Research and Development Center - koude gebieden Research and Engineering Laboratory (ERDC-CRREL) Permafrost Tunnel gelegen in Fox, AK (figuur 1A en 1B). De Permafrost Tunnel zich ongeveer 110 m in de zijkant van Goldstream vallei en biedt toegang tot ijs rijke slib en alluvium 30-31. Monsters van een ijs wig en bevroren grond werden zorgvuldig verzameld in drievoud van de muren van de tunnel op 24 oktober 2014. Op het moment van de bemonstering, de temperatuur van de permafrost muur was -2,9 ° C. De monsters werden verzameld uit een ijswig functie ongeveer 27 meter van het portaal van de tunnel, en de bevroren grond op 35 m en 60 m vanhet portaal van de tunnel (figuur 1C en 1D). Speciale aandacht werd genomen tijdens de monstername om verontreiniging van het ijs en permafrost kernen (figuur 1E) te beperken. De bevroren kernen werden behandeld volgens onze decontaminatie protocol (figuur 2) en op droog ijs in Hanover, NH getransporteerd naar de CRREL bodemmicrobiologie laboratorium voor verwerking.
Alle kernen werden verwerkt met behulp van de in punt 2 beschreven met behulp van steriele microtoom messen en oplossingen (figuur 3A, B en C) protocol. Het doel van deze studie was te winnen uit endogene nucleïnezuren uit de bevroren monsters microbiële populaties die ten tijde dat het materiaal gedeponeerd bepalen. De sanering protocol werd beoordeeld door doping de kernen met een verdunde cultuur van Serratia marcescens en vervolgens onderzoeken van de Petri platen voor groei aftre van de kernen werden behandeld 31. Aangezien S. marcescens kolonies gaf aan dat de exogene micro-organismen goed uit het buitenste gedeelte van de kern verwijderd. Echter, zou de afwezigheid van kolonies niet aan of exogene DNA uit het buitenste gedeelte van de kern werd verwijderd. Daarom hebben we sequentie monsters van de ijskern te controleren op DNA uit Serratia sp. Omdat microbiële overvloed in de ijswig waarschijnlijk significant lager dan in de permafrost, gebruikten we de ijskernen te bepalen of DNA uit S. marcescens zou aanwezig zijn na de sanering protocol. Als de kernen niet goed waren gereinigd, dan sequenties die verband houden met S. marcescens wordt verwacht in de monsters aanwezig zijn. Figuur 4 toont de lage bacteriële diversiteit binnen de ijskern van 16S rRNA gensequentie resultaten. Sequenties in verband met Pseudomonas sp., Van de phylum Gammaproteobacteria, domineerde het ijs samples. Leden die behoren tot Planctomycetia waren ook aanwezig in het ijs, maar in mindere mate. Van bijzonder belang is het ontbreken van Serratia sp. In de sequencing resultaten suggereren dat de decontaminatie protocol die voldoende exogeen DNA.
Bovendien is er een bijkomend risico van contaminatie tijdens de extractie van nucleïnezuren. Negatieve extractie blanco gebruikt om verontreiniging onthullen van exogene nucleïnezuren. Het DNA uit de monsters en negatieve controles werden geamplificeerd met qPCR. qPCR gegevens bleek dat de permafrost herbergde bacteriën, archaea maar werden niet gedetecteerd in de permafrost (tabel 1). Succesvolle sanering werd voorts uit het gebrek aan bacteriële of Archaea amplicons in extractie blanks, in samenhang met positieve amplificatie van de controles, Pseudomonas fluorescens en Halobacterium salinarum (tabel 1). de abundkomstig metingen bleek dat er geen significante verschillen in bacteriële overvloed tussen verzameld op 35 meter van de portal kernen werden vergeleken met de 60 m kernen (tabel 1). Lopende onderzoek wordt uitgevoerd om te bepalen of microbiële gemeenschap samenstelling verschillend tussen de kernen was.
Figuur 1. Voorbeeld locaties in de buurt van Fairbanks, AK af. (A) Kaart van Fairbanks, AK (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html), (B) ERDC-CRREL Permafrost Tunnel, (C) collectie permafrost kernen met behulp van de SIPRE vijzel, (D) het licht van vijzel invoeren permafrost wand, en (E) de voorbereiding van de kern voor archivering. klik hier om een grotere ver te bekijkending van dit cijfer.
Figuur 2. Schematische voorstelling van ontsmetten bevroren materiaal. (A) Het bevroren materiaal (bijvoorbeeld ijskern of permafrost kern) wordt verwerkt in een koude kamer. (B) Het is doelbewust besmet met een bacteriecultuur. (C) De kern wordt geschoren met een steriele microtoom blad om de mm deel buitenste 5 te verwijderen. (D) Een reeks oplossingen worden aangebracht op het buitenste deel van het monster verder te ontsmetten. DDS geeft DNA ontsmettingsoplossing en RDS geeft RNase decontaminatie oplossing. (E) Door de kern in een steriele biohood gehouden bij kamertemperatuur, de buitenste 2-5 mm van het materiaal ontdooit. De vloeistof die druipt van het ijs of permafrost wordt opgevangen in Petri platen en de kern wordt afgestreken en vergulde om te controleren of de kern behoren werd ontsmet. (F en G) Als de groei van bacteriën niet wordt gedetecteerd, dan is de kern wordt ontdooid bij 4 ° C in een steriele container. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Behandeling van permafrost kernen in koelruimte onder steriele omstandigheden. (A) Verwijder de buitenste laag van de permafrost kern met een metalen microtoom mes door schrapen. (B) Een beter beeld van een schrapen. (C) Solution spoeling aan de buitenste laag van de kern te ontsmetten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Microbiële sequenties uit het ijswig monsters. Bar grafiek toont de gemiddelde relatieve overvloed aan bacteriële phyla aanwezig in de ijswig monsters door percentage. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Bacteriële overvloed in permafrost. QPCR resultaten met de overvloed aan bacteriën in de permafrost monsters en de bijbehorende extractie blanks. Van tabel worden gerapporteerd als gemiddelde ± standaardfout. n het aantal monsters. ND geeft niet gedetecteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De cryosfeer biedt toegang tot bewaarde organismen die bleef onder het verleden omgevingsomstandigheden. Hoewel de herstelde taxa de complete historische gemeenschap niet mogen vertegenwoordigen, kunnen die hersteld van de analyse van gletsjerijs en permafrost monsters waardevolle historische informatie over select perioden 15-16 opleveren. Zo heeft zinvolle biologische gegevens zijn ontleend aan ijs onderzoeken naar anaërobe activiteit in de Groenlandse ijskap 20 en permafrost studies onderzoeken koolstofcyclering processen als gevolg van de dooi 33 en hebben inzicht gegeven in schimmel diversiteit van permafrost in Beringia 16. Proper monstername en ontsmetting moet plaatsvinden voordat het uitvoeren van downstream-analyses om biologische gemeenschappen binnen deze bevroren materialen te onderzoeken. Hoewel deze stappen hebben belangrijke gevolgen voor de interpretatie van de gegevens, doen veel studies geen specifieke details over hoe de monsters w biedenere verzameld en verwerkt of afbeeldingen laten zien hoe de bevroren materialen te verwerken. Zo hebben eerdere studies het buitenste gedeelte van kernen met fluorescerende microbolletjes of bacteria 15 gedoteerd, hoewel de exacte concentratie van deze stoffen niet beschreven. Andere studies hebben decontaminatie protocollen in detail beschreven, maar is niet toegepast high throughput analyse van de doeltreffendheid van de methode 15, 32 testen. Daarom is een grondig onderzoek van intacte bacteriën en exogene DNA door groei op petrischalen en qPCR gebruikt om te bepalen of de monstername, bewaring, en analytische procedures waren steriel genoeg om microbiële gemeenschappen aanwezig in de bevroren materialen te identificeren.
Dit protocol is gewijzigd om genetisch materiaal van de belangstelling van de oude kernen met succes isoleren. Zorg, zoals het dragen van speciale uitrusting en ontsmetten leveringen moeten worden genomen tijdens de inzameling, verwerking en extraction van de kernen, omdat besmetting kon optreden op elk stap. Bovendien verzenden de stukjes met droogijs of een vergelijkbare koelmiddel is noodzakelijk omdat als de kernen ontdooien tijdens het transport, dan is er een grotere neiging dat verontreinigingen uit de buitenste zone van de kern kan migreren naar het binnenste gedeelte van de kern. Om de kans op besmetting verder te minimaliseren, kunt u overwegen het verzamelen van grotere kernen met een gemotoriseerde vijzel in plaats van een push-kern. We vonden dat de push kernen waren te klein om goed te decontamineren in stap schrapen. Alternatief kan een grotere hoeveelheid monster worden geëxtraheerd uit de grotere kernen, wat vooral belangrijk is voor monsters met een lage overvloed van biologisch materiaal. Bovendien, hoe groter volume verschaft meer ruimte voor fouten zodanig dat als Serratia marcescens kolonies waargenomen op platen en vervolgens de kern groot genoeg is om opnieuw verwerkt.
Verschillende materialen werden getest zo efficiënt te bepalenmethode om de kernen te ontsmetten. Bijvoorbeeld steriele aluminiumfolie, in plaats van glazen schalen of plastic materialen, toegelaten voor de kern op een steriel oppervlak snel en gemakkelijk worden geplaatst. Ook niet-traditionele voorzieningen zoals een metalen rek en een dienblad bleek gunstig om de uitwendige geschraapt materiaal weg van de kern accumuleren zijn, verminderen van het risico van het opnieuw vervuilen de kernen. In eerdere iteraties van het protocol, het schrapen plaatsgevonden op een vlak oppervlak, waardoor het risico op besmetting vergroot. Tenslotte steriele zakken in plaats van glazen schalen, bleken bevorderlijk voor het mengen en opslaan van de monsters te zijn.
Dit protocol is gericht op micro-organismen en nucleïnezuren te elimineren op het buitendeel van de bevroren kernen. Terwijl isopropanol en ethanol zijn doeltreffende desinfectiemiddelen, hebben ze geen nucleïnezuren te verwijderen. Daarom oplossingen die nucleïnezuren en geassocieerde enzymen uit het buitenste gedeelte van de kernen te verwijderen gebruikt. deze solugen worden vaak gebruikt om nucleïnezuren en geassocieerde nucleasen van laboratoriumschaal Materiaal verwijderen. Bij het testen van hun doeltreffendheid op laboratorium oppervlakken, RNA decontaminatie oplossing verwijderd meer exogene materialen dan de DNA-decontaminatie-oplossing 34. Gebruikt nucleasen om het buitenste gedeelte van de kern ontsmetten niet altijd de voorkeur omdat genetisch materiaal zich ook uit monsters kunnen worden verwijderd met een lage abundantie van een bepaald organisme. Vooral genetisch materiaal dat in permafrost en ijs gedurende langere tijd ondergaan afbraak. Omdat micro-organismen in een hoge overvloed in deze Alaskan monsters werd de bezorgdheid dat de oplossingen een groot deel van endogeen genetisch materiaal wegneemt sterk verminderd. Toch is voorzichtigheid geboden bij het gebruik van oplossingen die nucleasen bevatten om ervoor te zorgen dat de nucleïnezuren die van organismen in lage overvloed ernstig aangetast zijn of zullen niet worden verwijderd doorde nucleasen.
Aangezien S. marcescens kolonies op de petrischalen voorwaarde vertrouwen dat het intacte cellen van het buitenste gedeelte van de permafrost kernen werden verwijderd. Bovendien was de analyse van ijskernen die hetzelfde protocol ondergaan vertoonde geen detecteerbare sequenties verwant aan S. marcescens. Sequentie resultaten bleek dat alleen Pseudomonas werden gedetecteerd in deze monsters, hoewel beide Pseudomonas sp. en Serratia sp. zijn binnen de klasse Gammaproteobacteria. Tezamen vormen de afwezigheid van S. marcescens kolonies op Petri-platen en de afwezigheid van DNA amplicons van qPCR suggereren dat de bevroren kernen succes zijn ontsmet. Daarom werden de gedetecteerde micro-organismen waarschijnlijk ingebed in het bevroren materiaal, in plaats van besmetting door boren of verwerking van de kernen. Andere boortechnieken omvatten hydraulische boren in de bodem of ijs te dringen op grotere diepte. Hoewel deze methode would voordelig lage microbiële overvloed in deze oligotrofe omgevingen onderzoeken zijn, is het niet bekend of boorvloeistoffen succesvol zou verdwijnen. Bovendien, als high throughput sequentiebepaling is geen onderdeel van de stroomafwaartse analyse specifieke PCR reacties gericht S. marcescens moet worden gebruikt om het geëxtraheerde DNA te amplificeren.
De resultaten van dit voorbeeld dataset bleek dat intact genomisch DNA met succes werd geëxtraheerd uit de bevroren materialen. Bovendien zijn zowel de permafrost en ijswig koesterde bacteriën, zoals blijkt uit qPCR en sequencing, respectievelijk. De Alaskan discontinue permafrost uit deze studie bevatte vergelijkbare bacteriële nummers als permafrost in het Canadese hoge noordpoolgebied 35, hoewel de Alaskan monsters een orde van grootte minder bacteriën bevat dan de permafrost van het Tibetaanse Plateau in de provincie Qinghai, China 36 en actieve laag / permafrost bodems uit Nunavut, Canada 37. Vergelijkbaar met een ice wig verzameld in Nunavut, Canada 37, sequenties met betrekking tot Gammaproteobacteria, in het bijzonder Pseudomonas, die gemeenschappelijk aan de bodem en metabolisch divers zijn, domineerde de Alaskan ijswig in deze studie. In feite, Katayama et al. 11 geïsoleerde bacteriën in de phyla Actinobacteria, Bacilli, en Gammaproteobacteria van een van het ijs wiggen van de ERDC-CRREL permafrost Tunnel. Deze studies bevestigen de detectie van Gammaproteobacteria in deze studie. Planctomycetia, die gemeenschappelijk in het water levende monster zijn, werden ook gedetecteerd in het ijs wig. Deze organismen zijn gevonden in de actieve laag bodems boven permafrost in het noordoosten van Siberië 38, in aanvulling op de permafrost in de Tibetaanse Plateau in Qinghai, China 39.
Vele studies hebben de aanwezigheid van archaea, in het bijzonder methanogenen onderzocht, in permafrost, met het idee dat als permafrost ontdooit, methanogenen zal waarschijnlijk actiever geworden, contributing om de uitstroom van methaan in de atmosfeer 21, 33-34. Verrassend, archaea werden niet gedetecteerd in de Alaskan ijswig of permafrost monsters hoewel beide Euryarchaeota en Crenarchaeota in permafrost werden gevonden van de Canadese hoge noordpoolgebied 17 en methanogenen werden gevonden in de permafrost monsters van de Arctische toendra in Rusland 21.
Frozen materialen haven oude micro-organismen, die een record van biogeochemische processen die vele duizenden plaatsgevonden van jaren geleden. Deze biodiversiteit is van groot belang in het kader van de huidige opwarming van de aarde regime omdat micro-organismen die ooit werden beperkt in de cryosfeer omgeving bevrijd kan worden wanneer het bevroren materialen ontdooien. Om de biodiversiteit schuilgaat deze bevroren materialen vertrouwen te identificeren, moet de bevroren bodem en ijsmonsters wijze worden gehanteerd en gereinigd. Hier presenteren we een protocol voor buitenlandse cellen en DNA uit bevroren monsters ensu verwijderenopnieuw dat de gedetecteerde micro-organismen werden uit het materiaal, in plaats van besmetting door boren of verwerking van de kernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | ||
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | ||
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | ||
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | ||
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | |||
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22 µm | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 ml Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Solomon, S., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom. (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. University of Alaska Fairbanks, 29, 1125-1130 (2008).
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Pachauri, R. K., Meyer, L. A. , Intergovernmental Panel on Climate Change. Geneva, Switzerland. (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska's forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , New Hampshire. (1967).
- Sellmann, P. V. Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
