O objetivo deste protocolo é usar lipossomas catiônicos/aniônicos com um peptídeo neurodirecionado como um sistema de entrega do SNC para permitir que o siRNA atravesse o BBB. A otimização de um sistema de entrega para tratamentos, como o siRNA, permitiria mais opções de tratamento para príons e outras doenças neurodegenerativas.
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Artigo de método
Entrega de terapêutica siRNA para o SNC Usando catiônicos e aniônicos lipossomas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As doenças priônicas resultam do dobramento incorreto da proteína príon celular normal (PrPC) em um isômero resistente à protease anormal chamadoPrP Res. O surgimento de doenças priônicas em populações de animais selvagens e sua crescente ameaça à saúde humana levaram a maiores esforços para encontrar um tratamento para essas doenças. Estudos recentes encontraram vários compostos anti-príons que podem inibir o isômeroPrP Res infeccioso ou regular negativamente a proteína príon celular normal. No entanto, a maioria desses compostos não atravessa a barreira hematoencefálica para inibir efetivamente a formação dePrP Res no tecido cerebral, não visam especificamente o PrPC neuronal e geralmente são tóxicos demais para serem usados em animais ou humanos.
Investigamos se o siRNA entregue por via intravascular e direcionado ao PrPC neuronal é um composto anti-príon mais seguro e eficaz. Este relatório descreve um protocolo para produzir dois veículos de entrega lipossomal de siRNA e para empacotar e entregar siRNA PrP às células neuronais. Os dois veículos de entrega lipossomal são 1) formulação de lipossomas siRNA complexados usando lipossomas catiônicos (LSPCs) e 2) formulação de lipossomas siRNA encapsulados usando lipossomas catiônicos ou aniônicos (PALETS). Para os LSPCs, o siRNA carregado negativamente está eletrostaticamente ligado ao lipossomo catiônico. Um peptídeo carregado positivamente (RVG-9r [glicoproteína do vírus da raiva]) é adicionado ao complexo, que visa especificamente os complexos lipossomasmos-siRNA-peptídeo (LSPCs) através da barreira hematoencefálica (BBB) para neurônios que expressam acetilcolina no sistema nervoso central (SNC). Para o PALETS (siRNA terapêutico encapsulado em lipossomas endereçados a peptídeos), os lipídios catiônicos e aniônicos foram reidratados pelo siRNA PrP. Este procedimento resulta no encapsulamento do siRNA dentro dos lipossomas catiônicos ou aniônicos. Novamente, o neuropeptídeo RVG-9r foi ligado aos lipossomas para direcionar os complexos siRNA / lipossomas para o SNC. Usando essas formulações, entregamos com sucesso o siRNA PrP aos neurônios que expressam AchR e diminuímos a expressão de PrPC dos neurônios no SNC.
Introdução
Os priões são graves doenças neurodegenerativas que afectam o SNC. Doenças de priões, resultar a partir do enrolamento incorrecto da proteína prião celular normal, a PrP C, por um chamado isómero infecciosa PrP Res. Estas doenças afectam uma grande variedade de espécies, incluindo a encefalopatia espongiforme bovina em vacas, scrapie em ovinos, a doença emaciante crónica dos cervídeos, ea doença de Creutzfeldt-Jakob em humanos 1-3. Prions causar neurodegeneração que começa com a perda sináptica, e progride para vacuolização, gliose, perda neuronal, e depósitos de placas. Eventualmente, resultando na morte do animal / indivíduo 4.....
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Protocolo
Todos os ratos foram criados e mantidos no laboratório de Recursos Animais, credenciados pela Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório de Animal Care International, em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Estadual do Colorado.
1. Preparação de LSPCs
- Utilize uma mistura 1: 1 de DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamónio-propano): proporção de colesterol para LSPCs. Para obter uma preparação de lipossomas nmole 4, misturar 2 nmoles de DOTAP e 2 nmol de colesterol em 10 ml de uma solução 1: metanol num balão: clorofórmio 1.
- Evapora-se 9 ml de....
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Resultados
Para aumentar a eficiência de encapsulação dentro de siRNA PALETS aniónicos, o siARN foi misturado com protamina. Para determinar a melhor concentração de protamina para o ARNip, o siARN foi misturado com diferentes concentrações de protamina, a partir de 1: 1 a 2: 1 (Figura 3A). Houve um 60-65% siARN eficiência de encapsulação em lipos somas aniónicos, sem a utilização de protamina. As amostras com protamina: razões molares de ARNsi de 1: 1 a 1,5: 1 (133-266 nM) apresen.......
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Discussão
Este relatório descreve um protocolo para criar dois sistemas de administração específicas que transporta de forma eficiente siRNA para o SNC. Os métodos anteriores de entrega de siRNA para o SNC incluíram injecção de vectores de ARNsi / shRNA directamente para o cérebro, a injecção intravenosa de siRNA alvo, ou injecção intravenosa de complexos lipossoma-siRNA não-alvo. A injecção de vectores de ARNsi / shRNA no SNC não causar uma diminuição nos níveis de expressão da proteína alvo. No entanto, o siRNA / shRNA não se d.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer as seguintes fontes de financiamento: o Programa de Treinamento em Pesquisa Translacional de Doenças Infecciosas da CSU (ID:TRTP) e o programa de bolsas de pesquisa do NIH (R01 NS075214-01A1). Gostaríamos de agradecer ao laboratório Telling pelo uso de seu anticorpo monoclonal PRC5. Também gostaríamos de agradecer ao laboratório da Dow pelos lipossomas DOTAP e por compartilhar sua experiência na geração de lipossomas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lipídio DOTAP | Avanti Lipids | 890890 | |
| Colesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Clorofórmio | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Metanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gás | AirGas | ||
| Sucarose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extrusora | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, e 0.2 μ m filtros | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Sulfato de protamina | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquotado para uso único |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquotado para uso único |
| 40 μ m Filtro de células | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rato anti-rato CD16 / CD32 Fc bloco | BD Pharmigen | 553141 | |
| anticorpo anti-PrP (PRC5) | Proprietário - PRC |
Referências
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell<....
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Reimpressões e permissões
