Introduction
Os priões são graves doenças neurodegenerativas que afectam o SNC. Doenças de priões, resultar a partir do enrolamento incorrecto da proteína prião celular normal, a PrP C, por um chamado isómero infecciosa PrP Res. Estas doenças afectam uma grande variedade de espécies, incluindo a encefalopatia espongiforme bovina em vacas, scrapie em ovinos, a doença emaciante crónica dos cervídeos, ea doença de Creutzfeldt-Jakob em humanos 1-3. Prions causar neurodegeneração que começa com a perda sináptica, e progride para vacuolização, gliose, perda neuronal, e depósitos de placas. Eventualmente, resultando na morte do animal / indivíduo 4. Durante décadas, os pesquisadores investigaram compostos destinados a retardar ou parar a progressão da doença de príon. No entanto, os investigadores não encontraram qualquer uma terapia bem sucedida ou um veículo eficaz de entrega sistémica.
Endógena expressão da PrP C é necessária para o desenvolvimento de doenças provocadas por priões 5 C pode resultar num atraso ou melhoria da doença. Vários grupos de ratinhos transgénicos criados com níveis reduzidos de PrP C ou lentivectores injectados expressam shRNA directamente no tecido cerebral de murino para investigar o papel dos níveis de expressão da PrP C em doenças de prião. Estes investigadores encontraram reduzindo a quantidade de PrP C neuronal resultaram em travar a neuropatologia progressiva de doenças provocadas por priões e estendeu a vida dos animais 6-9. Nós relataram que os resultados do tratamento PrP C siRNA na depuração da PrP Res em células de rato neuroblastoma 10. Estes estudos sugerem que o uso de terapias para diminuir os níveis de expressão da PrP C, como pequeno ARN interferente (siRNA), que cliva o ARNm, podem suficientemente retardar a progressão de doenças provocadas por priões. No entanto, a maioria das terapias investigados para doenças de prião foram entregues de formas que não seria práticoem um ambiente clínico. Portanto, uma terapia de ARNsi necessita de um sistema de entrega sistémica, que é entregue por via intravenosa e orientada para o SNC.
Os investigadores estudaram a utilização de lipossomas como veículos de entrega de produtos de terapia génica. Os lípidos catiónicos e aniónicos são ambos usados na formação dos lipossomas. Os lípidos catiónicos são mais amplamente utilizados de lípidos aniónicos, porque a diferença de carga entre o lípido catiónico e do ADN / ARN permite o empacotamento eficiente. Outra vantagem de lípidos catiónicos é que eles atravessam a membrana celular mais facilmente do que outros lípidos 11-14. No entanto, os lípidos catiónicos são mais imunogénicos do que os lípidos aniónicos 13,14. Portanto, os pesquisadores começaram a mudar de usar catiônico para ani�icos lípidos em lipossomas. Produtos de terapia génica pode ser eficazmente embalado em lipossomas aniónicos, utilizando o sulfato de protamina péptido carregado positivamente, que se condensa moléculas de ADN / ARN 15-19. Desde Lipi aniônicaDS são menos imunogénicos do que os lípidos catiónicos podem ter tempos de circulação aumentados, e podem ser mais tolerados em modelos animais 13,14. Os lipossomas são direcionados para os tecidos específicos usando segmentação peptídeos que estão ligados aos lipossomas. O neuropeptídeo RVG-9R, que se liga a receptores nicotínicos da acetilcolina, tem sido utilizado para segmentar siRNA e lipossomas para o SNC 17-20.
Este relatório descreve um protocolo para produzir três veículos de entrega de siRNA, e para empacotar e entregar o siRNA para as células neuronais (Figura 1). complexos de siRNA-lipossoma-péptido (LSPCs) são compostos de lipossomas com o siRNA e RVG-9R peptídeo alvo electrostaticamente ligado à superfície exterior do lipossoma. Péptido dirigida lipossoma encapsulado terapêuticos siRNA (PALETS) são compostos de siRNA e protamina encapsulado no interior do lipossoma, com RVG-9R covalentemente ligado a grupos de PEG lípido. Usando os métodos abaixo para gerar LSPCs e PALETS, PrP C siARN diminui a expressão da PrP C até 90% em células neuronais, o que possui tremendo potencial para curar ou retardar o aparecimento da patologia da doença do prião substancialmente.
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Protocol
Todos os ratos foram criados e mantidos no laboratório de Recursos Animais, credenciados pela Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório de Animal Care International, em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Estadual do Colorado.
1. Preparação de LSPCs
- Utilize uma mistura 1: 1 de DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamónio-propano): proporção de colesterol para LSPCs. Para obter uma preparação de lipossomas nmole 4, misturar 2 nmoles de DOTAP e 2 nmol de colesterol em 10 ml de uma solução 1: metanol num balão: clorofórmio 1.
- Evapora-se 9 ml de clorofórmio: metanol solução usando N2 gasoso numa hotte. Evaporaram-se os últimos 1 ml de solvente em um exaustor durante a noite sem gás. Observar uma película fina de lípidos no fundo do frasco.
- Calor 10 ml de uma solução de sacarose a 10% a 55 ° C.
- Verter a solução de sacarose a 10% aquecida sobre a película fina de lípidos lentamente, isto é, 1 ml / min, enquanto a GEntly agitando o frasco. Manter a sacarose a 10% e com o balão de lípidos a 55 ° C, de modo que as moléculas de lípidos permanecem na fase de gel-líquido. De re-hidratação resulta em formação de vesículas multilamelares (MLV).
- Permitir lípidos para re-hidratar a 55 ° C durante pelo menos uma hora antes de dimensionar os lipossomas.
- Montar uma extrusora de acordo com as instruções do fabricante com 1,0 uM filtros ou usar filtros de seringa de 1,0 um para o dimensionamento.
- Adicionar 1 ml da suspensão de lipossomas aquecida para uma das seringas sobre o extrusor, e passar a suspensão entre as duas seringas 11 vezes. Certifique-se de que a suspensão se encontra na seringa oposto do que a seringa começando depois dos 11 passes.
- Tamanho dos lipossomas de novo através de 0,45 um 0,2 um, em seguida, filtros para gerar grandes vesículas unilamelares (LUV). Manter a suspensão de lipossomas aquecida para o dimensionamento mais fácil.
- Incubar 20 ul da suspensão de lipossomas de 4 nmol (200 uM) com 200 ul de uma solução 20 uM (4total de nmole) solução stock de ARNsi durante 10 min à temperatura ambiente.
- Incubar 80 ul de uma 500 uM (40 Total nmole) solução estoque RVG-9R com a solução / lipossoma ARNsi durante 10 min à TA. LSPCs deve ser utilizado o mais cedo possível, mas pode ser utilizado até várias horas após a preparação. LSPCs armazenar a 4 ° C, durante várias horas após a preparação.
2. Preparação de PALETS
- Usar um 55: 5 proporção molar de ambos os DSPE (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina):: 40 colesterol: DSPE-PEG ou DOTAP: colesterol: DSPE-PEG para PALETS. Para obter uma preparação de lipossomas nmole 4, misturar 2,2 nmoles de qualquer DSPE ou DOTAP, 1,6 nmol de colesterol e 0,2 nmoles de DSPE-PEG em 10 ml de uma solução 2: metanol num balão: clorofórmio 1.
- Prepare a suspensão de lipossomas exactamente como descrito no passo 1.1 e 1.2 acima. Rehidratar lipossomas DSPE em 10 ml de PBS 1x aquecida a 75 ° C, adição de 1 ml / min. Permitir lípidos para re-hidratar a 75 ° C durante pelomenos de 1 hora antes da calibragem.
- Tamanho da suspensão de lipossomas exactamente como descrito no Passo 1,6-1,8.
- Pipetar 20 ul de cada uma das suspensões de liposomas 4 nmol (200 ^ M) em alíquotas de uso único após DOTAP e DSPE lipossomas foram dimensionados, e liofilizar durante 30 min usando um secador de congelação de bancada (Figura 2).
- Incubar 200 ul de uma solução 20 uM de siRNA estoque (4 TOTAL nmole) com 1,4 mL de uma solução 26,6 M de sulfato de protamina durante 10 min à TA durante siARN que é para ser encapsulada em lipossomas DSPE paletes.
- Re-hidratar os lipossomas DOTAP PALETS com 200 ul de uma solução stock de 4 nmol de lipossomas re-hidratados ou siRNA DSPE PALETS com 201,4 ul da solução de / protamina siARN. Incubar solução de lipossoma / ARNsi durante 10 min à TA.
- Adicionam-se 10 ul de uma (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), solução de ácido 3- 1-etil-60 mM à solução de lipossoma / siRNA para tanto DOTAP e DSPE PALETS.
- Adicionam-se 10 ul de uma solução 150 mM de N-hidroxissulf (sulfo-NHS) para a solução de lipossomas / siRNA para tanto DOTAP e DSPE PALETS.
- Incubar o EDC e sulfo-NHS com a suspensão / lipossoma ARNsi durante 2 h à TA.
- Incubar 80 ul de uma 500 uM (40 Total nmole) solução estoque RVG-9R com o siRNA / lipossoma solução durante 10 min a RT de reticulação.
NOTA: A EDC / sulfo-NHS permite que o RVG-9R a ligação covalente aos lipídeos PEG. Use PALETS dentro de várias horas após a preparação. PALETS armazenar a 4 ° C, durante várias horas após a preparação. - Para determinar a eficiência de encapsulação de siRNA PALETS:
- Medir a concentração de ARNsi antes e após a adição de protamina e lipossomas utilizando um espectrofotómetro ajustado a 260 nm.
- Filtra-se o siARN não encapsulado a partir da suspensão de lipossomas siRNA / encapsulado utilizando filtros centrífugos de 50 kDa. Centrifugar a 1000 xg durante 20 min.
- Medir a concentração desiRNA não encapsulado no filtrado, e a concentração de ARNsi encapsulado no retentado usando um espectrofotómetro a 260 nm.
3. injectando ratinhos com LSPCs ou PALETS
- Expor os ratos para 5-10 min a uma lâmpada de calor para dilatar vasos.
- Anestesiar rato com um 2-3% isoflurano / oxigênio fluir 5-10 min antes da injeção, e durante a injeção. Confirmar anesthetization em que os animais não é mais ambulante e respirações ter abrandado, fazendo uma pitada dedo do pé. Posicione o mouse sobre as suas costas ou de lado para acessar a veia da cauda. Use pomada veterinário nos olhos de rato para evitar a secagem sob anestesia.
- Limpe / pulverização, a cauda, com 70% de EtOH e injectar 300 ul de LSPCs ou PALETS na veia da cauda do rato utilizando uma seringa de 26 L de insulina. Começam a injectar de modo distal para dentro da veia da cauda e mova proximalmente se a veia colapsos ou rupturas.
- Coloque rato em uma gaiola limpa até que ele mantém decúbito esternal. Não coloque mousar com outros companheiros de gaiola até que ele se recuperou totalmente. Ratos deve se recuperar em 5 a 15 min. Eles podem ser colocados sobre uma almofada de aquecimento ou sob uma lâmpada de calor para manter a temperatura corporal, se a recuperação é mais demorada. Os ratos devem ser cuidadosamente monitorizados para proteger contra sobre-aquecimento.
- Monitorar os animais de várias horas após a injeção para garantir a anestesia desgasta fora, e não há efeitos nocivos do tratamento. Permitir que as LSPCs ou PALETS a circular por pelo menos 24 horas.
4. Análise da expressão proteica através de Citometria de Fluxo
- Eutanásia ratos com uma taxa de fluxo de 20% de CO 2 durante 15 min.
- Dissecar metade de um hemisfério do cérebro, cortando a pele e crânio do rato com uma tesoura. Descascar metade de um hemisfério cerebral longe do crânio usando uma pinça ou o fim de um par de tesouras.
- Pressione metade de um hemisfério do cérebro de cada ratinho através de um filtro de células de malha de 40 um, usando 2,5 ml de tampão FACS (1x; PBS, 1% de soro bovino fetal, 10 mM de EDTA) num prato de Petri com o êmbolo de uma seringa.
- Lavar o filtro de células e uma placa de Petri com um adicional de 2,5 mL de tampão de FACS. Coloque a única suspensão celular num tubo cónico de 15 ml em gelo.
- Pipete 100 pi da suspensão de células únicas de 5 mL para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugar durante 5 minutos a 350 x g. Desprezar o pelete de células sobrenadante e ressuspender em 1 ml de tampão de FACS. Girar a 350 g durante 5 min. Repetir com mais 1 ml de tampão de FACS. Manter a suspensão de células em gelo.
- Incubar as células em 100 ul de 1: 100 de diluição de uma solução a 0,5 mg / ml de rato bloco anti-rato Fc em tampão FACS durante 30-60 min em gelo. Sedimentar as células e lava-se como na etapa 4.5. Manter a suspensão de células em gelo.
- Incubar as células em 100 ul de uma / 20 ug de anticorpo fluorescente contra ml rato PrP C em soro de ratinho a 7% em tampão de SCAF em gelo durante 30-60 min. Sedimentar as células e lava-se como na etapa 4.5. Manter a suspensão de célulasno gelo.
- Pellet e re-suspender as células em 1 ml de tampão de lise de RBC (1x PBS, 155 mM de NH4Cl, 12 mM de NaHCO3, 0,1 mM de EDTA) durante 1 min. Pellet como no passo 4.5 e ressuspender as células em 1 ml de tampão de FACS. Manter a suspensão de células em gelo.
- Analisar a expressão da PrP C utilizando um citómetro de fluxo, conforme descrito anteriormente 10. Portão de células a partir da população total de células viver. Portão PrP C + células a partir da população de células vivas para determinar IMF (intensidade de fluorescência mediana).
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Representative Results
Para aumentar a eficiência de encapsulação dentro de siRNA PALETS aniónicos, o siARN foi misturado com protamina. Para determinar a melhor concentração de protamina para o ARNip, o siARN foi misturado com diferentes concentrações de protamina, a partir de 1: 1 a 2: 1 (Figura 3A). Houve um 60-65% siARN eficiência de encapsulação em lipos somas aniónicos, sem a utilização de protamina. As amostras com protamina: razões molares de ARNsi de 1: 1 a 1,5: 1 (133-266 nM) apresentaram 80-90% de encapsulação de siRNA. As razões molares acima de 1,5: 1 resultou na precipitação de complexos de / protamina de ARNip. Estes complexos precipitados não foram encapsulados em lipossomas aniónicos. Após a adição de protamina para o siARN havia uma ligeira queda na concentração do siARN, em função da diluição; No entanto, a concentração permaneceu estável após a adição de protamina (Figura 3B). Depois de filtrar os lipossomas com 50 filtros kDa, 90-95% do siARNfoi associado com o retentado lipossoma, enquanto 5-10% do siARN foi "livre" no filtrado. Nenhuma siARN foi detectada em protamina ou lipossomas apenas amostras (Figura 3C).
Para determinar o efeito de LSPCs in vivo, os ratinhos de tipo selvagem foram tratadas com LSPCs durante 24 horas. PrPC níveis de ratinhos de tipo selvagem tratados com LSPCs expressão foram comparados com os ratinhos tratados com PBS 1x e knockout PrP (PrP KO) (Figura 4). Análise citométrica de fluxo da PrP C no cérebro de ratinhos tratados com LSPCs mostrou uma diminuição nos níveis de PrP C (Figura 4A e 4B). Numa experiência, todos os ratinhos apresentaram redução de 80-90% dos níveis da PrP C, perto de níveis PrP C que foram observados nos ratinhos KO PrP (Figura 4A). Os ratinhos tratados com LSPCs em duas experiências independentes mais mostraram uma redução de 40-80% da PrP C </ sup> níveis (Figura 4B). Do total de LSPCs ratinhos tratados (n = 14), houve apenas um ratinho tinha nenhuma resposta aos LSPCs.
Figura 1:. Visão geral do protocolo para gerar palets / LSPCs e entrega siRNA via intravenosa para o SNC de ratos Os lipossomas foram gerados através do método thin hidratação do filme lipídico. A PrP C siARN foi então ligado com os lipossomas, quer através de uma interacção electrostática, ou por encapsulação. Os PALETS ou LSPCs foram concluídas pela adição do CNS peptídeo alvo RVG-9R. Após a montagem, as PALETS / LSPCs foram injetadas nas veias da cauda de camundongos, e 24 horas após o tratamento expressão PrP C foi avaliada por meio de citometria de fluxo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Protocolo do lípido Thin Film Método de hidratação para gerar DSPE lipossomas para o veículo de entrega PALETS Os lipidos foram dissolvidos e misturados em uma mistura de clorofórmio:. Solução de metanol, o qual foi evaporado para gerar um filme de lípido seco. O filme de lípido seco foi ressuspenso em PBS 1x para criar vesículas multilamelares (MLVs). MLVs foram, em seguida, de tamanho uniforme utilizando um extrusor para gerar as LUV. As LUV pode então ser usado em suspensão, ou liofilizada em alíquotas de uso único. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Eficiência de encapsulamento de siRNA em DSPE PALETS u Sulfato de Protamina cante. (a) cerca de 60-65% do siARN foi encapsulado, sem a adição de protamina. Com a adição de protamina, houve uma eficiência de encapsulação de 90%, entre 1: 1 e 1,5: 1 de protamina: rácio de siRNA. (B) Depois de filtrar os lipossomas a partir de qualquer siRNA livre, 90% do siARN foi encontrada na fracção lipossomal, enquanto que 5-10% de siRNA não encapsulado foi encontrado no filtrado. (C) protamina e lipossomas única soluções são livres de siRNA encapsulado. Cerca de 60-65% de ARNip foi encapsulado dentro de lipossomas DSPE sem a utilização de protamina. Com a utilização de protamina a uma concentração de 186,2 nM, cerca de 90% do siARN foi encapsulado dentro dos lipossomas DSPE. As barras de erro indicam SEM. **** Indica P <0,0001. * Indica P <0,01. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Representativas Análise de citometria de fluxo de células cerebrais Suspensões 24 horas após o tratamento com LSPCs LSPCs foram injectados na veia da cauda de ratinhos de tipo selvagem e os cérebros foram colhidas 24 horas mais tarde. O PBS foi utilizado como controlo do tratamento, e um ratinho KO PrP foi utilizado como um controlo para níveis de PrP C. Os ratinhos (A) tratadas com LSPCs mostrou uma diminuição significativa dos níveis de PrP C em comparação com o controlo de STF, que mostra os níveis de tipo selvagem de PrP C. Os LSPCs camundongos tratados apresentaram níveis PrP C próximo ao de um rato PrP KO. (B) dados acumulados a partir de três experiências independentes, utilizando o mesmo protocolo de tratamento 24 h mostrou a quantidade relativa de PrP C em PBS de tipo selvagem e ratinhos tratados com LSPCs. Nos três experimentos, os ratos tratados com LSPCs shocasar reduções significativas nos níveis de PrP C em comparação com os controlos de tipo selvagem PBS. As barras de erro indicam SEM. *** Indica P <0,0003. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este relatório descreve um protocolo para criar dois sistemas de administração específicas que transporta de forma eficiente siRNA para o SNC. Os métodos anteriores de entrega de siRNA para o SNC incluíram injecção de vectores de ARNsi / shRNA directamente para o cérebro, a injecção intravenosa de siRNA alvo, ou injecção intravenosa de complexos lipossoma-siRNA não-alvo. A injecção de vectores de ARNsi / shRNA no SNC não causar uma diminuição nos níveis de expressão da proteína alvo. No entanto, o siRNA / shRNA não se difunde livremente através do CNS. Além disso, estas injecções resultar em dano para o tecido nervoso 6-9 adjacente. A injecção intravenosa de siRNA alvo também resulta em redução da proteína alvo. No entanto, a maior parte do siRNA é degradado por 20 proteínas séricas. Por fim, a injecção intravenosa de lipossomas-siRNA não segmentados complexos resulta no aprisionamento do siARN no fígado e degradação pelo sistema de fagócitos mononucleares 21. A entrega de siRNAveículos descritos acima, e LSPCs PALETS, fornecer um sistema de administração mais segura, mais eficaz, e eficiente do que os métodos anteriores, fornecendo siARN directamente ao SNC. Os LSPCs e os PALETS também são capazes de transportar outras drogas de moléculas pequenas para o SNC.
PALETS ou LSPCs deve ser usado dentro de algumas horas após a montagem. Caso contrário, existe um risco de se tornar o siRNA não-funcional / degradada. O outro passo crítico que não pode ser interrompido / interrompido é a preparação e execução da suspensão de células para citometria de fluxo. É importante a realização de citometria de fluxo no mesmo dia em que a suspensão de células é preparado, uma vez que a suspensão contém células vivas que precisam ser vivo para a análise.
Existem algumas etapas no protocolo que pode ser alterada dependendo se os LSPCs ou PALETS vai ser utilizado in vitro ou in vivo, em que pequena molécula de droga é carregada para as LSPCs ou PALETS, e no trabalhopreferência tória. Primeiro, as razões molares dos lípidos LSPCs PALETS e pode ser optimizado para outras aplicações. No entanto, fosfatidiletanolamina (PE em DSPE) hidrata quando mal utilizado a uma 60% peso / peso ou superior. Quando utilizada a estas concentrações mais elevadas, as moléculas de DSPE irá agregar umas com as outras e formar uma massa insolúvel de lípidos. Esta massa de lípidos não é capaz de encapsular siARN. Se N 2 gasoso não está disponível, a mistura de lípidos pode ser seca utilizando evaporação. A evaporação demora cerca de 3 dias, e deve ser realizada num exaustor de fumos, devido à utilização de metanol e clorofórmio. Neste protocolo, a película fina de lípidos foi ressuspenso com 1x PBS, mas também pode ser ressuspenso com outros tampões de hidratação. Outros tampões incluem água, 10% de sacarose, ou qualquer outro tampão aquoso. A escolha do tampão de re-hidratação é dependente do uso a que se destinam dos lipossomas e o agente a ser encapsulado dentro do lipossoma 22,23. O tampão de hidratação deve ser mantida acima do gel liqtemperatura de transição de cristal uid (Tc ou Tm) dos lipidos ou os lipossomas não vai hidratar adequadamente. No protocolo descrito, os lipossomas foram suspensas uniformemente dimensionados utilizando um extrusor. No entanto, os lipossomas também podem ser dimensionados utilizando filtros de seringa ou sonicação. Os mesmos tamanhos de poros de filtro utilizados para a extrusora pode ser utilizada como filtros de seringa. Além disso, a suspensão de lipossomas pode ser redimensionado após hidratação com a solução de siRNA. No entanto, observou-se uma perda de ARNip a partir de lipossomas dimensionados quando pela extrusora, após o passo de hidratação (dados não publicados).
Uma vez que o papel biológico do PrP C ainda não é compreendido 5, é possível que possa haver alguns efeitos deletérios produzidos pela redução dos níveis de PrP C. No entanto, porque os ratos deficientes em proteína prião desenvolver, comportam-se, e a idade, normalmente 24, é provável que estes efeitos deletérios ou seria menor ou não visivelmente aparente. Além disso, siRNA knockdown da PrP <sup> expressão C não iria abolir completamente a expressão da proteína e é completamente reversível, sem possibilidade de oncogênese viral, ao contrário lentivector RNAi 23.
Limitações com os sistemas de entrega incluem a redução da absorção de PALETS aniônicos em membranas biológicas, e a imunogenicidade de LSPCs devido aos lipídios catiônicos. Se é observada imunogenicidade dos LSPCs, PALETS pode ser utilizado como uma alternativa. absorção reduzida de PALETS aniónicos em membranas biológicas aniónicos podem ser reduzidas mediante a utilização PALETS catiónicos, ou por reformulação PALETS aniónicos com uma mistura de lípidos catiónicos e aniónicos.
Neste relatório, a redução da PrPC varia muito de mouse para mouse. Essa variação poderia ser devido a uma variedade de factores: a variação entre os ratinhos, o pequeno diâmetro de veias em ratinhos, ou degradação de siRNA. A utilização de ratinhos consanguíneos deve eliminar a maior parte da variabilidade entre ratos, mas a variação é sempre possível, mesmocom ratinhos consanguíneos. Além disso, os ratos têm muito pequenas veias em comparação com outros modelos animais. Assim, a injecção de um grande volume para as veias de ratos pode ser problemático. Recomendamos praticar injeções antes de tentar injetar PALETS ou LSPCs. No entanto, mesmo com a prática, por vezes, ainda leva um par de injeções para obter todo o volume de palets / LSPCs no rato, e a veia pode desabar a qualquer uma dessas injeções. Assim, um mouse pode receber todo o volume de palets / LSPCs, enquanto outro mouse apenas pode receber 75-90% do volume de palets / LSPCs.
Outras possíveis fontes de variação incluem o tempo de circulação e a degradação do siRNA por proteínas do soro. Os palets / LSPCS pode circular mais tempo antes de chegar ao cérebro em um rato em relação ao outro, o que poderia explicar a variação. Nós só permitiu LSPCs a circular durante 24 h antes de a eutanásia ratos na experiência acima. Se o tempo de circulação está a causar a variação, em seguida, aumentando a Circultempo de ração para além de 24 horas deve reduzir alguma variação. Mesmo que empacotar o siRNA com as paletes / LSPCs, há sempre a chance de degradação do os veículos de entrega de siRNA e / ou. Como mencionado anteriormente, os lípidos catiónicos são ligeiramente imunogénico. Assim, se as células imunitárias dentro da corrente sanguínea são atacando os veículos, em seguida, seria necessário mais tempo para os veículos a serem entregues para o cérebro ou os veículos que poderia tornar-se degradada. Mudar de lipídios catiônicos para ani�icos PALETS pode ajudar a reduzir o tempo de circulação lenta ou degradação ao usar lipídios catiônicos.
O péptido RVG-9R transporta os LSPCs e paletes em qualquer célula dentro do sistema nervoso central que contém os receptores de acetilcolina nicotínicos. Isto inclui ambas as células neuronais células microgliais e astrócitos 26. Para PALETS ou LSPCs ser um tratamento eficaz para doenças de priões, que é importante para atingir todas as células que contribuem para a patogénese do prião. Células neuronais contêm a maioria da PrP C 27,28. Segmentação células neuronais e reduzindo a expressão das células PrP C pode resultar em uma diminuição da patogênese prião. No entanto, as células neuronais não são o único tipo de célula que contribui para a doença do prião. Os astrócitos têm sido implicados na replicação de priões 29,30. Portanto, não só é importante para direcionar células neuronais, mas também alvo astrócitos para reduzir prion patogênese.
Os sistemas de entrega aqui descritos são passíveis de várias estratégias de optimização que os tornam adequados para uma vasta gama de aplicações de doença. LSPCs PALETS e são capazes de transportar qualquer pequena molécula de droga para o sistema nervoso central, não só siARN, que dá os veículos o potencial para o tratamento de mais do que apenas as doenças neurodegenerativas. PALETS LSPCs e poderia ser utilizada para tratar qualquer doença que afectado cérebro, dependendo da droga de molécula pequena carregados nos veículos. Além disso, alterando o péptido alvo pode permitir que os veículos de entrega para entregar fármacos de moléculas pequenas, um subconjunto específico das células dentro do sistema nervoso central, em vez de qualquer célula que tem receptores de acetilcolina. PALETS e LSPCs representam um romance, sistema de entrega mais eficiente e flexível para medicamentos de pequenas moléculas para o tratamento de doenças que afetam o sistema nervoso central.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
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