la mutagenèse du gène de ciblage est maintenant possible dans une large gamme d'organismes en utilisant des techniques de montage du génome. Ici, nous démontrons un protocole pour la mutagenèse du gène ciblé utilisant l' activateur de la transcription comme nucléases effectrices (Talens) dans Astyanax mexicanus, une espèce de poisson qui comprend les poissons de surface et cavefish.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Identifier les allèles des gènes sous-jacents au changement évolutif est essentiel pour comprendre comment et pourquoi l’évolution se produit. À cette fin, de nombreux travaux récents se sont concentrés sur l’identification de gènes candidats pour l’évolution des traits chez une variété d’espèces. Cependant, jusqu’à récemment, il a été difficile de valider fonctionnellement des gènes candidats intéressants. Des outils récemment développés pour le génie génétique permettent de manipuler des gènes spécifiques dans un large éventail d’organismes. L’application de cette technologie dans des organismes pertinents pour l’évolution permettra d’obtenir un aperçu sans précédent du rôle des gènes candidats dans l’évolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) est une espèce de poisson avec des formes habitant à la surface et dans des grottes. De multiples lignées indépendantes de formes cavernicoles ont évolué à partir de poissons de surface ancestraux, qui sont interfertiles les uns avec les autres et avec les poissons de surface, permettant d’élucider la base génétique des traits des grottes. A. mexicanus a été utilisé pour un certain nombre d’études évolutives, y compris l’analyse de liaison pour identifier les gènes candidats responsables d’un certain nombre de caractères. Ainsi, A. mexicanus est un système idéal pour l’application de l’édition du génome afin de tester le rôle des gènes candidats. Ici, nous rapportons une méthode d’utilisation de nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN) pour faire muter des gènes dans la surface d’A. mexicanus. L’édition du génome à l’aide de TALEN chez A. mexicanus a été utilisée pour générer des mutations dans les gènes de pigmentation. Cette technique peut également être utilisée pour évaluer le rôle des gènes candidats pour un certain nombre d’autres traits qui ont évolué dans les formes grottes d’A. mexicanus.
Introduction
Comprendre la base génétique de l'évolution caractéristique est un objectif de recherche critique des biologistes évolutionnistes. Des progrès considérables ont été accomplis dans l' identification des loci sous - tendent l'évolution des traits et d' identifier des gènes candidats au sein de ces loci (par exemple 1-3). Cependant, le test fonctionnel du rôle de ces gènes est restée difficile que de nombreux organismes utilisés pour l'étude de l'évolution des traits ne sont actuellement pas génétiquement traitable. L'avènement des technologies de l'édition du génome a considérablement augmenté manipulabilité génétique d'un....
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Protocole
Toutes les procédures d'animaux étaient en conformité avec les lignes directrices des Instituts nationaux de la santé et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Université de l'Iowa et l'Université du Maryland.
1. TALEN Conception
- Entrée souhaitée séquence cible à un site Web de conception TALEN. (Par exemple: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Entrée choisie longueurs de tableau entretoise / répétition.
- Copiez la séquence génomique dans la case "Séquence".
- Dans l&....
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Résultats
Talen paire injections entraînent dans la liaison des DRV à nucléotides d'ADN spécifiques et donc dimérisation des domaines FokI, entraînant des cassures double brin 39 qui peuvent être réparés par l' extrémité non homologue de jonction (NHEJ). NHEJ introduit souvent des erreurs qui se traduisent par des insertions ou délétions (indels). Indels peuvent être identifiés par l'amplification de la région entourant le site cible TALEN et de digérer l'amplic.......
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Discussion
De grands progrès ont été réalisés ces dernières années dans la compréhension de la base génétique de l'évolution des traits. Alors que les gènes candidats qui sous - tendent l'évolution d'un certain nombre de traits ont été identifiés, il est resté difficile de tester ces gènes in vivo en raison de l'absence de traçabilité génétique des espèces les plus intéressantes évolutionnaire. Nous rapportons ici une méthode pour l' édition du génome dans A. mexicanus, une espèce utilisée pou.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été financé par le Département de génétique, de développement et de biologie cellulaire et de l'Iowa State University et par NIH EY024941 (WJ) .Dr. Jeffrey Essner a fourni des commentaires sur le manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Thermocycleur | |||
| Station | |||
| Appareil | |||
| Extracteur | |||
| Nanodrop | |||
| Name | Entreprise < | strong>Numéro de catalogue | Comments |
| Supplies | |||
| Remarque : Pour autant que nous le sachions, les fournitures de différentes sociétés peuvent être utilisées, sauf indication | |||
| Golden Gate TALEN et TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (granulé) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Microbiologie Support : LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 en 50 % EtOH | Teknova (commandé via Fisher) | 50-843-314 | |
| Dichlorhydrate de spectinomycine, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super ampicilline (1 000x solution) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, prête à l’emploi | Thermo Sci Fermentas Inc (commandée auprès de Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Boîtes de Pétri | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (commandée auprès de Fisher) | 50-812-203 | Utiliser BsaI, et non BsaI-HF (comme décrit dans le protocole Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit) |
| BSA | New England Biolabs | fourni avec des enzymes de | |
| 10x tampon T4 ligase | Promega (commandé par Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (commandé par Fisher) | PRM7123 | D’autres Taq peuvent être utilisés, mais la réaction doit être ajustée en conséquence |
| Kit de ligature rapide | New England Biolabs (commandé via Fisher) | 50-811-728 | Nous utilisons Quick Ligase pour toutes les réactions d’assemblage TALEN |
| One Shot TOP10 Chimiquement compétent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | D’autres cellules chimiquement compétentes ou des cellules compétentes faites maison peuvent être utilisées |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (commandé via Fisher) | FERER0451 | |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (commandé via Fisher) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Le kit Qiagen doit être utilisé pour la préparation initiale du plasmide (comme décrit dans le protocole du Golden Gate TALEN et du TAL Effector Kit) |
| QIAquick PCR | Purification Kit Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | F-3119-125 | |
| Sac I | Promega (commandé par Fisher) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription Kit | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Sample Loading Dye ; | Ambion (commandé par Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (commandé par Fisher) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Verre sodocalcique jetable Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips pour micro-injecteur Femtojet | Eppendorf (commandé chez Fisher) | E5242956003 | |
| Hydroxyde de sodium | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
Références
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mut....
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