ゲノム編集中アステュアナクスmexicanus使用して転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）

Summary

遺伝子標的化突然変異誘発は、ゲノム編集の技術を使用して、生物の幅広いことが可能です。ここで、我々はアステュアナクスmexicanus、表面の魚や洞窟魚が含まれて魚の種におけるエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）などの転写活性化因子を用いて標的遺伝子の突然変異誘発のためのプロトコルを示しています。

Abstract

進化的変化の根底にある遺伝子の対立遺伝子を特定することは、進化がどのように、そしてなぜ起こるのかを理解するために不可欠です。 この目的のために、最近の多くの研究は、さまざまな種における形質の進化のための候補遺伝子を特定することに焦点を当てています。 しかし、最近まで、興味深い候補遺伝子を機能的に検証することは困難でした。 近年開発された遺伝子工学のツールにより、さまざまな生物の特定の遺伝子を操作することが可能になりました。 この技術を進化に関連する生物に応用することで、進化における候補遺伝子の役割について前例のない洞察が可能になります。 Astyanax mexicanus(A.mexicanus)は、表層生物と洞窟生物の両方の形態を持つ魚の一種です。 洞窟に生息する形態の複数の独立した系統は、互いに干渉し、表面の魚と干渉する祖先の表層魚から進化し、洞窟形質の遺伝的基盤の解明を可能にしました。 A. mexicanusは、多くの形質に関与する候補遺伝子を特定するための連鎖解析を含む、多くの進化研究に使用されてきました。 したがって、A. mexicanusは、候補遺伝子の役割をテストするためのゲノム編集の応用に理想的なシステムです。 ここでは、転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ(TALENs)を用いて、A. mexicanus表面の遺伝子を変異させる方法を報告する。 A. mexicanusのTALENを用いたゲノム編集は、色素沈着遺伝子の突然変異を生成するために利用されています。 この手法は、A. mexicanusの洞窟型で進化した他の多くの形質の候補遺伝子の役割を評価するためにも利用できます。

Introduction

形質進化の遺伝的基礎を理解することは、進化の生物学者の重要な研究目標です。かなりの進歩は、形質の発生の根底にある遺伝子座を同定し、（実施例^1-3の場合）、これらの遺伝子座内の候補遺伝子を特定してなされました。形質の進化を研究するために使用される多くの生物は現在、遺伝的に扱いやすいではありませんしかし、機能的にこれらの遺伝子の役割をテストすることは困難なままです。ゲノム編集技術の出現が大幅に広範囲の生物の遺伝的操作性を増加しています。転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）とクラスタ化された定期的interspaced短いパリンドロームリピート（CRISPRs）は、（例えば^、4月11日のために）多数の生物の遺伝子の標的に変異を生成するために使用されてきました。進化的に関連したシステムに適用されるこれらのツールは、進化生物学者は進化の遺伝的基礎を勉強方法に革命をもたらす可能性を秘めています。

アステュアナクスのmexicanusは、2つの形態で存在する魚の種である：川に生息する表面形状（表面の魚）と複数の洞窟住居形態（洞窟魚）A. mexicanusの洞窟魚は^（12に概説されている）表面の魚の祖先から進化しました。洞窟魚の集団味蕾と頭蓋neuromastsの数を増加させ、色素沈着の減少または損失を目の損失を含む形質の数を進化させてきた、そのような学校教育の....

Protocol

すべての動物の手順は、国立衛生研究所のガイドラインに従った、アイオワ州立大学、メリーランド大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

1. TALENデザイン

1. TALEN設計ウェブサイトに入力された所望の標的配列。 （例： https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ）。入力は、スペーサ/リピート配列の長さを選択しました。
   1. 「シーケンス」と表示されたボックスの中にゲノム配列をコピーします。
   2. 「カスタムスペーサー/ RVD長さの提供」タブ内のスペーサーの長さと配列の長さを選択します。
      注：15塩基対のスペーサーの長さとうまく15-17ワークの配列の長さを繰り返し、アセンブリはあまり複雑にします。
2. TALENのペアを選択します。ユニークな制限酵素部位を中心に設計TALENのペアは、消化制限酵素によって遺伝子型決定を可能にPCR産物。
3. デザインプライマーは、プライマー3 ^30-32としてウェブサイトを使用してTALEN標的部位の周囲のゲノム領域を増幅しました。制限酵素を用いて遺伝子型決定するとき、設計プライマーは、一度だけ制限酵素部位を含む領域を増幅し....

Results

TALENペア注射は、非相同末端結合（NHEJ）を介して修復することができる二本鎖休憩³⁹で、その結果、特定のDNAヌクレオチドとRVDSの結合、したがってのFokIドメインの二量体化につながります。 NHEJは、多くの場合、挿入または欠失（インデル）につながるエラーを導入しています。インデルはTALEN標的部位を囲む領域を増幅しTALENスペーサ領域内で切断する制限酵素を用いて得られたアンプリコンを消化することによって同定することができます。制限酵素標的配列を変更インデルを含む対立遺伝子を制限酵素耐性バンド（ 図2）を製造、消化し ​​ないだろうしながら、インデルのない対立遺伝子が消化されます。

TALEN注射はおそらくAの二対立遺伝子変異をもたらすことができますmexicanus ^29。したがって、いくつかの表現型.......

Discussion

長足の進歩は、形質の進化の遺伝的基礎を理解することに向けて、近年で行われています。特徴の数の進化の基礎となる候補遺伝子が同定されたが、それが原因で最も進化興味深い種の遺伝的取り扱いやすさの欠如にインビボでこれらの遺伝子を試験するために困難なままです。ここでは、Aのゲノム編集のための方法を報告しますmexicanus、洞窟動物の進化を研究するために使用される種。遺伝的マッピング研究^1,21,23と候補遺伝子^19,40は、Aの洞窟の形での形質の進化のための候補遺伝子の数を同定している近づきますmexicanus。洞窟魚ゲノム⁴¹の最近の刊行物は、洞窟の形質の進化のための候補遺伝子を同定するための追加の強力なツールを提供します。これらの候補遺伝子の多くの機能をテストすることは、遺伝子発現を減少させるための技術が必要となります。研究のための唯一の現在のオプションA.でる減少した遺伝子発現mexicanusはモルフォリノの使用によるものです。しかし、モルホリ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Thermocycler
注入ステーション
ゲル装置
ニードルプラー
ナノドロップ
名前	Company	カタログ番号	コメント
Supplies
注:私たちが知る限り、ゴールデン
ゲートTALENおよびTALエフェクターキット2.0	Addgene	キット#1000000024
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (粒状)	Fisher	BP9724-500
Fisher BioReagents 微生物学 培地: LB Broth, Miller		Fisher BP1426-500
Teknova TET-15 in 50% EtOH	Teknova (Fisher を通じて注文)	50-843-314
Spectinomycin 二塩酸塩, Fisher BioReagents	Fisher	BP2957-1
スーパーアンピシリン (1,000xDNA	Technologies	6060-1
ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use	Thermo Sci Fermentas Inc (Fisher を通じて注文)	FERR0941
IPTG, Fisher BioReagents	Fisher	BP1620-1
シャー	Fisher	08-757-13
BsaI	New England Biolabs (Fisher を通じて注文)	50-812-203	BsaI-HFではなくBsaIを使用してください（ゴールデンゲートTALENおよびTALエフェクターキットのプロトコルに記載されているように）制限
10x T4リガーゼ緩衝液Promegaを提供）BSA New England Biolabs 10x T4リガーゼ緩衝液	Promega（Fisherを通じて注文）	PR-C1263
クイックライゲーションキット	ニューイングランドバイオラボ (フィッシャーを通じて注文)	50-811-728	私たちはすべてのTALENアセンブリ反応にクイックリガーゼを使用します
ワンショットTOP10 ケミカルコンピテント大腸菌	Invitrogen	C4040-06	他の化学的にコンピテントセルまたは自家製のコンピテントセルを使用できます
Esp 3I	Thermo Sci Fermentas Inc (フィッシャーを通じて注文)	FERER0451
プラスミドセーフATP依存性DNase	エピセンター(フィッシャーを通じて注文)	NC9046399
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	Qiagenキットは、初期プラスミド調製に使用する必要があります（ゴールデンゲートTALENおよびTALエフェクターキットプロトコルに記載されているように)
QIAquick PCR精製キット	Qiagen	28104
GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose	BioExpress	E-3119-125
Sac I	Promega (Fisher を通じて注文)	PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 転写キット	Ambion	AM1348M
Rneasy MinElute クリーンアップキット	Qiagen	74204
NorthernMax-Gly サンプルローディング色素	アンビオン(フィッシャーを通じて注文)	AM8551
ミナーゼ	デコン(フィッシャーを通じて注文)	04-355-32
ッシャーブランド使い捨てソーダライムガラスパスツールピペット	フィッシャー13-678-6B
標準ガラスキャピ	ワールド精密機器	1B100-4
マイクロキャップ	ドラモンドサイエンティフィックカンパニー1-000-0010
エッペンドルフ Femtotips マイクロローダー Femtojet マイクロインジェクター	エッペンドルフ (フィッシャーを通じて注文)	E5242956003
水酸化ナトリウム	フィッシャー	S318-500
トリス ベース	フィッシャー	BP152-1