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उम्र बढ़ने के मानव रोगों में फंसा जीन का अध्ययन किया आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के लिए एक phenotyping आहार

Published: July 14, 2016 doi: 10.3791/54136
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 2, 1,2
1Department of Environmental Health Sciences, Yale University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Introduction

उम्र से जुड़े रोगों के आधुनिक समाज में तेजी से प्रचलित हो रहे हैं। चिकित्सा विज्ञान में सुधार और जीवन प्रत्याशा बढ़ जाती है, जनसंख्या उम्र के लिए जारी है और इन रोगों के बोझ बढ़ता है। प्रभावी उपचार दुर्बल करने वाली स्थितियों के प्रभाव को कम करने के लिए आवश्यक हैं, लेकिन कई मामलों में मायावी रहते हैं। केवल कारणों और उम्र बढ़ने के साथ जुड़े रोगों की विकृति को समझने के द्वारा वैज्ञानिकों के हस्तक्षेप के लिए संभावित ठिकानों चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करने और विकसित करने के लिए शुरू कर सकते हैं। आम उम्र से संबंधित स्थिति ऐसी पार्किंसंस रोग (पीडी) और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) के रूप में neurodegenerative विकारों में शामिल हैं। पीडी सबसे आम आंदोलन मनुष्यों में neurodegeneration की वजह से विकार है। अधिकांश रोगियों पीडी इस तरह के उम्र के 50 साल के बाद कंपन, bradykinesia और कठोरता आराम कर रही है जैसे लक्षण दिखाई देते हैं। प्रारंभिक शुरुआत भी मामलों का लगभग 10% में देखा गया है।

एएमडी में अंधापन का प्रमुख कारण हैबुजुर्ग, उत्तरोत्तर हानिकारक फोटोरिसेप्टर और रेटिना वर्णक उपकला (RPE) आंखों में। केंद्रीय दृष्टि बिगड़ा हुआ है लेकिन परिधीय दृष्टि आम तौर पर अप्रभावित है। वहाँ एएमडी के दो रूप हैं। "सूखी" के रूप में, बाह्य प्रोटीन RPE और Bruch झिल्ली (बीएम) के बीच drusen फार्म के रूप में जाना जाता जमा, भौगोलिक शोष के प्रमुख और केंद्रीय दृष्टि धुंधला। अधिक गंभीर "गीले" प्रपत्र neovascularization से बी.एम. भर रंजित RPE और फोटोरिसेप्टर परतों में से परिणाम और रेटिना कि रेटिना के ऊतकों को स्थायी नुकसान का कारण बनता नीचे hamorrhaging करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। गुणसूत्र 1 और 10q26 ठिकाना, जहां उम्र से संबंधित maculopathy संवेदनशीलता 2 (ARMS2) और पूरक कारक एच (CFH): जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन पहले से लोकी है कि इस रोग की वृद्धि हुई संवेदनशीलता के साथ जुड़ा हुआ है और ब्याज के दो क्षेत्रों की पहचान कर रहे हैं की पहचान की है उच्च तापमान की आवश्यकता कारक A1 (HtrA1) जीन 1-5 स्थित हैं 3-6 की या तो गीला या सूखी रूपों के साथ जुड़ा हो सकता है।

CFH सी 3 की सक्रियता के द्वारा बाधा पूरक प्रणाली के वैकल्पिक मार्ग (एपी) की एक नकारात्मक नियामक के रूप में कार्य करता है। एक एकल nucleotide बहुरूपता (एसएनपी) सी प्रतिस्थापन 1 करने के लिए एक टी के कारण एएमडी का खतरा बढ़ से जोड़ा गया है, हिस्टिडीन साथ एक्सॉन 9 में tyrosine 402 के आदान-प्रदान के कारण। एएमडी में यह माना जाता है कि एपी CFH के समारोह का एक नुकसान की वजह से है, लेकिन है कि क्या एसएनपी निभाता है एक कारण भूमिका स्पष्ट नहीं है misregulated है। एक परिकल्पना है कि सकारात्मक आरोप लगाया हिस्टिडीन प्रोटीन सी-रिएक्टिव प्रोटीन बातचीत और हेपरिन सल्फेट 1,7 के लिए बाध्य करने CFH की क्षमता को नकारना सोचा जाता है। CFH में Y402H की इन विट्रो अध्ययन वेरिएंट के बीच कार्यात्मक मतभेदों पर परस्पर विरोधी परिणाम प्रदान करते हैं और में में काम vivo में <उन्हें> CFH - / - चूहों व्यक्त humanized CFH चल रहे 8 है। ARMS2, रहनुमा जीनोम में HtrA1 के ऊपर स्थित है, हालांकि जीन चूहों में अनुपस्थित है। HtrA1 एक सेरीन प्रोटीज है लेकिन ARMS2 खराब होती है। एएमडी जुड़े लोकस में SNPs के बीच संबंध असंतुलन यह मुश्किल इस क्षेत्र में जीन के म्यूटेशन व्यक्ति के जोखिम के लिए योगदान निर्धारित करने के लिए बनाया गया है, लेकिन हाल ही में काम सुझाव दिया है कि यह नहीं बल्कि ARMS2 से HtrA1 की overexpression कि neovascularization की ओर जाता है और subretinal प्रोटीन जमा 9-11। हालांकि, इस लोकस में जीन के करीब निकटता बातचीत है कि बेतरतीब ढंग से डाला transgenes का उपयोग कर अध्ययन नहीं किया जा सकता लिए अनुमति दे सकता।

एएमडी के अलावा, सेरीन proteases की HtrA परिवार के कई मानव रोगों के साथ संबद्ध किया गया है। सभी HtrA प्रोटीन एक सेरीन प्रोटीज डोमेन कम से कम एक सी टर्मिनल PDZ डोमेन के बाद होते हैं। HtrA1, HtrA3 और HtrA4 जीआर हिस्साeatest अनुरूपता, एक संकेत पेप्टाइड, इंसुलिन की तरह वृद्धि कारक बाध्यकारी डोमेन, एक Kazal protease अवरोध डोमेन, सेरीन प्रोटीज डोमेन और एक PDZ डोमेन से मिलकर। HtrA2 एक अलग एन टर्मिनस, एक mitochondrial स्थानीयकरण अनुक्रम, transmembrane डोमेन से बना है और apoptosis बाध्यकारी डोमेन के अवरोध प्रोटीज और PDZ डोमेन 12-16 द्वारा पीछा किया। स्तनधारी HtrA1 अपनी प्रोटीज डोमेन 17-20 के सक्रिय साइट में सब्सट्रेट प्रेरित remodeling द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और HtrA2 भी सेरीन प्रोटीज और PDZ डोमेन है कि प्रोटीज गतिविधि 21 को दबा के बीच बातचीत के द्वारा ठीक किया जा सकता है। दिलचस्प बात यह है PDZ डोमेन HtrA3 16 के समान विनियमन प्रदान करने के लिए प्रकट नहीं होता है। HtrA proteases भी बाह्य कारकों से नियंत्रित किया जा सकता: यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया है वहाँ HtrA1 के बीच एक नियामक बातचीत मौजूद है और 22 protoporphyrins और HtrA2 p38 एमएपी काइनेज के सक्रियण पर फोस्फोराइलेशन द्वारा विनियमित किया जा सकता हैएक PINK1 निर्भर तरीके 23 में मार्ग। चूहों में HtrA परिवार के व्यक्तिगत सदस्यों का विलोपन दर्ज किया गया है, हालांकि यंत्रवत प्रभाव ज्यादातर आंशिक रूप से दिखाई दे रहा phenotypes की कमी के कारण स्पष्ट नहीं कर रहे हैं।

HtrA1 प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण कार्य खेलता है और इसकी misregulation या उत्परिवर्तन गठिया, कैंसर और एएमडी 3,4,24-32 का खतरा बढ़ सहित कई अलग अलग मानव रोगों के साथ संबद्ध किया गया है। तंत्रिका ऊतकों में HtrA2 समारोह की हानि, मनुष्यों और चूहों में पीडी phenotypes के साथ संबद्ध किया गया है, जबकि त्वरित में गैर तंत्रिका ऊतकों परिणामों से इसके नुकसान उम्र बढ़ने 33-37। HtrA3 अनियंत्रण प्रीक्लेम्पसिया और कैंसर 38,39 के कुछ प्रकार के सहित रोगों के साथ संबद्ध किया गया है। अप-विनियमन HtrA4 की प्रीक्लेम्पसिया रोगियों लेकिन पीटा चूहों की गर्भनालों में देखा गया है एक खुला phenotype 40,41 प्रदर्शित नहीं करते। कुछ पीटा चूहों में मनाया phenotypes की कमी की गई हैHtrA परिवार के किसी सदस्य के बीच मुआवजे का एक परिणाम होने की माने: यह सोचा है कि दोनों HtrA4 और HtrA1 प्रोटीन के TGF-बी परिवार के साथ बातचीत, HtrA4 41 का विलोपन पर HtrA1 द्वारा मुआवजे के लिए अनुमति देता है। इसी तरह, यह सोचा है कि वे पूरक कार्यों 42 हो सकता है कि जब से HtrA1 और HtrA3 डोमेन homologies के एक उच्च डिग्री है। हालांकि, यह सुझाव दिया गया है HtrA प्रोटीन आंशिक रूप से विरोधी भूमिकाओं हो सकता है, आम लक्ष्य 43 विनियमित करने के लिए प्रतिस्पर्धा।

आगे इन जोखिम कारकों की जांच करने के लिए तीन humanized दस्तक माउस लाइनों उत्पन्न किया गया। CFH TM1 में (CFH * 9) jhoh और CFH TM2 (CFH * 9) jhoh, CFH जीन की एक्सॉन 9 CFH TM1 मानव सजात की एक्सॉन 9 से बदला है। (CFH * 9) jhoh गैर रोग जुड़े tyrosine encodes स्थिति 402 पर छाछ, जबकि CFH TM2 (CFH * 9) jhoh Y402H, जोखिम जुड़े एसएनपी किया जाता है। मेंमानव ARMS2 अनुक्रम tm1jhoh ARMS2 एक क्षेत्र HtrA1 के अपस्ट्रीम को निशाना बनाया गया था। एक loxP-घिरे रोकें अनुक्रम जीन अनुक्रम लेकिन शामिल UbiC प्रमोटर के बहाव के ऊपर रखा OzCre चूहों, जो Rosa26 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत Cre recombinase व्यक्त करते हैं, जैसा कि पहले 34 में वर्णित को पार करके अलग किया गया। के अलावा इन दस्तक लाइनों, CFH और HtrA1 (CFH tm1jhoh और HtrA1 tm1jhoh), साथ ही दूसरे को जानते HtrA परिवार के सदस्यों के लिए सशर्त पीटकर alleles उत्पन्न किया गया: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) और HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh)। एक्सॉन 3, HtrA1; रोगाणु लाइन नॉकआउट loxP साइटों, जैसे कि विलोपन एक फ्रेम पारी और / या सक्रिय डोमेन (CFH का विलोपन का कारण बनता है के साथ विशिष्ट एक्सॉनों पार्श्व करने के लिए इंजीनियर जानवरों के लिए OzCre चूहों पार करके बनाया गया था एक्सॉनों 2-3, HtrA2: एक्सॉनों 2-4, HtrA3; एक्सॉन 3, HtrA4; एक्सॉनों 4-6) 34,41। HtrA2 के एक तंत्रिका विलोपन, Nestin प्रमोटर के नियंत्रण के तहत Cre recombinase का उपयोग कर नष्ट कर दिया (HtrA2 Flox, टीजी (एनईएस-सीआरई) 1Kln / जम्मू), भी 34 में वर्णित किया गया है। केवल HtrA2 कमी चूहों, या तो प्रणालीबद्ध या तंत्रिका ऊतकों में, स्पष्ट phenotypes प्रदर्शित, Parkinsonian phenotypes के साथ पेश किया।

चूंकि ब्याज की इन जीनों में से कुछ के माइटोकॉन्ड्रिया 11,44-47 के लिए स्थानीय किए जाने की मंजूर किया जाता है, और HtrA2 का विलोपन Parkinsonian phenotypes, एक mitochondrial और तंत्रिका संबंधी ध्यान देने के साथ एक phenotyping आहार यहाँ वर्णित है और ब्याज के परीक्षण से प्रतिनिधि परिणाम प्रदान की जाती हैं उत्पन्न । आदेश, अनुवांशिक इंजीनियर को अच्छी तरह से मानव, उम्र से संबंधित रोग जांच करने के लिए और व्यवस्थित ढंग से एक प्रारंभिक phenotyping अनुसूची स्थापित किया गया था उत्पादित चूहों की जांच के लिए दो मुख्य से संबंधित परीक्षणों की एक श्रृंखला से मिलकर मेंब्याज की बीमारियों: एएमडी और पार्किंसंस।

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Protocol

आचार बयान: जानवरों को शामिल अध्ययन येल विश्वविद्यालय में देखभाल और प्रयोगशाला पशु का प्रयोग करें और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के लिए गाइड में स्वास्थ्य की सिफारिशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुपालन में आयोजित की गई।

1. आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के व्यवहार परीक्षण

नोट: सभी चूहों से निपटने के लिए आदी होना में मतभेद को सीमित करने का एक ही परीक्षण आहार के अधीन किया जाना चाहिए। टेस्ट हर बार दिन के एक ही समय में किया जाना चाहिए।

  1. नवजात हिंद अंग टेस्ट
    नोट: हिंद अंग परीक्षण समीपस्थ हिंद अंग की मांसपेशियों की ताकत, कमजोरी और थकान का मूल्यांकन करने के लिए P10 के लिए प्रसव के बाद दिन (पी) 4 से दैनिक आयोजित किया जाता है।
    1. परीक्षण क्षेत्र के लिए परिवहन चूहों और परीक्षण से पहले 30 मिनट के लिए आराम करने के लिए अनुमति देते हैं।
    2. 70% इथेनॉल के साथ एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब की सफाई, टी के नीचे करने के लिए दो (पी 4-P8) या एक (पी 9-P10) कपास गेंदों धक्का द्वारा परीक्षण उपकरण तैयारउबे और एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में हासिल।
    3. पिंजरे और रिकार्ड वजन से एक पिल्ला निकालें। गर्मी पैड पर ट्रे पकड़े जब भी परीक्षण नहीं में पिल्ला रखें।
    4. धीरे शंक्वाकार ट्यूब के रिम पर नवजात शिशु की हिंद अंग निलंबित, ऐसी है कि यह कपास गेंदों की दिशा में नीचे का सामना करना पड़ रहा है। एक स्टॉपवॉच का उपयोग कर गिर करने के लिए पुल किए गए प्रयास और उपाय विलंबता की संख्या की गणना।
    5. दोहराएँ एक बार तो मार्कर के साथ पिल्ला लेबल। बाद में, पैर की अंगुली कतरन से पी 6 पिल्ले की पहचान। पिल्ले की जगह पहले घर पिंजरे से बिस्तर के साथ धीरे रगड़ें।
    6. 70% इथेनॉल के साथ शंक्वाकार ट्यूब साफ कर लें।
    7. अगले पिल्ला पर परीक्षण दोहराएँ जब तक पूरे कूड़े परीक्षण किया गया है।
    8. कपास की गेंद और शंक्वाकार ट्यूब के निपटान के। स्वच्छ 70% इथेनॉल के साथ सभी उपकरण।
  2. Weanling प्रेक्षण का परीक्षण
    नोट: weanling अवलोकन परीक्षण स्कोर करने के लिए आंदोलन और सामान्य गतिविधि का स्तर P21 के लिए P19 से दैनिक प्रशासित किया जाता है।
    1. परीक्षण क्षेत्र एक करने के लिए परिवहन चूहोंएन डी परीक्षण से पहले 30 मिनट के लिए आराम करने के लिए अनुमति देते हैं।
    2. Plexiglas परीक्षण बॉक्स 70% इथेनॉल के साथ सफाई से आधार पर 2 इंच वर्गों की एक 6x6 ग्रिड के साथ चिह्नित तैयार करें। पक्ष ऐसी है कि पूरे बॉक्स को देखने के क्षेत्र में है करने के लिए वीडियो उपकरण सेट करें। की स्थापना की और नवीनता शुरू करने से बचने के लिए एक ही प्रत्येक दिन परिवेश रखें।
    3. एक साफ पकड़े कप में पिंजरे और जगह से एक weanling निकालें। रिकार्ड वजन।
    4. परीक्षण पहचान कार्ड फिल्माने, माउस पहचान संख्या, उम्र और परीक्षण की तारीख के साथ द्वारा वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं। केंद्र वर्ग कप धारण करने से माउस स्थानांतरण। तीन मिनट के लिए समय, परीक्षा के दौरान माउस के दोनों सामने पंजे द्वारा तय लाइनों की संख्या की गणना।
    5. एक साफ पिंजरे और अंत वीडियो रिकॉर्डिंग करने के लिए माउस लौटें।
    6. 70% इथेनॉल के साथ परीक्षण उपकरण साफ करें।
    7. दोहराएँ जब तक सभी कूड़े का परीक्षण किया है, तो घर पिंजरे में सभी पिल्ले वापसी।
    8. स्वच्छ 70% इथेनॉल के साथ सभी उपकरणों का परीक्षण।
  3. वायर मेष पकड़ शक्ति टेस्ट
    नोट: पकड़ शक्ति परीक्षण P22 और P26 के बीच वैकल्पिक दिनों पर आयोजित किया जाता है, neuromuscular ताकत का आकलन करने के लिए।
    1. परीक्षण क्षेत्र के लिए परिवहन चूहों और परीक्षण से पहले 30 मिनट के लिए घर पिंजरे में आराम करने के लिए अनुमति देते हैं।
    2. 70% इथेनॉल के साथ एक Plexiglass बॉक्स और जाल ग्रिड सफाई से तंत्र तैयार करें। बॉक्स के नीचे में जगह बुलबुला लपेटो और कागज के साथ कवर किया।
    3. तीन के समूहों में अलग-अलग चूहों, व्यक्ति पकड़े कप में रखकर।
    4. तार की जाली के केंद्र पर पहली बार माउस प्लेस और धीरे धीरे Plexiglass बॉक्स के नीचे में नरम सतह से ऊपर 10-20 सेमी पलटना। विलंबता को मापने के एक स्टॉपवॉच का उपयोग कर गिर जाते हैं। परीक्षण के बाद बर्खास्त 60 सेकंड गुजरे हैं, तो माउस नहीं करतागिरना।
    5. पकड़े कप के लिए माउस लौटें पोंछ 70% इथेनॉल के साथ जाल और बुलबुला लपेटो पर कागज की जगह। पहले लौटने से पहले समूह में शेष दो चूहों पर परीक्षण आचरण। दोहराएँ जब तक प्रत्येक माउस तीन बार की कुल परीक्षण किया गया है।
    6. एक साफ पिंजरे में समूह लौटें और शेष समूहों के साथ जारी है। अगर वहाँ किसी भी समूह में तीन चूहों की तुलना में कम कर रहे हैं, यह सुनिश्चित करें कि एक 5 मिनट के अंतर परीक्षण वसूली अंतराल अनुमति दी है।
    7. , घर पिंजरे में सभी चूहों लौटें 70% इथेनॉल के साथ कागज और स्वच्छ परीक्षण उपकरणों के निपटान के।

2. रेटिना संरचना की परीक्षा

  1. ketamine के intraperitoneal इंजेक्शन (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) द्वारा P30-35 पर जानवरों बेहोश करना। लुटेरा pinching द्वारा संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करें और केवल एक प्रतिक्रिया के अभाव में आगे बढ़ना है, IACUC दिशा निर्देशों के साथ लाइन में। 4% पीएफए ​​/ पीबीएस 48 के साथ छिड़कना।
  2. आंखें निकालने के लिए, चीरा si में त्वचा को साफ70% इथेनॉल के साथ ते, खोपड़ी के आधार पर त्वचा के माध्यम से काटने से पहले। त्वचा खोपड़ी और 70% इथेनॉल के साथ स्वच्छ बेनकाब करने के लिए वापस छील। स्वच्छ उपकरणों का प्रयोग, ध्यान आँख कुर्सियां ​​तक ​​पहुँचने और आंखों को बेनकाब करने की खोपड़ी के माध्यम से कटौती। ऑप्टिक तंत्रिका तोड़, धीरे सॉकेट से आंखों को हटाने और पीबीएस में कुल्ला।
  3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​/ पीबीएस में आँखों को ठीक करें।
  4. आंखों पीबीएस युक्त एक छोटा सा पेट्री डिश में रखें। कॉर्निया सिलाई हटाने कैंची का उपयोग कर के बीच में एक छोटा सा चीरा। कॉर्निया और श्वेतपटल के बीच बढ़त काटने से कॉर्निया निकालें। संदंश का प्रयोग करें आईरिस हटा दें। अंत में, RPE परतें छील, रेटिना बरकरार है और जगह में लेंस को छोड़कर।
    नोट: 4% पीएफए ​​/ पीबीएस निर्धारण RPE टुकड़ी के लिए RPE आसानी से रेटिना के बाहर से खुली किया जा करने के लिए अनुमति का कारण होगा।
  5. पुन तय पीबीएस युक्त एक पेट्री डिश के लिए आंख लौटने से पहले 4% पीएफए ​​/ 30% sucrose के कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए / पीबीएस में। बाहर खींचो लेन, संदंश का उपयोग इसके साथ कांच का शरीर लाने एस।
  6. 30% sucrose रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर में Cryoprotect।
  7. इष्टतम काटने तापमान यौगिक (अक्टूबर) और एक embedding मोल्ड ताजा अक्टूबर युक्त करने के लिए स्थानांतरण में कोट आँखें। आँख कि इस तरह के बाण विमान काटने चेहरे के साथ समानांतर है, संभव के रूप में कुछ आंदोलनों का उपयोग कर और हवा के बुलबुले की शुरूआत परहेज ओरिएंट। एक सूखी बर्फ / इथेनॉल स्नान में ढालना डुबो कर फ्लैश फ्रीज। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ब्लॉकों।
  8. एक cryostat का प्रयोग, 20 माइक्रोन बाण वर्गों में कटौती और precleaned स्लाइड पर इकट्ठा।
  9. Hematoxylin और eosin मानक प्रोटोकॉल के अनुसार 49 के साथ दाग वर्गों। छवि एक प्रकाश उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के लिए सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग।

3. Histochemical धुंधला

  1. नमूना तैयार करना
    1. खुले बूंद साँस लेना के माध्यम से isoflurane अधिक मात्रा (प्रोपलीन ग्लाइकोल में 30%) का उपयोग P30-35 पर जानवरों euthanize। समापन से इच्छामृत्यु का आकलनश्वास, दिल की धड़कन और लुटेरा बन्द रखो के जवाब की कमी की। ग्रीवा अव्यवस्था और अंग को हटाने, IACUC दिशा निर्देशों के साथ लाइन में से मौत की पुष्टि करें।
    2. खोपड़ी के आधार पर त्वचा के माध्यम से काटने से पहले मस्तिष्क निकालने के लिए, 70% इथेनॉल के साथ चीरा साइट पर त्वचा को साफ। त्वचा खोपड़ी और 70% इथेनॉल के साथ स्वच्छ बेनकाब करने के लिए वापस छील। स्वच्छ उपकरणों, ध्यान से खोपड़ी के माध्यम से कटौती का प्रयोग और मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए हटा दें। झिल्ली निकालें, और धीरे खोपड़ी गुहा से मस्तिष्क को हटा दें। पीबीएस में कुल्ला।
    3. कोट एक embedding मोल्ड ताजा अक्टूबर युक्त करने के लिए अक्टूबर में मस्तिष्क और हस्तांतरण। मस्तिष्क कि इस तरह के बाण विमान काटने चेहरे के साथ समानांतर है, संभव के रूप में कुछ आंदोलनों का उपयोग कर और हवा के बुलबुले की शुरूआत परहेज ओरिएंट। -80 डिग्री सेल्सियस पर एक सूखी बर्फ / इथेनॉल स्नान और दुकान में ढालना डुबो कर फ्लैश फ्रीज।
    4. एक cryostat का प्रयोग, 10 माइक्रोन बाण वर्गों में कटौती और precleaned स्लाइड पर इकट्ठा।
    2. <li> NADH Diaphorase धुंधला
    1. 1L-विआयनीकृत पानी में 5.72 छ Tris एचसीएल और 1.66 छ Tris आधार भंग द्वारा 0.05 एम Tris बफर, पीएच 7.6 से तैयार करें। अप करने के लिए छह सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    2. NADH समाधान (0.05 एम Tris बफर में 2.25 मिमी NADH) तैयार करें। अशेष और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    3. एनबीटी समाधान (2.5 मिमी 0.05 एम Tris बफर में नाइट्रो-ब्लू tetrazolium) तैयार करें। एक कांच की बोतल में ऊपर से छह सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    4. NADH समाधान और एनबीटी समाधान के बराबर मात्रा गठबंधन धुंधला समाधान बनाने के लिए और प्रत्येक स्लाइड के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए। 30 मिनट के लिए एक humidified कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. महाप्राण धुंधला समाधान और DH 2 ओ के साथ तीन बार धोने
    6. आरोही और एसीटोन के उतरते सांद्रता में प्रत्येक तीन बार धोएं / DH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए।
    7. DH 2 हे में तीन बार कुल्ला और जलीय माध्यम के साथ वर्गों माउंट। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि उज्जवल च के लिए सुसज्जितield माइक्रोस्कोपी। ब्लू धुंधला enzymatic गतिविधि से मेल खाती है।
  2. Succinate डिहाइड्रोजनेज Histochemical धुंधला
    1. 0.2 एम सोडियम फास्फेट अकेले आधार / DH 2 हे और 0.2 एम सोडियम फास्फेट द्विक्षारकीय / DH 2 ओ को तैयार
    2. 20 भागों सोडियम द्विक्षारकीय फॉस्फेट के साथ 3 भागों अकेले आधार फॉस्फेट के संयोजन से 0.2 एम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.6 बनाओ।
    3. धुंधला समाधान (0.1 एम सोडियम succinate, 0.2 एम फॉस्फेट बफर में 1.25 मीटर एनबीटी) तैयार करें और प्रत्येक स्लाइड के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ें। 60 मिनट के लिए एक humidified कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. महाप्राण धुंधला समाधान और DH 2 ओ में तीन बार धोएं
    5. और आरोही में प्रत्येक तीन बार धोएं एसीटोन की सांद्रता उतरते / DH 2 हे (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए।
    6. DH 2 हे में तीन बार कुल्ला और जलीय माध्यम के साथ वर्गों माउंट। छवि एक प्रकाश उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के लिए सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग। ब्लू धुंधला एन से मेल खाती हैzymatic गतिविधि।

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Representative Results

इस अनुभाग में इन तरीकों का उपयोग कर प्राप्य परिणाम के उदाहरण का वर्णन है। हिंद अंग परीक्षण में, पुल प्रयासों की संख्या बनाया और विलंबता गिर करने के लिए प्रत्येक दिन के लिए लगातार दो परीक्षणों पर अभिव्यक्त कर रहे हैं। (HTRA2 को) चित्रा 1 ए में चूहों इस परीक्षा में कम neuromuscular ताकत HtrA2 tm1jhoh के साथ चूहों भेद करने के लिए आनुवंशिक रूप से विभिन्न समूहों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है - बी P4-6 से गिर करने के लिए एक कमी के बाद खींचतान और विलंबता की संख्या में कोई परिवर्तन नहीं प्रदर्शित करता है। P7-10 पर neuromuscular शक्ति, littermates (HTRA2 डब्ल्यूटी) की तुलना में में। उम्र के साथ शक्ति में वृद्धि की संभावना भी प्रकार के जंगली जानवरों में नमूदार है। weanling अवलोकन परीक्षण के लिए, कुल गतिविधि सभी घटनाओं संक्षेप द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है (लाइनों तय, पालन और घटनाओं को संवारने), परीक्षण के लगातार तीन दिन भर में औसत। वैकल्पिक रूप से, घटना के प्रत्येक विशिष्ट प्रकार individuall हो सकता हैy का विश्लेषण किया। यहाँ प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं, गुम्मट littermates की तुलना में HTRA2 को चूहों की कम गतिविधि का प्रदर्शन है। इन आंकड़ों कि कुल गतिविधि मात्रात्मक मापा जा सकता है और समूह (चित्रा 1 सी) के पार तुलना में प्रदर्शित करता है। यह भी एक परीक्षण के दिन पर प्रदर्शन तीन दोहराता से एक दैनिक औसत की गणना के द्वारा पकड़ शक्ति में मतभेद यों के लिए संभव है। HTRA2 को चूहों littermate नियंत्रण की तुलना में कर रहे हैं, शक्ति में कटौती एक छोटा विलंबता में प्रकट गिर करने के लिए (चित्रा -1)।

एच एंड ई रेटिना के धुंधला छवियों जिसमें रेटिना संरचना की जांच की और तुलना (चित्रा 2) किया जा सकता उत्पन्न करता है। कि रेटिना रचना प्रकार की कोशिकाओं की परतों स्पष्ट रूप से आनुवंशिक समूहों के बीच तुलना की अनुमति चित्रित कर रहे हैं। इधर, HtrA2 tm1jhoh '; HtrA3 tm1jhoh चूहों, रेटिना संरचना में कोई बदलाव नहीं दिखा HtrA2 की तुलना tm1jhoh चूहों। अंत में, इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला जटिल गतिविधि के लिए histochemical धुंधला ऐसी कमी सेरिबैलम और HtrA2 की स्ट्रिएटम में मनाया के रूप में वृद्धि एंजाइम गतिविधि को दर्शाती धुंधला तीव्रता में वृद्धि के साथ, सांस की एंजाइम कार्यों में परिवर्तन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता flox / flox, टीजी (एनईएस -cre) 1Kln / जम्मू (Nesko) मस्तिष्क जब गुम्मट littermates (चित्रा 3) की तुलना में।

आकृति 1
चित्रा 1:। अनुवांशिक इंजीनियर चूहों के व्यवहार phenotyping HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) चूहों वर्णित व्यवहार परीक्षण के अधीन थे और (HTRA2 डब्ल्यूटी) littermate नियंत्रण wildtype की तुलना में। (ए - बी) हिंद अंग निलंबन परीक्षण पी 4-P10 से WT और KO नवजात शिशुओं पर प्रदर्शन किया गया था और neuromuscular में कमी को दर्शाता हैKO पशुओं में शक्ति (डब्ल्यूटी: N = 28, Ko: N = 19)। (ए) KO पिल्ले शुरू में गुम्मट भाई बहन के रूप पुल करने के प्रयास के एक समान संख्या बना है, लेकिन बाद में समय बिंदुओं पर किए गए प्रयास में कमी दिखाने के लिए। (बी) को नवजात शिशुओं 'गिर करने के लिए विलंबता भी शुरू में सामान्य है, लेकिन बाद P7 से कम हो जाती है। (सी) weanling अवलोकन कुल गतिविधि स्कोर KO पशुओं में गुम्मट littermates, इन चूहों की कम गतिविधि के साथ लगातार की तुलना में कम हो गया था (डब्ल्यूटी: N = 19, Ko: N = 12)। (डी) KO जानवरों को भी, जाल उलटा परीक्षण के दौरान गिर करने के लिए एक कम विलंबता था HTRA2 को चूहों के कम पकड़ शक्ति का प्रदर्शन (डब्ल्यूटी: N = 17 ko: एन = 9)। डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± SEM (# 0.1 <p <0.05, * पी <0.05, ** पी <0.001, *** पी <0.001 स्वतंत्र टी परीक्षण द्वारा)। यह आंकड़ा पैटरसन एट अल से संशोधित किया गया है। 34 देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

चित्र 2
चित्रा 2:। एच ई रेटिना के धुंधला hematoxylin और eosin साथ धुंधला रेटिना वर्गों संरचना की जांच हो पाती, रेटिना परतों का वर्णन। यहाँ P35 HtrA2 गुम्मट से वर्गों; HtrA3 tm1jhoh (ए) और HtrA2 tm1jhoh; HtrA3 tm1jhoh (बी) के प्रदर्शन सामान्य रेटिना संरचना। RPE: रेटिना वर्णक उपकला, ओएस: बाहरी क्षेत्रों, है: भीतरी क्षेत्रों, ONL: बाहरी परमाणु परत, OPL: बाहरी परत उलझन, लीग: भीतर परमाणु परत, आईपीएल: भीतरी परत उलझन, GCL; नाड़ीग्रन्थि सेल परत। स्केल बार = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


। चित्रा 3:; टीजी (एनईएस-सीआरई) 1Kln / जम्मू (Nesko) और श्वसन जटिल गतिविधि NADH diaphorase (जटिल मैं) और succinate डिहाइड्रोजनेज (जटिल द्वितीय) गतिविधि के लिए Histochemical धुंधला P25 HtrA2 की अनुप्रस्थ मस्तिष्क वर्गों flox / flox पर प्रदर्शन किया गया था HtrA2 + / Flox, टीजी (एनईएस-सीआरई) 1Kln / जम्मू (NesWT) littermates। NADH diaphorase एंजाइम गतिविधि सेरिबैलम (Crbl, बी) और स्ट्रिएटम Nesko मस्तिष्क के (डी) NesWT नियंत्रण (ए, सी) की तुलना में कमी आई है, लेकिन है नहीं (ई - एफ) सेरेब्रल कॉर्टेक्स में। एसडीएच गतिविधि इसी तरह NesWT नियंत्रण की तुलना में सेरिबैलम और Nesko चूहों के स्ट्रिएटम (एच, जम्मू) में कम हो जाता है (जी, मैं), लेकिन सेरेब्रल कॉर्टेक्स में कोई बदलाव नहीं हुआ है (कश्मीर - एल)। स्केल बार = 200 माइक्रोन। इसचित्रा पैटरसन एट अल। 34 से संशोधित किया गया है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मजबूत उपचार मानव उम्र बढ़ने से संबंधित शर्तों दुर्बल के प्रभाव को सीमित करने की जरूरत है, लेकिन वे कई स्थितियों के लिए मायावी रहते हैं। संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और हस्तक्षेप के लिए रणनीति विकसित करने के लिए, कारणों और उम्र बढ़ने के साथ जुड़े रोगों की विकृति पहले समझा जाना चाहिए। नहीं सभी आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों तुरंत स्पष्ट phenotypes है कि ब्याज की बीमारी से संबंधित हैं, भले ही उन जीनों पहले मानव अध्ययन में हालत से जोड़ा गया है के साथ मौजूद। इसलिए अधिक व्यवस्थित जांच के लिए आवश्यक हैं और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों phenotypes है कि मानव में जुड़े रोगों से संबंधित हो सकता है की पहचान करने के लिए उचित प्रयोगों के अधीन किया जाना चाहिए।

असंख्य व्यवहार परीक्षण चूहों 50,51 में स्नायविक समारोह परख करने के लिए मौजूद हैं। व्यवहार के साथ साथ उल्लिखित परीक्षण मानव निष्कर्ष और वास्तविक phenotypes के आधार पर अनुमान लगाया phenotypes के लिए अनुकूल हैं obseचूहों में rved। इसके अलावा, इन परीक्षणों व्यवहार प्रयोगों के संचालन में कम या यहां तक ​​कि कोई अनुभव के साथ प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन करने के लिए सरल कर रहे हैं। इसमें अत्याधुनिक उपकरणों के लिए कोई आवश्यकता नहीं है, लेकिन परिणाम सार्थक और जानकारीपूर्ण जब ठीक से एकत्र कर रहे हैं, उन्हें आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों कि neuromuscular दोष हो जाने की उम्मीद कर रहे हैं के phenotype की जांच में पहले कदम के रूप में उपयोगी बना रही है। परिणामी डेटा तो और अधिक परिष्कृत परीक्षण उपकरण के साथ संभावित आगे के परीक्षण का ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रत्यक्ष, इस्तेमाल किया जा सकता है।

इसी तरह, कई तकनीकों के ऊतकों 52 में श्वसन समारोह का आकलन करने के लिए मौजूद हैं। मापने एटीपी संश्लेषण, ऑक्सीजन की खपत या mitochondrial झिल्ली क्षमता में परिवर्तन की दर mitochondrial समारोह के महत्वपूर्ण readouts हैं, लेकिन वे जटिल हो सकता है और समय प्रदर्शन करने के लिए लगता है, विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों 52-55 की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, वे अक्सर mitochond के स्तर तक सीमित कर रहे हैंRion या सेल, संवर्धित कोशिकाओं, lysates या अलग माइटोकॉन्ड्रिया पर निर्भर है। Histochemical धुंधला समय या संसाधनों के एक बड़े निवेश के बिना mitochondrial रोग की पहचान करने में एक उपयोगी पहला कदम है। इसके अलावा, ऊतक वर्गों दाग करने की क्षमता उधार देता है जल्दी से क्षेत्रीय मतभेद है कि अन्य तकनीकों के साथ के रूप में स्पष्ट नहीं हो सकता है, उदाहरण के लिए HtrA2 की कमी मस्तिष्क में मनाया एंजाइमी धुंधला के क्षेत्र विशेष के नुकसान की पहचान करने के लिए। तकनीक सांस की क्षमता में गुना परिवर्तन को मापने के लिए अपनी क्षमता में सीमित है, इसे परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्रों है कि तब और अधिक जटिल तरीकों का उपयोग कर चलाया जा सकता है बाहर नक्शे।

इस phenotyping समय के भीतर प्रस्तुत तकनीक का संचालन करने के लिए सरल कर रहे हैं, वहीं कुछ कदम ठीक से प्रदर्शन प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। व्यवहार phenotyping के लिए, महान देखभाल परीक्षण सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए प्रत्येक दिन एक ही समय में और एक ही स्थान में प्रदर्शन कर रहे बदलाव के परिचय को सीमित करनास्थान की नवीनता से या circadian ताल में अंतर से पेश। उपकरण इसी तरह के कारणों के लिए प्रत्येक दिन एक ही तरीके से आयोजित किया जाना चाहिए। कमरे संगठन गतिविधि परीक्षण, जहां नवीनता में छोटे परिवर्तन बहुत माउस की गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। जब पकड़ शक्ति को मापने, जांचकर्ताओं का पता लगाना चाहिए कि चूहों उलटा पहले जाल का एक उचित पकड़ है। इसी तरह, देखभाल की दिशा में एक छोटा विलंबता गिर करने के लिए टेढ़ी हो जाएगा ठीक से हिंद अंग परीक्षण या परीक्षा परिणाम में जारी करने से पहले पिल्ला निलंबित करने के लिए लिया जाना चाहिए।

ऊतक phenotyping के लिए, अच्छा वर्गों प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। रेटिना के जानकारीपूर्ण धुंधला प्रभावी निर्धारण पर निर्भर करता है से पहले विच्छेदन या कलाकृतियों सेक्शनिंग और विच्छेदन के दौरान पैदा होती है और आकृति विज्ञान विकृत करेंगे। Histochemical धुंधला दिमाग की आवश्यकता है एंजाइम समारोह को संरक्षित करने के विच्छेदन के बाद जल्दी से जमे हुए किया जाना है, लेकिन ऊष्मायन समय इसी तरह के महत्वपूर्ण हैएल; तापमान में या समय की लंबाई में छोटे उतार चढ़ाव धुंधला तीव्रता में मतभेद पैदा कर सकता है। जहां संभव हो, नमूने एक ही समय में संसाधित किया जाना चाहिए समूहों के बीच तुलना की अनुमति है।

यहाँ एक परीक्षण उम्र से संबंधित बीमारियों, अर्थात् एएमडी और पीडी के साथ जुड़े सूक्ष्म phenotypes प्रदर्शित करने के लिए उम्मीद की आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल आहार, वर्णित है। इस phenotyping अनुसूची हित के ऊतकों के भीतर neuromuscular शक्ति और गतिविधि में घाटे की पहचान करने के लिए, साथ ही पहचान संरचनात्मक और कार्यात्मक दोष के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस समय युवा, आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों में जल्दी phenotypes का एक व्यवस्थित विश्लेषण प्रदान करता है। भविष्य में, इस विधि के रूप में अच्छी तरह से अज्ञात एटियलजि के उन है कि खुलकर सामान्य दिखाई देते हैं के रूप में एक AMD या पीडी संबंधित phenotype के साथ पेश करने की उम्मीद किसी भी आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के लिए लागू किया जा सकता है। परीक्षण की सादगी महत्वपूर्ण निवेश के बिना परीक्षण की अनुमति देता है, लेकिन आगे रों सूचित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताtudies। सेलुलर phenotyping के साथ व्यवहार परीक्षण के संयोजन से, इसे इस्तेमाल चूहों की संख्या को सीमित करने के लिए और सीधे शारीरिक हालत के साथ पशु प्रदर्शन की तुलना संभव है। इस phenotyping अनुसूची एक प्रारंभिक विश्लेषण है कि बाद में पढ़ाई का ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रत्यक्ष इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Acknowledgments

इस शोध के लिए अनुदान Rosebay मेडिकल फाउंडेशन और एक येल मेडिकल स्कूल के डीन रिसर्च फंड (झा) से आया है। हम व्यवहार प्रयोगों के साथ मदद के लिए डॉ क्लेयर कोएनिग धन्यवाद। अनुवांशिक इंजीनियर माउस लाइनों Ozgene (पर्थ, ऑस्ट्रेलिया) में उत्पन्न हुए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol Decon (Fisher Scientific) 435541
50 ml conical tube Fisher Scientific 1443222
cotton balls Walmart
heat mat Sunbeam 0000756-500-000
Holding tray (ice cube tray) Walmart
Electronic stopwatch GOGO PC396
Plexiglass box constructed in workshop 12" by 12" 
Vixia HF R400 Camcorder Canon 8155B004
9 oz Clear Cups Walmart
1/4 inch wire mesh Home Depot 204331884 (online) / 554219 (in store) 12" by 12" 
Bubble wrap VWR 470092-416
Straight specimen forceps VWR 82027-438
Fine-tip dissecting forceps VWR 82027-408
Fine scissors VWR 82027-578
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
10x phosphate buffered saline pH 7.4 American Bioanalytical AB11072-04000
Sucrose JT Baker 4072-01
superfrost slides Fisher Scientific 12-550-15
Hematoxylin Stain Solution Fisher Scientific (Ricca) 353016
Eosin Y Stain Solution Fisher Scientific (Ricca) 2845-32
Tris hydrochloride Sigma T3253
Tris American Bioanalytical AB02000-01000
Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate Sigma N8129
Nitrotetrazolium Blue chloride Sigma N6876
Acetone JT Baker 9006-05
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma S9390
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma S2378
VectaMount aqueous mounting medium Vector Labs H-5501-60
Cover glass Fisher Scientific 12-545-M 60 mm x 24 mm
AxioImager A1 microscope Zeiss
Video camera tripod Amazon
Optimal Cutting Temperature (OCT) Fischer Scientific 23730571
Cryostat Sectioning  Machine Leica  CM1900 Discontinued but since replaced by CM1950

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चिकित्सा अंक 113 पार्किंसंस रोग उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन माइटोकॉन्ड्रिया HtrA1 HtrA2 HtrA3 HtrA4 पूरक कारक एच (CFH)
उम्र बढ़ने के मानव रोगों में फंसा जीन का अध्ययन किया आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के लिए एक phenotyping आहार
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