Introduction
연령 관련 질환은 현대 사회에서 점점 더 널리되고있다. 의료 과학이 향상되고 평균 수명이 증가함에 따라, 인구는 계속 나이를 이러한 질병의 부담이 커집니다. 효과적인 치료법은 쇠약 조건의 영향을 줄이기 위해 필요하지만, 많은 경우에 어려운 남아있다. 만 원인 및 노화와 관련된 질병의 병리를 이해함으로써 과학자들은 개입 전략을 잠재적 인 치료 목표를 식별하고 개발을 시작할 수 있습니다. 일반적인 노화와 관련된 상태는 파킨슨 병 (PD), 연령 관련 황반 변성 (AMD)과 같은 신경 퇴행성 장애를 포함한다. PD는 인간의 신경 퇴행에 의한 가장 일반적인 운동 장애이다. 대부분의 PD 환자는 50 세 이후 진전, 운동 완만 및 강성을 휴식 등의 증상을 보여줍니다. 조기 개시는 경우 약 10 %에서 관찰되었다.
AMD는 실명의 주요 원인입니다노인 점진적 감광체 손상 및 눈의 망막 색소 상피 (RPE). 중심 시력이 손상되지만 주변 시력은 일반적으로 영향을받지 않습니다. AMD의 두 가지 형태가있다. "가공"형태에서, RPE와 브루흐의 막 (BM) 사이 드루 젠의 형태로 알려진 세포 외 단백질 예금, 지리적 위축으로 이어지는 중앙 비전의 흐림. 더 심각한 "습식"형태의 망막 색소 상피와 광 수용체 층에 BM에서 맥락막 신생 혈관에서의 결과와는 망막 조직에 영구적 인 손상을 유발하는 망막 아래에 hamorrhaging으로 이어질 수 있습니다. 1 번 염색체 및 10q26 궤적, 연령 관련 황반 병증 감수성이 (ARMS2)과에 보체 인자 H (CFH) : 게놈 넓은 협회 연구는 이전에이 질환이 증가 감수성과 관련된 관심의 두 영역을 식별 궤적을 확인했다 고온 조건 팩터 A1 (HtrA1) 유전자 1-5 위치한 3-6의 습식 또는 건식 형태 중 하나와 연관 될 수있다.
CFH는 C3의 활성화를 억제함으로써 보체 시스템의 대체 경로 (AP)의 음성 조절제로서 작용한다. 단일 염기 다형성 (SNP)이 때문에 C 대체 1에 T에 히스티딘과 엑손 9 티로신 (402)의 교환을 일으키는 원인이 AMD의 위험 증가에 연결되어 있습니다. AMD에이 AP 때문에 CFH의 기능의 손실이 있지만, SNP는 인과 적 역할은 분명하지 않다 재생되는지 misregulated 것으로 여겨진다. 한 가설은 양전하 히스티딘 단백질 헤파린 설페이트 1,7- 단백질 반응성 C 상호 작용에 결합 CFH의 능력을 무효로하는 것으로 생각된다는 것이다.에서 CFH Y402H 시험 관내 연구 변종 간의 기능 차이 위에 충돌하는 결과를 제공하고,의 작업을 생체 내에 <EM> CFH - / - 인간화 CFH 8 진행되고 발현하는 마우스. 유전자가 쥐에 존재하지만 ARMS2는 영장류 게놈 HtrA1의 상류에 위치한다. HtrA1는 세린 프로테아제하지만 ARMS2 저조한 특징입니다. AMD의 관련 현장에서의 SNP 사이의 연관 불균형이 어려운이 지역에서 유전자의 개별 돌연변이의 위험에 기여를 결정했다,하지만 최근의 작업은 혈관 신생에 이르게 오히려 ARMS2보다 HtrA1의 과발현이 있음을 제안하고 망막 단백질 예금 9-11. 그러나,이 로커스에서 유전자의 근접 임의로 삽입 된 유전자를 이용하여 연구 할 수없는 상호 작용을 허용 할 수있다.
AMD에 더하여, 세린 프로테아제의 HtrA 가족 많은 인간 질환과 관련되어있다. 모든 HtrA 단백질은 적어도 하나의 C 말단 PDZ 도메인 뒤에 세린 프로테아제 도메인을 함유한다. HtrA1, HtrA3 및 HtrA4은 GR을 공유신호 펩타이드, 인슐린 유사 성장 인자 결합 도메인, Kazal 프로테아제 억제제 도메인의 세린 프로테아제 도메인과 PDZ 도메인 이루어진 eatest 동성. HtrA2은 미토콘드리아 파악 시퀀스 경막 도메인 이루어지는 다른 N 말단을 가지며 아폽토시스 결합 도메인의 프로테아제 억제제 및 PDZ 도메인 12-16 하였다. 포유류 HtrA1은 프로테아제 도메인 17-20의 활성 부위에있는 기판 유도 개조에 의해 조절되고, HtrA2은 프로테아제 활성을 억제 (21) 세린 프로테아제 및 PDZ 도메인 간의 상호 작용에 의해 조절 될 수있다. 흥미롭게도, PDZ 도메인은 HtrA3 (16)에 유사한 규정을 부여 나타나지 않습니다. 이는 최근 HtrA1 사이 규제 작용이 존재 함을 증명 하였다 (22)와 protoporphyrins HtrA2이 P38의 MAP 키나제의 활성화시 인산화에 의해 조절 될 수있다 다음 HtrA 프로테아제는 외적 요인에 의해 조절 될 수있다PINK1 의존적으로 23 통로입니다. 마우스의 HtrA 가족의 개별 구성원의 삭제는 그러나 기계적인 효과는 대부분 부분적으로 볼 수 표현형의 부족으로 불분명, 문서화되고있다.
HtrA1 단백질 품질 제어에 중요한 기능을 담당하고 그 misregulation 또는 돌연변이 성 관절염, 암, AMD 3,4,24-32 위험의 증가 등 다양한 인간 질환과 관련되어있다. 가속 비 신경 조직 결과에서의 손실이 33-37 노화 동안 신경 조직에 HtrA2 기능의 상실은 인간과 생쥐의 PD의 표현형과 관련되어있다. HtrA3의 조절 곤란이 자간전증과 암 (38, 39)의 특정 유형을 포함하여 질병과 관련이있다. 최대 규제 HtrA4의는 명백한 표현형 40, 41를 표시하지 않습니다 자간전증 환자하지만 녹아웃 생쥐의 태반에서 관찰되었다. 일부 녹아웃 마우스에서 관찰 된 표현형의 부족은있다HtrA의 가족 구성원 사이의 보상의 결과로 가정 :이 HtrA4과 HtrA1 모두 HtrA4 (41)의 삭제에 HtrA1에 의해 보상을 허용, 단백질의 TGF-B 가족과 함께 상호 작용하는 것으로 생각된다. 유사하게, HtrA1 및 HtrA3 도메인 동성 높은 수준을 가지므로 그들은 상보 기능 (42)을 가질 수 있다고 생각된다. 그러나 HtrA 단백질 공통 타겟 (43)을 조절하는 경쟁 부분적 길항제 역할을 가질 수 있음을 제안하고있다.
또한 이러한 위험을 조사하기 위해 세 가지 인간화 녹아웃 마우스 라인 생성 된 요인. CFH의 TM1에서는 (CFH * 9) jhoh 및 CFH의 TM2 (CFH * 9) jhoh 상기 CFH 유전자의 엑손 9. 인간 동족체의 엑손 9 치환 CFH의 TM1된다 (CFH는 * 9) jhoh은 비 질병 관련 티로신 인코딩 Y402H, 위험 관련 SNP를 전달 jhoh CFH의 TM2 (CFH * 9) 반면 위치 (402)에서 잔류 물. 에서인간 ARMS2 순서 tm1jhoh ARMS2는 HtrA1의 상류 지역을 대상으로 하였다. 유전자 서열 그러나 포함 UBIC 프로모터 하류의 상류 놓인에 loxP-측면 STOP 시퀀스는 이전 34 바와 같이, Rosa26 프로모터의 제어하에 Cre 호텔 재조합 효소를 발현 OzCre 마우스로 건너 절제 하였다. 뿐만 아니라이 노크에 선, CFH 및 HtrA1 (CFH tm1jhoh 및 HtrA1의 tm1jhoh)뿐만 아니라 다른 알려진 HtrA 가족 구성원에 대한 조건부 녹아웃 대립 유전자가 생성 : HtrA2 (HtrA2의 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3의 tm1jhoh) 및 HtrA4 ( HtrA4의 tm1jhoh). 엑손 3, HtrA1; 세균 줄 녹아웃은 삭제 활성 도메인 (CFH의 프레임 이동 및 / 또는 삭제를 발생하도록에 loxP 사이트와 특정 엑손의 측면하도록 설계 동물 OzCre 마우스를 교차하여 만든 엑손 2엑손 2-4, HtrA3; HtrA2, -3 엑손 3, HtrA4; 4-6) 34,41를 엑손. HtrA2의 신경 삭제, 네 스틴 프로모터의 제어하에 Cre 호텔 재조합 효소를 사용하여 삭제 (HtrA2 flox, Tg는 (네스-CRE) 1Kln / J)는도 34을 설명 하였다. HtrA2가없는 전용 마우스, 중 전신 또는 신경 조직에서는 파킨슨 표현형으로 제시, 분명 표현형을 표시.
관심의 유전자 중 일부는 미토콘드리아 11,44-47 언어로 번역 될 상정하고, HtrA2의 삭제는 파킨슨 표현형, 미토콘드리아 및 신경 학적 초점을 맞춘 표현형 요법 여기에 설명되어 관심의 시험에서 대표적인 결과가 제공되어 생성되기 때문에 . 두 개의 주요 관련된 일련의 테스트 이루어진 체계적 초기 표현형 계획이 수립되었다 완전히 인간, 연령 관련 질환을 연구하고 생산 된 유전자 변형 마우스를 조사하기 위해서관심의 질환 : AMD와 파킨슨.
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Protocol
윤리 문 : 동물과 관련된 연구는 예일 대학의 실험실 동물의 관리 및 사용과 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 가이드 건강 권고의 국립 연구소 준수 실시 하였다.
유전자 변형 마우스 1. 행동 테스트
주 : 모든 마우스는 처리에 습관화 차이를 제한하기 위해 동일한 시험 요법을 실시해야한다. 시험 날의 동일한 시간마다 수행되어야한다.
- 신생아 뒷다리 테스트
주 : 뒷다리 시험 근위 뒷다리 근력, 쇠약 및 피로를 평가하기 위하여 생후 P10로 일 (P) 4 매일 수행된다.- 시험 영역으로 전송 마우스는 시험 전에 30 분 동안 휴식을 허용합니다.
- t의 바닥에 두 개 (P4-P8) 또는 1 (P9-P10)면 공을 추진, 70 % 에탄올로 50 ML 원뿔 튜브를 청소하여 시험 장치를 준비우베는 수직 위치에 고정.
- 케이지 기록 무게에서 한 강아지를 제거합니다. 테스트하지 때마다 열 패드 트레이를 들고 강아지를 유지합니다.
- 부드럽게는면 공을 향해 아래로 향하게되도록, 원뿔 튜브의 변죽을 통해 신생아의 뒷다리를 일시 중지합니다. 스톱워치를 사용하여 가을에 만든 풀 시도 및 측정 대기 시간의 수를 계산합니다.
- 마커와 강아지 레이블을 한 번 더 반복 한 다음. 그 후, 발가락 클리핑에 의해 P6 새끼를 식별합니다. 교체하기 전에 홈 케이지에서 침구 부드럽게 새끼를 문질러.
- 70 % 에탄올로 원뿔 튜브를 닦아주십시오.
- 전체 쓰레기가 테스트 될 때까지 다음 강아지에 테스트를 반복합니다.
- 목화 공 및 원뿔 튜브 폐기하십시오. 70 % 에탄올로 청소 모든 장비.
- 젖을 갓 뗀 관측 테스트
참고 : 젖을 갓 뗀 관찰 시험은 운동과 일반 활동 수준을 점수로 P21로 P19 매일 투여한다.- 테스트 영역 (A)에 전송 생쥐차 테스트하기 전에 30 분 동안 휴식을 할 수 있습니다.
- 70 % 에탄올로 세척하여 기본 2 인치 사각형의 좁은 격자 표시 플렉시 글라스 테스트 상자를 준비합니다. 전체 상자가보기 필드에되도록 측에 비디오 장치를 설정합니다. (가) 설정하고 새로운 항목을 도입 피하기 위해 매일 같은 환경 유지.
- 깨끗한 유지 컵에 케이지와 장소에서 한 젖을 갓 뗀를 제거합니다. 녹음 무게.
- 마우스 식별 번호, 나이, 테스트 날짜, 시험 인증 카드를 촬영하여 동영상 촬영을 시작한다. 중앙 광장에 컵을 들고에서 마우스를 전송합니다. 3 분 동안 시간 시험 동안, 마우스 두 앞발로 이송 라인 수를 카운트.
- 깨끗한 케이지과 끝 비디오 녹화에 마우스를 돌려줍니다.
- 70 % 에탄올로 시험 장치를 청소합니다.
- 모든 쓰레기가 테스트 될 때까지 다음 홈 케이지에 모든 새끼를 반환 반복합니다.
- 70 % 에탄올로 청소 모든 시험 장비.
- 와이어 메쉬 그립 강도 시험
주 : 악력 시험 P22과 P26 사이의 다른 일 실시하고, 신경 근육 강도를 평가.- 시험 영역으로 전송 마우스 및 테스트하기 전에 30 분 동안 홈 케이지 휴식 할 수 있습니다.
- 70 % 에탄올과 플렉시 글라스 상자와 메쉬 그리드를 청소하여 장치를 준비합니다. 상자의 바닥에 버블 랩을 놓고 종이 커버.
- 개별 지주 컵에 배치하는 세 그룹으로 분리 된 쥐.
- 와이어 메쉬의 중심에 최초의 마우스를 놓고 천천히 플렉시 글라스 상자의 아래쪽에있는 부드러운 표면 위에 10-20cm를 반전. 스톱워치를 사용하여 떨어 대기 시간을 측정한다. 마우스를하지 않는 경우 60 초 경과 후 시험을 종료가을.
- 70 % 에탄올로 메쉬와 버블 랩을 통해 용지를 교체 와이프 들고 컵에 마우스를 돌려줍니다. 처음으로 돌아 가기 전에 그룹의 나머지 두 쥐에 대한 테스트를 실시한다. 각 마우스가 세 번 총을 시험 때까지 반복합니다.
- 깨끗한 케이지에 그룹을 반환하고 나머지 그룹을 계속합니다. 어떤 그룹의 세 가지 마우스보다 적은 경우, 5 분 간 재판 복구 간격이 허용되어 있는지 확인합니다.
- 홈 케이지에 마우스를 모두 반환 70 % 에탄올로 종이와 깨끗한 시험 장비 폐기하십시오.
망막 구조 2. 시험
- 복강 내 케타민 주사 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)에 의해 P30-35에서 동물을 마취. 발바닥을 협지함으로써 마취 깊이를 평가하고 IACUC 지침 라인에만 응답의 부재하에 수행. 4 % PFA / PBS (48) 관류.
- 절개시에 피부를 청소, 눈을 제거하려면두개골의베이스에 피부를 통해 절단하기 전에, 70 % 에탄올로 테. 70 % 에탄올로 두개골과 청소를 노출 피부를 벗겨. 깨끗한기구를 사용하여주의 깊게 눈 소켓 도달 눈을 노출 두개골을 잘랐다. 조심스럽게 소켓에서 눈을 제거하고 PBS로 씻어, 시신경을 절단.
- 실온에서 10 분 동안 4 % PFA / PBS에서 쳐다.
- PBS를 포함하는 작은 페트리 접시에 눈을 넣습니다. 스티치 제거 가위를 사용하여 각막의 중앙에 작은 절개 부위를 만든다. 각막과 공막 사이의 가장자리를 절단하여 각막을 제거합니다. 조리개를 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 마지막으로, 망막 손상과 장소에 렌즈를 떠나 RPE 층을 벗겨.
주 : 4 % PFA / PBS에서 고정이 RPE 쉽게 망막의 외부로부터 박리 할 수 RPE 박리의 원인이된다. - 다시 수정 PBS를 함유하는 페트리 접시에 눈에 반환하기 전에 4 % PFA / 30 % 수 크로스, 실온에서 15 분 / PBS있다. 렌은 잡아 당깁니다그것과 함께 유리체을 가져, 집게를 사용하여이야.
- 밤새 4 ° C에서 30 % 자당에 Cryoprotect.
- 신선한 OCT를 포함하는 포함 금형에 최적의 절단 온도 화합물 OCT () 및 전송에 코트 눈. 시상면은 가능한 한 적은 수의 동작을 사용하여 기포의 도입을 피 절삭면과 평행이되도록 눈의 방향. 드라이 아이스 / 에탄올 욕에 침지하여 주형 플래시 동결. -80 ° C에서 보관 블록.
- 그라 이오 스탯을 사용하여 20 μm의 시상 부분을 잘라 미리 세정 슬라이드에 수집합니다.
- 표준 프로토콜 49에 따라 헤 마톡 실린 및 에오신으로 얼룩 부분. 밝은 필드 현미경을 위해 장착 된 광학 현미경을 사용하여 이미지.
3. 조직 화학적 염색
- 샘플 준비
- 오픈 드롭 흡입을 통해 이소 플루 란 과다 복용 (프로필렌 글리콜 30 %)를 사용하여 P30-35에서 동물을 안락사. 중단에 의해 안락사 평가호흡, 심장 박동 및 발바닥을 곤란에 대한 응답의 부족. IACUC 지침에 맞춰 자궁 경부 전위 및 장기 제거에 의해 죽음을 확인합니다.
- 두개골의 기지에서 피부를 통해 절단하기 전에, 70 % 에탄올로 절개 부위의 피부를 청소, 뇌를 제거합니다. 70 % 에탄올로 두개골과 청소를 노출 피부를 벗겨. 조심스럽게 두개골을 잘라 깨끗한 도구를 사용하여 뇌를 노출 제거합니다. 멤브레인을 제거하고 부드럽게 두개골 캐비티에서 뇌를 제거합니다. PBS로 씻어.
- 신선한 OCT를 포함하는 포함 금형에 OCT 뇌 및 전송 코트. 시상면은 가능한 한 적은 수의 동작을 사용하여 기포의 도입을 피 절삭면과 평행이되도록 방향을 뇌. -80 ° C에서 드라이 아이스 / 에탄올 욕조와 저장소에 금형을 침지하여 플래시 동결.
- 그라 이오 스탯을 사용하여 10 μm의 시상 부분을 잘라 미리 세정 슬라이드에 수집합니다.
<리> NADH 디아 포라 염색 - 1L-탈 이온수에 5.72 g 트리스 - 염산 및 1.66 g의 트리스 기반을 용해하여 0.05 M 트리스 완충액, pH가 7.6을 준비합니다. 최대 6 주 동안 4 ° C에서 보관하십시오.
- NADH 용액 (0.05 M 트리스 완충액에서 2.25 mM의 NADH)를 준비합니다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
- NBT 용액 (0.05 M 트리스 완충액 2.5 mM의 니트로 블루 테트라 졸륨)를 준비합니다. 유리 병에 최대 6 주 동안 4 ° C에서 보관하십시오.
- 염색 액을 각각의 슬라이드에 1 ml에 추가 NADH 솔루션 및 NBT 솔루션의 동일한 볼륨을 결합합니다. 30 분간 가온 챔버 내에 37 ℃에서 인큐베이션.
- 대기음 염색 액과 DH 2 O.로 3 회 씻어
- 오름차순 및 내림차순 아세톤 농도로 3 회 세척 / DH 2 0 (30 %, 60 %, 90 %, 60 %, 30 %)을 실온에서 2 분.
- DH 2 O에 세 번 씻어 수성 매체 섹션을 탑재합니다. 광학 현미경을 사용하여 이미지의 밝은 f를 위해 장착의 ield 현미경. 블루 염색 효소 활성에 해당합니다.
- 탈수소 효소 조직 화학 염색을 숙시 네이트
- 0.2 M 나트륨 염기 인산 / DH 2 O 0.2 M 나트륨 이염 인산 / DH 2 O. 준비
- 20 부 나트륨 이염 인산 3 부 염기성 인산을 결합하여 0.2 M 인산 완충액, pH가 7.6를 확인합니다.
- 염색 용액 (0.1 M 나트륨 숙시 네이트, 0.2 M 인산 완충액 1.25 M NBT)를 준비하고 각각의 슬라이드에 1 ml에 추가 할 수 있습니다. 60 분 동안의 가습 챔버 내에서 37 ℃에서 인큐베이션.
- 대기음 염색 액과 DH 2 O. 세 번 씻어
- 오름차순으로 3 회 세척하고 아세톤의 농도를 내림 / DH 2 O (30 %, 60 %, 90 %, 60 %, 30 %)을 실온에서 2 분.
- DH 2 O에 세 번 씻어 수성 매체 섹션을 탑재합니다. 밝은 필드 현미경을 위해 장착 된 광학 현미경을 사용하여 이미지. 블루 염색은 실내에 해당zymatic 활동.
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Representative Results
이 섹션에서는 이러한 방법을 사용하여 얻을 수있는 결과의 예를 설명합니다. 뒷 사지 시험에서, 풀 시도 횟수가 이루어지고 지연은 매일 두 개의 연속적인 시험을 통해 합산되어 낙하. .이 시험은 감소 신경근 강도 HtrA2의 tm1jhoh 쥐 구별 전적으로 다른 그룹과 비교하는데 사용될 수있다 (HTRA2 KO)도 1a에 마우스 - B는 P4-6에서 감소 하였다 떨어 구해 지연의 수의 변화가 입증되지 한배 새끼 (HTRA2의 WT)에 비해 P7-10에서 신경 근육 강도입니다. 나이 강도의 예상 증가는 야생형 동물에서 관찰된다. 젖을 갓 뗀 관찰 테스트를 위해 총 활동은, 테스트의 세 연속 일에 걸쳐 평균 (라인 양육 및 이벤트를 정리, 횡단) 모든 이벤트를 합산하여 평가 될 수있다. 또한, 이벤트의 각 특정 유형의 individuall 될 수 있습니다Y는 분석했다. 여기에 대표적인 결과는 WT의 한배 새끼에 비해 HTRA2 KO 마우스의 감소 활동을 보여주는되게됩니다. 이러한 데이터는 총 활성을 정량적으로 측정하고, 그룹 (도 1C)를 통해 비교 될 수 있음을 보여준다. 각 실험 일에 수행되는 세 개의 반복에서 일 평균을 계산함으로써 악력의 차이를 정량화 할 수있다. HTRA2 KO 마우스는 한배의 새끼 컨트롤에 비교하면, 짧은 대기 시간 매니페스트 강도의 감소 (그림 1D)를 가을.
망막의 H & E 염색은 망막 구조를 조사하고 (도 2)와 비교 될 수있는 이미지를 생성한다. 망막을 구성하는 세포 형태의 층 명확 유전자 집단의 비교 수 있도록 묘사된다. 여기에, HtrA2의 tm1jhoh는 '; HtrA3 tm1jhoh 마우스 HtrA2에 비해 망막 구조의 변경을 표시하지
그림 1 :. 유전자 조작 생쥐의 행동 표현형 HtrA2의 tm1jhoh (HTRA2 KO) 마우스 (HTRA2의 WT) 한배 새끼 컨트롤 야생형에 비해 설명 행동 테스트를 실시 하였다. (A - B) 뒷다리 서스펜션 테스트는 P4-P10에서 WT와 KO 신생아 수행 및 신경 근육의 감소를 보여줍니다 하였다KO 동물의 강도 (WT : N = 28, KO : N = 19). (A) KO 새끼는 처음 WT 형제로 끌어 시도 비슷한 수를 만들지 만, 나중에 지점에서 만든 시도의 감소를 보여줍니다. 가을에 (B) KO 신생아 '대기 시간은 처음에는 정상이지만 이후 P7에서 감소한다. (N = 12 WT : N = 19, KO) (C) 그 젖을 갓 뗀 관찰 총 활동 점수는 이러한 쥐의 감소 활동과 일치 WT의 한배 새끼에 비해 KO 동물에 감소 하였다. (D) KO 동물도 HTRA2 KO 마우스의 감소 그립 강도를 보여, 메쉬 반전 시험 중에 떨어질 수있는 대기 시간 감소했다 (WT : N = 17, KO : N = 9). 데이터는 평균 ± SEM 대표 (# 0.1 <P <0.05, * p <0.05, ** p <독립 t-시험 0.001, *** p <0.001). 이 수치는 패터슨 등의 알에서 수정되었습니다. (34) 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.
그림 2 :. 망막의 H & E 염색 헤 마톡 실린 및 에오신으로 염색 망막 섹션에서는 망막 층을 서술 구조의 검사를 할 수 있습니다. P35의 HtrA2의 WT에서 다음 섹션, HtrA3의 tm1jhoh (A)과 HtrA2의 tm1jhoh, HtrA3의 tm1jhoh (B) 디스플레이 정상 망막 구조. RPE : 망막 색소 상피, OS : 외부 세그먼트, IS : 내부 세그먼트, ONL : 외부 핵 층, OPL : 바깥 얼기 층, INL : 내부 핵 층, IPL : 내부 얼기 층 GCL; 신경절 세포 층. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 그림 3 :;의 Tg (네스 - CRE) 1Kln / J (NesKO)과 호흡 복잡한 활동 NADH의 디아 포라 (복잡한 I)과 숙신산 탈수소 효소 (복잡한 II) 활동에 대한 조직 화학적 염색은 P25의 HtrA2의 가로 뇌 섹션 flox / flox에서 수행되었다 HtrA2 + / flox, Tg는 (네스 - CRE) 1Kln / J (NesWT) 한배 새끼. NADH 디아 포라 제 효소 활성은 소뇌 (Crbl, B) 및 NesWT 컨트롤 (A, C)에 비해 NesKO 뇌의 선조체 (D) 감소되지만,하지 대뇌 피질 (E - F). SDH 활성 마찬가지로 NesWT 대조군과 비교 NesKO 생쥐의 소뇌 선조체 (H, J)에서 (G, I)를 감소하지만, 대뇌 피질에 변화가 없다 (K - L)은. 스케일 바 = 200 μm의. 이그림은 패터슨 등. (34)로부터 수정 된 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
강력한 치료법은 인간의 노화와 관련된 쇠약 상태의 영향을 제한 할 필요가 있지만, 여러 조건을 피하는 유지된다. 잠재적 인 치료 목표를 식별하고 개입 전략을 개발하기 위해, 원인과 노화와 관련된 질병의 병리 먼저 이해해야합니다. 되지 않은 유전자는 이전 연구에서 인간 상태로 연결되어있다하더라도, 관심있는 질병과 관련된 표현형 즉시 분명 존재하는 모든 유전자 변형 마우스. 따라서보다 체계적인 연구가 필요하며, 유전자 변형 마우스는 인간에 관련된 질환과 관련 될 수있다 표현형을 식별하기위한 적절한 실험을 실시한다.
무수한 행동 테스트는 마우스 50, 51의 신경 기능을 분석하기 위해 존재한다. 본원에 설명 된 행동 검사는 인간 결과와 실제의 표현형에 기초하여 상기 가정 된 표현형에 적합한 obse마우스에서 rved. 또한, 이러한 테스트는 행동 실험을 거의 또는 전혀 경험이있는 실험실에서 수행 할 간단합니다. 복잡한 장비가 필요는 없지만, 그 결과는 신경근 결함을 가질 것으로 예상되어 유전자 변형 마우스의 표현형을 조사의 첫 단계로이를 유용하게 적절하게 수집 될 때 의미있는 정보이다. 얻어진 데이터는 더 복잡한 시험 장치에 잠재적으로 추가 시험의 초점을 지시하는데 사용될 수있다.
마찬가지로, 많은 기술 조직 (52)에 호흡 기능을 평가하기 위해 존재한다. ATP 합성, 산소 소비량 또는 미토콘드리아 막 전위의 변화의 속도를 측정하는 미토콘드리아 기능의 중요한 판독은 있지만 복잡하고 시간이 특정 시약 및 장비를 필요로 52-55, 수행 소모. 또한, 이들은 종종 mitochond의 레벨로 제한리온 또는 세포, 배양 세포, 해물 또는 격리 된 미토콘드리아에 의존. 조직 화학적 염색은 시간과 자원의 큰 투자없이 미토콘드리아 기능 장애를 식별하는 유용한 첫 번째 단계입니다. 또한, 조직 절편을 염색 할 수있는 능력 자체 준다 빠르게 예를 들어 다른 기술과 같이 명백하지 않을 수도 지역 차이 HtrA2 결핍 뇌에서 관찰 효소 염색 지역 관련 손실을 식별하도록. 기술이 호흡 능력 배 변화를 측정 할 수있는 능력이 제한되어 있지만, 그 후보다 복잡한 방법을 사용하여 추구 될 수있는 정의 된 뇌 영역을 매핑한다.
이 표현형 일정 내에 제시된 기술을 수행하는 간단하지만, 적절히 소정의 단계를 수행하는 것은 실험의 성공에 매우 중요하다. 행동 표현형 들어, 상당한주의가 변동 인트로를 제한하는 매일 같은 시간에 같은 위치에서 수행되는 테스트를 보장하기 위해 취해 져야한다위치의 참신하거나 활동 일주기의 차이에 의해 선보였. 장비는 유사한 이유로 매일 같은 방식으로 구성되어야한다. 방 조직 신규성의 작은 변화가 큰 마우스의 활성에 영향을 미칠 수있는 활성 시험에 특히 중요하다. 그립의 강도를 측정 할 때, 연구자들은 쥐가 반전하기 전에 메시의 적절한 유지가 있는지 확인해야합니다. 짧은 대기 시간이 가을을 향해 마찬가지로,주의가 왜곡됩니다 제대로 뒷다리 시험 또는 검사 결과에 해제하기 전에 강아지를 일시 중단주의해야한다.
조직 표현형를 들어, 좋은 부분을 얻는 것은 매우 중요합니다. 해부 또는 유물 절편 및 해부하는 동안 발생 및 형태를 왜곡 전에 망막의 유익한 염색 효과적인 정착에 따라 달라집니다. 조직 화학적 염색은 뇌를 필요 효소 기능을 유지하기 위해 박리 후 신속하게 냉동하는 것이 아니라 배양 시간 마찬가지로 비판적이다엘; 온도 나 시간의 길이의 작은 변동은 염색 강도의 차이가 발생할 수 있습니다. 가능하다면, 샘플 그룹 간의 비교를 위하여 동시에 처리되어야한다.
여기에 노화 관련 질환, 즉 PD 및 AMD와 관련된 미묘한 표현형을 표시하는 것으로, 유전자 변형 마우스를 연구하는 데 사용되는 테스트 요법이 설명된다. 이 표현형 스케줄 관심 조직 내에서 구조적 및 기능적 결함 신경근 강도 활동 적자 식별뿐만 아니라, 파악하기 위해 사용될 수있다. 이 일정은 젊은, 유전자 조작 생쥐의 초기 표현형의 체계적인 분석을 제공합니다. 앞으로,이 방법은 물론 통상 명백하게 나타나는 원인 불명의 그와 같은 AMD 또는 PD와 관련 표현형에 존재하는 것으로 어떤 유전자 변형 마우스에 적용 할 수있다. 시험의 단순 상당한 투자없이 테스트 할 수 있지만, 상기의 통지하는데 사용될 수있다tudies. 세포 표현형으로 행동 시험을 조합함으로써, 사용 된 마우스의 수를 제한하고 바로 생리적 조건 동물의 성능을 비교하는 것이 가능하다. 이 표현형 일정 후속 연구의 초점을 지시하는데 사용될 수있는 초기 분석을 제공한다.
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Acknowledgments
이 연구를위한 자금 조달은 진달래 의료 재단과 예일 의과 대학 학장의 연구 기금 (JH)에서왔다. 우리는 행동 실험에 대한 도움말 박사 클레어 코닉 감사합니다. 유전자 조작 마우스 라인 Ozgene (퍼스, 호주)에서 발생 하였다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9 oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 mm x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
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