Summary
Mus produserer et komplekst multisyllabelt repertoar med ultrasoniske vokaliseringer (USVs). Disse USVene er mye brukt som readouts for nevropsykiatriske lidelser. Denne protokollen beskriver noen av praksisene vi lærte og utviklet for konsekvent å indusere, samle og analysere de akustiske funksjonene og syntaksen til musesangene.
Abstract
Mus produserer ultralyd vocalizations (USVs) i en rekke sosiale sammenhenger gjennom utvikling og voksenliv. Disse USVene brukes til mor-pup retrieval 1 , juvenile interaksjoner 2 , motsatte og samme kjønn interaksjoner 3 , 4 , 5 og territoriale interaksjoner 6 . I flere tiår har USVs blitt brukt av etterforskere som proxyer for å studere nevropsykiatriske og utviklings- eller adferdsforstyrrelser 7 , 8 , 9 , og mer nylig for å forstå mekanismer og evolusjon av vokalkommunikasjon blant vertebrater 10 . Innenfor seksuelle samspill produserer voksne mannlige mus USV-sanger, som har noen funksjoner som ligner sangfugler 11 . Bruken av slik multisyllabisk reperToires kan øke potensiell fleksibilitet og informasjon de bærer, da de kan varieres i hvordan elementene er organisert og rekombinert, nemlig syntaks. I denne protokollen beskrives en pålitelig metode for å fremkalle USV-sanger fra hannmus i ulike sosiale sammenhenger, som eksponering for fersk kvinnelig urin, bedøvede dyr og østrushunn. Dette inkluderer forhold for å indusere en stor mengde stavelser fra musene. Vi reduserer opptak av omgivende lyder med rimelige lydkamre, og presenterer en kvantifiseringsmetode for automatisk å detektere, klassifisere og analysere USVene. Sistnevnte inkluderer evaluering av samtale, vokalrepertoar, akustiske parametere og syntaks. Forskjellige tilnærminger og innsikt i bruk av avspillinger for å studere et dyrs preferanse for bestemte sangtyper er beskrevet. Disse metodene ble brukt til å beskrive akustiske og syntaksforandringer på tvers av forskjellige sammenhenger i hannmus, og sangpreferanser hos kvinnelige mus.
Introduction
I forhold til mennesker produserer mus både lav- og høyfrekvensvokaliseringer, senere kjent som ultrasoniske vokaliseringer (USVs) over vårt høreområde. USVene er produsert i en rekke sammenhenger, blant annet fra mor-pup retrieval, juvenile interaksjoner, til motsatte eller samme kjønn vekselvirkninger 4 , 12 . Disse USVene er sammensatt av et mangfoldig multisyllabisk repertoar som kan kategoriseres manuelt 9 eller automatisk 10 , 11 . Disse USVs rolle i kommunikasjon har vært under økende etterforskning de siste årene. Disse inkluderer bruk av USVs som utlesninger av musemodeller av nevropsykiatriske, utviklings- eller adferdsforstyrrelser 7 , 8 og interne motiverende / emosjonelle tilstander 13 . USVene antas å formidle pålitelig informasjon på eMitters tilstand som er nyttig for mottakeren 14 , 15 .
I 2005 avgjorde Hellige og Guo 11 ideen om at voksne mannlige mus-USVer ble organisert som en rekke multisyllabiske samtaleelementer eller stavelser som ligner sangfugler. I mange arter tillater et multisyllabelt repertoar emitteren å kombinere og bestille stavelser på forskjellige måter for å øke den potensielle informasjonen som bæres av sangen. Variasjon i denne syntaksen antas å ha en etologisk relevans for seksuell oppførsel og kompispreferanser 16 , 17 . Etterfølgende studier viste at mannlige mus var i stand til å endre den relative sammensetningen av stavelsetyper de produserer før, under og etter tilstedeværelsen av en kvinne 5 , 18 . Det vil si at de voksne mannlige musene bruker sine USV'er for å opptre i rettssaker, enten for å tiltrekke segEller opprettholde nær kontakt med en kvinne, eller for å lette parringen 19 , 20 , 21 . De blir også utsendt i mannlige interaksjoner, sannsynligvis å formidle sosial informasjon under interaksjoner 4 . For å fange disse endringene i repertoarene, måler forskerne vanligvis spektralfunksjonene (akustiske parametere, for eksempel amplitude, frekvenser, etc. ), antall USVs stavelser eller samtaler, og latens til den første USV. Men få ser faktisk på sekvensdynamikken til disse USVene i detalj 22 . Nylig utviklet vår gruppe en ny metode for å måle dynamiske endringer i USV-stavelsessekvensene 23 . Vi viste at stavelsesordre i en sang om (nemlig syntaks) ikke er tilfeldig, at den endres avhengig av sosial kontekst, og at de lyttende dyrene oppdager disse endringene som etologisk relevante.
Vi noterer degHos mange undersøkere som studerer dyrkommunikasjon, legger ikke til begrepet "syntaks" den samme nøyaktige betydningen som syntaks brukt i menneskelig tale. For dyre kommunikasjon studier, betyr vi bare en ordnet, ikke-tilfeldig rekkefølgen av lyder med noen regler. For mennesker er det også kjent at bestemte sekvenser har spesifikke betydninger. Vi vet ikke om dette er tilfellet for mus.
I denne avisen og tilhørende video tar vi sikte på å gi pålitelige protokoller for å registrere mannlige muss forfølgelse USVer i ulike sammenhenger, og utføre avspillinger. Bruken av tre sekvensielt brukt programvare for: 1) automatiserte opptak; 2) stavelsesdeteksjon og koding; Og 3) en grundig analyse av stavelsesfunksjonene og syntaksen er vist ( figur 1 ). Dette tillater oss å lære mer om mannlige mus USV struktur og funksjon. Vi tror at slike metoder letter dataanalyser og kan åpne nye horisonter som karakteriserer normal og unormal vokalkommunikasjon i mouSe modeller for kommunikasjon og nevropsykiatriske lidelser, henholdsvis.
Protocol
Etikkerklæring: Alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av Duke University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) under protokollen # A095-14-04. Merk: Se tabell 1 i avsnittet " Materialer og utstyr " for detaljer om programvare som brukes.
1. Stimulere og ta opp musen USVs
- Forberedelse av mennene før opptakssesjonene
MERK: De representative resultatene ble oppnådd ved bruk av B6D2F1 / J unge voksne hannmus (7-8 uker gamle). Denne protokollen kan tilpasses for enhver belastning.- Sett lyssyklusen til dyreområdet på en 12-timers lys / mørk syklus, med mindre annet er nødvendig. Følg vanlige boligregler på 4 til 5 menn per bur, med mindre annet er nødvendig eller nødvendig. Tre dager før opptak, avslør menn individuelt til en seksuelt moden og mottakelig kvinne (opptil 3 menn med en kvinne per bur) av samme belastning over natten.
- Neste dag fjernerHunnen fra mannens bur og huser hannene uten hunnene i minst to dager før den første innspillingssesjonen for å øke sosialmotivasjonen til å synge (basert på vår prøve- og feilanekdotiske analyse).
- Klargjøring av innspillingsboksene
- Bruk en strandkjøler (interne dimensjoner er L 27 x W 23 x H 47 cm) for å fungere som lyddempingsboksstudio ( figur 2A ). Bor et lite hull på toppen av boksen for å la mikrofonens ledning løpe inn.
MERK: Innspillingen av dyrene i et lyddempet og visuelt isolert miljø er å foretrekke, for å ta opp dusinvis av mus på en gang uten at de hører eller ser hverandre, forhindrer registrering av forurensende rom for omgivende rom og folk i rommet og for å få ren Lydopptak av musene ( figur 2B ). Vi har ikke notert lyd ekkoer eller forvrengninger til lyden når vi sammenligner vokaliseringer med samme mus inne i forhold til utenfor tHan låter dempningskammeret ( figur 2C ); Det er heller lyder som er høyere og har færre harmonier inne i kammeret. - Koble mikrofonen til ledningen, ledningen til lydkortet og lydkortet til datamaskinen for å jobbe med lydopptaksprogramvare ( f.eks. Programvare A i figur 1 og tabell 1 ). En tilstrekkelig lydopptaksprogramvare er nødvendig, for eksempel programvare A som genererer .wav lydfiler.
- Plasser et tomt bur (58 x 33 x 40 cm) inne i lydisolerte boksen, og juster mikrofonens høyde slik at membranen på mikrofonen er 35 - 40 cm over bunnen av buret, og at mikrofonen er sentrert over buret ( Se figur 2A ).
- Bruk en strandkjøler (interne dimensjoner er L 27 x W 23 x H 47 cm) for å fungere som lyddempingsboksstudio ( figur 2A ). Bor et lite hull på toppen av boksen for å la mikrofonens ledning løpe inn.
- Konfigurasjon av innspillingsprogramvare A ( Tabell 1 ) for kontinuerlig opptak
- Dobbeltklikk og åpne programvare A. Klikk og åpne menyen "konfigurasjon" og velg enheten som heter, Samplingsfrekvens (250.000 Hz), Format (16 bit).
- Velg nøkkelen "Trigger" og velg "Veksle".
MERK: Med denne innstillingen kan du starte opptaket ved å trykke en tast (F1, F2, etc. ) mens du plasserer stimulansen i musens bur. - Skriv inn musens ID under "Navn" -parameteren.
- Angi maksimal filstørrelse til de ønskede minuttene av innspillingen (vanligvis sett til 5 min).
MERK: Jo lenger minuttene er, er det nødvendig med større mengde minne for datalagring. Hvis kontinuerlig modus ikke er innstilt, slår programvaren av sangløp i begynnelsen eller slutten av en sekvens basert på innstilte parametere, og derfor kan man ikke pålitelig kvantifisere sekvenser.
- Ta opp USVs ved hjelp av de forskjellige stimuliene. Merk: Hver stimulus kan brukes uavhengig avhengig av brukerens eksperimentelle behov.
- Løft forsiktig dyret som skal registreres av halen, og legg det i et bur uten sengetøy (for å hindre bevegelseEment støy på sengetøyet) inne i lydisolerte boksen, og sett buret åpent kablet metalllokk på toppen av det, med lokket vendt oppover.
- Lukk lyddempet boks og la dyret habituere til det i 15 minutter. Utfør stimulipreparatet (1.4) for øyeblikket.
- Stimuli forberedelse
- Fremstilling av friske urin (UR) prøver som en stimulus
- Oppnå urinprøver i maksimalt 5 minutter før opptakssesjonen for å sikre maksimal effekt i induserende sang fra hannene. MERK: Urin som har satt seg lenger, og spesielt for timer eller over natten, er ikke like effektiv 24 , 25 , som vi har empirisk verifisert 23 .
- Velg en kvinne eller en mann (avhengig av kjønn av stimulansen som skal brukes) i ett bur, ta tak i huden bak nakken og hold dyret i en hånd som for en injeksjonsprosedyre med magen eksponert.
- Deretter velger du et annet bur. Og gjenta samme prosedyre med en annen kvinne eller en mann, men med den samme bomullspinnen som tidligere ble brukt.
MERK: Denne prosedyren sørger for at du blander urinen med minst to kvinner eller menn fra to uavhengige bur på samme bomullsspiss for å sikre mot østrus eller andre individuelle effekter som det er kjent at østrus syklus kan påvirke sangadferd 18 , 26 . - Legg bomullsspissen til bruk i et rent glass eller plast petriskål.
MERK: Siden bomullsspissen med urin må brukes innen de neste 5 minutter, er det ikke nødvendig å dekke det for å forhindre fordampning.
- preparatiPå av den levende kvinnelige (FE) stimulus som en stimulus
- Velg ett eller to nye bur av seksuelt modne kvinner. Identifiser kvinner i pro-estrus eller østrus-scenen ved visuell inspeksjon (bred vaginaåpning og rosa surround som vist i 27 , 28 ). Skille dem i et annet bur til bruk.
- Forberedelse av de bedøvede dyrene kvinner (AF) eller hanner (AM) som en stimulus
- For AF velger du en kvinne fra bassenget ovenfor (enten i pro-estrus eller østrus). For AM velger du en mann fra et bur av voksne hannmus.
- Bedøv kvinne eller mann med en intraperitoneal injeksjon av en oppløsning av henholdsvis ketamin / xylazin (henholdsvis 100 og 10 mg / kg).
- Bruk øyesalve for å forhindre dehydrering av øynene mens dyret er bedøvet. Sjekk riktig bedøvelse ved å teste paw retraction reflex når klemmet. Plasser bedøvelsesdyret i et rent bur på et papirhåndkle, hvittH buret på varmeputen satt på "minimumsvarme" for å sikre kontroll over kroppstemperaturen.
- Gjenbruk de samme dyrene opptil 2 til 3 ganger for forskjellige opptaksserier om nødvendig før de våkner (vanligvis rundt 45 minutter). Sett dem tilbake på varmeputen etter hver opptaksøkt.
- Kontroller luftveiene ved visuell inspeksjon (~ 60-80 puste per minutt) og kroppstemperatur ved å berøre dyret hvert 5. minutt (bør være varm for å berøre).
- Når du er klar til å spille inn, klikker du på "Record" -knappen til programvare A.
MERK: Innspillingene starter ikke med mindre brukeren klikker på tasten som er knyttet til hver kanal. Overvåke levende lydmating fra burene på dataskjermen for å sikre at dyrene synger og opptakene er riktig oppnådd. - Trykk samtidig på den tilhørende nøkkelknappen til ønsket boks (e) som skal registreres ( dvs. F1 for boks 1), og innfør ønsket stimulus.
- Presenter en av stimuliene som følger. Legg bomullsspissen med friske urinprøver inne i buret, eller legg den levende kvinnen inne i buret, eller plasser et av de bedøvede dyrene (AF eller AM) på toppen av burets metalllokk.
- Lukk opptaksboksen stille, og la opptaket gå for det forutbestemte antall minutter ( f.eks. 5 minutter som beskrevet i avsnitt 1.3).
- Etter opptak klikker du på den røde knappen for å stoppe opptaket.
- Hvis et bedøvet dyr ble brukt som en stimulus, åpner du den lydisolerte registreringsboksen, tar det bedøvede dyret fra burets metalllokk og legger det tilbake på varmeputen før neste opptakssesjon, eller hvis du ikke lenger bruker dyret som en stimulanskontroll Det hvert 15. minutt til det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
- Åpne buret og fjern det bevisste testdyret, og legg det tilbake til sitt hjem bur. Rengjør testburet med 70% alkohol aOg destillert vann.
- Fremstilling av friske urin (UR) prøver som en stimulus
2. Behandling .wav-filer og Syllbar koding ved hjelp av Mouse Song Analyzer v1.3
- Åpne kodingsprogramvare B ( Figur 1 , Tabell 1 ) og legg mappen som inneholder Programvare Script C av "Musesanganalysator" ( Figur 1 , Tabell 1 ) i programvarens B-sti ved å klikke på "angi sti" og legg til mappen på programvare B. Lukk deretter programvare B for å lagre.
- Konfigurer den kombinerte programvaren B + Cs stavelsesidentifikasjonsinnstillinger. MERK: Programvaruscript C-koden oppretter automatisk en ny mappe kalt "sonogrammer" med filer i .sng-format i samme mappe hvor .wav-filene er plassert. Det er vanligvis bedre å sette alle .wav-filer fra samme opptakssesjon generert ved hjelp av programvare A i samme mappe.
- Åpne programvare B konfigurert med C.
MERK: Denne versjonen av programvare B er helt cUmpatible med programvare script C. Det kan ikke garanteres at noen senere versjoner vil akseptere alle funksjonene som er inkludert i gjeldende kode. - Naviger til mappen av interesse som inneholder innspillingen .wav-filer som skal analyseres ved hjelp av vinduet "Gjeldende mappe".
- I "kommandovinduet" skriver du inn kommandoen "whis_gui".
- I det nye whis-gui-vinduet, observere flere delvinduer med forskjellige parametre ( figur 3 ), inkludert "Sonogram Parameters", "Whistle Options" og alle andre. Juster parametrene for å oppdage USVs. Bruk følgende parameterinnstillinger for å oppdage USVs stavelser fra laboratoriemus ( f.eks. B6D2F1 / J og C57BL / 6J musestammer brukt i våre studier):
- I avsnittet Sonogramparametre, juster Minfrekvensen til 15.000 Hz, Maxfrekvensen til 125.000 Hz, prøvetakingsfrekvensen ( Antall frekvenser ) tO 256 kHz og terskelen til 0,3.
- I delen Whistle Options, juster du Renhetstærskelen til 0,075, Min Varighet av stavelsen til 3 ms, Minfrekvens feier til 20.000 Hz, og Filtervarigheten til 3 ms.
- I de andre seksjonene, juster Min Notatlengde til 3 ms, og Min Note Count til 1.
- For stavelse kategorisering protokoll , velg bokser i den midterste delen av whis_gui vinduet:
Standardkategoriseringen er basert på Holy and Guo 11 og Arriaga et al. 10 , som koder stavelse ved antall tonehopp og retningen av hoppet: S for enkel kontinuerlig stavelse; D for en nedhøydehopp; U for en opphøyd hoppe; DD for to sekvensielle ned hopper; DU for en dowN og en hoppe opp; Etc. Dette vil være standard hvis brukeren ikke velger noe. Brukeren har muligheten til å kjøre analysen på visse stavelsetyper ved å velge hver av de representative boksene.
Å velge kategorisering av stavelser som beskrevet av Scattoni et al. 9 , i tillegg velg Split s kategori, som skiller denne typen inn i flere underkategorier basert på stavform.
Velg Harmonics hvis brukeren vil videre sortere stavelser i de med og uten harmoniske.
- Åpne programvare B konfigurert med C.
- Klassifiser stavelsene i .wav-filene av interesse
- Velg alle .wav-filer fra en opptakssesjon i den øvre venstre delen av whis_gui-vinduet.
- Klikk på "Få sonogrammer" midt i whis_gui-vinduet ( Figur 3 ). En ny mappe med sonogramene vil bli opprettet, med .sng filformat. Velg alle sonogrammer (.sng-filer) i øvreVenstre hjørne av whis-gui-vinduet. Skriv inn "Animal ID" og "Session ID" i boksene under sonogramfilvinduet. Klikk deretter på prosess sonogrammer.
- Følg tre filtyper i sonogrammappen: "Animal ID-Session ID -Notes.csv" (inneholder informasjon om notatene hentet fra stavelsene), "Animal ID-Session ID -Syllables.csv", (inneholder verdier for alle de Klassifiserte stavelser, inkludert deres spektrale funksjoner og totalt antall stavelser oppdaget i sonogrammer), "Animal ID-Session ID -Traces.mat", (inneholder grafiske representasjoner av alle stavelsene).
MERK: Filen "Animal ID-Session ID -Syllables" inneholder noen ganger en liten prosent (2-16%) av uklassifiserte USV-stavelser som er mer komplekse enn de valgte, eller som har to dyrs stavelser overlappende hverandre 23 . Disse kan undersøkes separat fra sporfilen om nødvendig.
- Følg tre filtyper i sonogrammappen: "Animal ID-Session ID -Notes.csv" (inneholder informasjon om notatene hentet fra stavelsene), "Animal ID-Session ID -Syllables.csv", (inneholder verdier for alle de Klassifiserte stavelser, inkludert deres spektrale funksjoner og totalt antall stavelser oppdaget i sonogrammer), "Animal ID-Session ID -Traces.mat", (inneholder grafiske representasjoner av alle stavelsene).
3. Kvantifisering av Syllbar Akustisk Struktur og Syntax
MERK: Instruksjoner for trinnene for å ta for første syntaksanalyser er inkludert i "READ ME!" Regneark av filen "Sanganalyseguide v1.1.xlsx", vår spesialdesignede regnearkkalkulator E ( figur 1 , tabell 1 ).
- Åpne programvaruskriptet C-filutgang "Animal ID-Session ID -Syllables.csv" oppnådd i seksjonen ovenfor med regnearkprogramvare D ( Figur 1 , Tabell 1 ). Den inneholder det totale antallet stavelser som er oppdaget i alle sonogrammer, og alle deres spektrale egenskaper.
- Hvis ikke konvertert ennå, konverterer regnearkprogramvaren D denne .csv-filen til kolonneparasjen i programvare D for å sette hver verdi i individuelle kolonner.
- Åpne filen "Sanganalyseguide v1.1.xlsx" også i programvare D. Deretter klikker du på thE-regneark, og kopier og lim inn fildataene "Animal ID-Session ID -Syllables.csv" i dette arket som anbefalt i instruksjonene i malarket. Fjern rader med kategorien "Uklassifisert" av stavelser.
- Etter å ha fjernet de "Uklassifiserte" radene, må du først kopiere og beregne ISI (mellom stavelsesintervall) data i kolonne O i kolonne E. Deretter kopieres alle data fra kolonne A til N til 'Data'-regnearket.
- I dataregnearket skriv inn dyre-IDene (kolonne AF) og innspillingslengde (i minutter, kolonne AC).
MERK: Dyr-IDene må samsvare med den som er angitt i opptakssettet. Filen vil oppdage tegnene som er oppgitt og sammenligne den med navnet på .wav-filene. - Bestem ISI cutoff for å definere en sekvens ved å bruke regnearket merket "Density ISI", "ISI plot" resultat.
MERK: I vår tidligere studie 23 setter vi cutoff på to standaRd avvik fra sentrum av siste topp. Den besto av lange intervaller (LI) på mer enn 250 ms, som adskilt forskjellige sangkonkurranser i en sangesang. - Se de viktigste resultatene i regnearket 'Funksjoner' (gruppering av alle spektrale funksjoner målt fra hvert dyr).
MERK: Hvis brukeren brukte standard stavelse kategori innstillingen i programvare script C beskrevet i avsnitt 2.8.9, stavelsene blir deretter videre klassifisert i 4 kategorier som beskrevet ovenfor og i Chabout et al. 23 : 1) enkel stavelse uten noen sprangspring, «s»; 2) to notat stavelser skilt av et enkelt oppover («u») hopp; 3) to notat stavelser separert av et enkelt nedover hopp («d»); Og 4) mer komplekse stavelser med to eller flere tonehopp mellom notater («m»). - For syntaksverdier, klikk på "Global Probabilities" regnearket som beregner sannsynlighetene for hvert par sYllable overgangstyper uavhengig av start stavelser, ved hjelp av følgende ligning 23 .
P (Forekomst av overgangstype) = Totalt antall forekomster av overgangstype / Totalt antall overganger av alle typer - Klikk på 'Conditional probabilities' regnearket for å beregne betingede sannsynligheter for hver overgangstype i forhold til startstavelser, som bruker følgende ligning:
P (forekomst av overgangstype gitt startstavelse) = Totalt antall forekomster av overgangstype / Totalt antall forekomster av alle overgangstyper med samme start stavelse - For å teste om og hvilken av de ovennevnte overgangssannsynlighetene er forskjellig fra ikke-tilfeldig, ved å bruke en førstegangs Markov-modell, følg tilnærmingen i 23 , for å bruke tilpasset programvare F ( f.eks. Syntax-dekoratør i R-studio, Figur 1 , <Strong> Tabell 1) med følgende R-skript: Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Contexts.R for innenfor grupper i forskjellige forhold; Eller Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Genotypes.R for mellom grupper under de samme forholdene.
- Utfør en Chi-firkantprøve eller en annen test av dine preferanser, for å teste for statistiske forskjeller i overgangssannsynlighetene for det samme dyret i forskjellige sammenhenger (parvis), etter tilnærmingen i 23 .
MERK: Flere opplysninger om den statistiske modellen som brukes til å sammenligne syntaks blant grupper, finnes i 23 . Forskere kan bruke andre tilnærminger til å analysere de globale eller betingede overgangssannsynligheter som de eller andre utviklet. - For å grafisk vise sekvensene som syntaksdiagrammer, skriv inn verdiene i et nettverksgraferingsprogram G (se Figur 1 , Tabell 1 ), med noder som angir forskjellig stavelse cateGorier og pilfarge og / eller tykkelse piksel representerer rekkevidde av sannsynlighetsverdier mellom stavelser.
MERK: For klarhet, for de globale sannsynlighetsgrafer, viser vi bare overganger høyere enn 0.005 (høyere enn 0,5% av tilfeldighetene). For de betingede sannsynlighetene bruker vi en terskel på 0,05 fordi hver sannsynlighet i den "globale modellen" er lavere vurderer at vi deler med totalt antall stavelser og ikke bare av en bestemt stavelsestype.
4. Sangredigering og testpreferanse for en type sang
MERK: Avspillinger av USV kan brukes til å eksperimentelt teste et dyrs adferdsrespons, inkludert preferanse for en bestemt sangtype. Fordi kvinnelige preferanser kan endres avhengig av østrus tilstand, sørger kvinner for at de er i samme østrus tilstand før de testes som følger:
- Forbered kvinner med seksuell opplevelse flere dager før avspillingseksperimentet
- Overvåk østrus syklusen, og når pro-estrus eller estrus er tydelig (vaginal åpning og rosa surround som vist i 27 ), sett kvinner tilbake i eget bur. De er klare til å bli testet neste dag.
- Bruk kopiene og lim inn funksjonene i en lydbehandlingsprogramvare H ( f.eks. SASLap Pro; Figur 1 , Tabell 1 ) for å lage to redigerte .wav-filer med de ønskede betingelsene som skal brukes til stimuli. For å beskytte mengden vokaliseringer som en variabel, sørg for at de to lydfilene inneholder det samme antall sYllables og lengde av sekvenser (sangkonkurranser) fra samme eller forskjellige menn / kvinner fra de ønskede sammenhenger ( f.eks. UR).
- Åpne den første filen som inneholder sang fra tilstand 1 i programvare H. Deretter går du til Arkiv> Tilbud> Legg til kanal (er) fra fil, og velg den andre lydfilen som skal testes fra tilstand 2. Dette skaper 2 kanaler, en for hver tilstand.
- Juster volumet visuelt om nødvendig for å sikre at volumene til de to filene samsvarer med hverandre, ved å gå til Rediger> Volum.
- Gå deretter til Rediger> Format> Sampling Frequency Conversion, og velg konverter fra 250.000 Hz til 1.000.000 Hz for å transformere .wav-filene fra en samplingsfrekvens på 256 kHz til 1 MHz. Dette trinnet er nødvendig for avspillingsenheten å lese .wav-filene.
- Lagre disse nye filene som testfiler som skal spilles av. Pass på å identifisere hvilken sang som er i hvilken kanal (1 eller 2). For klarhetens formål kaller det "filnavn.wav".
- Gå til EXit> Format> Bytt kanal og bytt de to kanalene. Lagre bytteversjonene ved hjelp av et annet navn. MERK: Dette vil være motsatt kopi med kanalene invertert, navngitt senere 'filnavn_swapped.wav'.
- Rengjør avspillingsapparatet "Y-labyrint" med 70% alkohol etterfulgt av destillert vann. Tørk det med papirhåndklær. Vår Y-labyrint er et hjemmelaget, ugjennomsiktig, solidt svart plastapparat med 30 cm lange armer og to borede hull på labyrintens ytre ender for å tillate ultralydhøyttaleren å passe på gulvnivå på armene ( figur 4A ).
- Pass på at høyttalerne er i riktig posisjon og koblet til lydkortet, og kortet er koblet til datamaskinen.
- Åpne programvare A, velg Spill av> Enhet og velg avspilling lydkort-enhet. Velg "bruk fil header rate". Gå til Spill> Spilleliste og last filen av interesse som inneholder de to chaNnels ( dvs. "file.wav"). Velg "sløyfe modus". Sett opp videoopptakeren over labyrinten for å dekke hele labyrinten.
- Plasser testkvinnen i labyrinten i en 10-minutters oppholdsperiode. Etter 10 minutter, dersom kvinnen ikke er i startarmen, skyv forsiktig hunnen tilbake til startarmen, og lukk plastskillevinduet.
- Velg den forberedte filen ("file.wav") for å avspille og spille den. Start videoinnspillingen, og sørg for å identifisere hvilken kanal som er plassert på hvilken Y-labyrints arm ( dvs .: UR i venstre eller FE i høyre arm) med et notat i videoopptakingsfeltet.
- La kvinnen høre sangene i sløyfe og utforske labyrinten i et ønsket antall minutter ( dvs. 5 min): dette er en økt. Sett kjeften tilbake i startarmen. Tillat henne å hvile i 1 minutt mens du forbereder neste økt. RemHar noen urinspor og ekskrement med destillert vann.
- Last inn filen "file_swapped.wav". Bytt plasseringen av papirnotene for videoopptaket. Flytt den venstre til høyre og omvendt. Etter 1 min spiller du filen. Frigjør kvinnen for den andre økten .
- Gjenta trinn 4.4.3 til 4.4.4 i totalt 4 økter x 5 minutter for å kontrollere for å oppdage potensiell sideforspenning under testen. Stopp videoopptaket på slutten av alle økter ved å klikke på den røde stoppknappen. Rengjør labyrinten med 70% alkohol og destillert vann mellom kvinner.
- Gjenta alle trinnene med forskjellige sangeksempler en uke senere med de samme kvinnene for å oppnå tilstrekkelige resultater for å teste påliteligheten av funnene.
- Senere observere videoene, og bruk timeren på videoen og et stoppeklokke for å måle tiden som kvinnene bruker i hver arm for hver økt. Analyser de resulterende dataene statistisk for mulige sanginnstillinger.
Representative Results
I dagens protokoll ble endringer i vokaladferd og syntaks av mannlige B6D2F1 / J-mus preget. Ved hjelp av denne protokollen kunne vi i gjennomsnitt registrere per mann per 5 min økt 675 ± 98,5 klassifiserte stavelser som svar på kvinnelig UR, 615,6 ± 72 i FE, 450 ± 134 i AF, 75,6 ± 38,9 i AM og 0,2 ± 0,1 i mannlig UR (n = 12 hanner). Prisene var ~ 130 stavelser / min for kvinnelige UR, ~ 120 stavelser / min for FE, eller ~ 100 stavelser / min for AF-sammenhenger ( Figur 5A ). Hannene produserer en mye større mengde stavelser som svar på nyoppsamlet urin i forhold til over natten oppsamlet urin 10 , 23 . Hanner synger også betydelig mindre i nærvær av en bedøvet mannlig eller fersk mannlig urin Figur 5A ). Hannene endrer også deres repertoar i sammenheng 23 . For eksempel øker B6D2F1 / J hannene betydelig Produksjon av flere stavspring "m" kategori stavelser i den kvinnelige urin tilstanden ( Figur 5B ). De endrer også akustiske egenskaper av individuelle stavelser over kontekst. For eksempel synger B6D2F1 / J hanner stavelser med høyere amplitude og båndbredde i kvinnelig urinkontekst, og høyere spektral renhet i den våte kvinnelige konteksten sammenlignet med de andre ( figur 6 ) 23 .
Denne protokollen gir også et middel for å måle dynamiske funksjoner i sekvensen og dermed syntaxendringer. Ved å bruke en tilpasset metode fra Ey et al. 22 , bruker vi ISI til å definere gapene mellom sekvenser ( Figur 7A ) 23 , og deretter bruke gapene til å skille og analysere temporale mønstre av stavelsessekvenser. Vi viste lengre sekvenslengder er produsert i den våte kvinnelige konteksten ( Figur 7B )F "> 23. Denne teknikken tillater oss å beregne forholdet mellom komplekse sekvenser (sammensatt av minst 2 forekomster av" m "stavelsestype) versus enkle sekvenser (sammensatt av en eller ingen" m "-type og dermed mest av" S "-type). Vi fant at med B6D2F1 / J hannene utløste kvinnekininkonteksten et høyere forhold sammenlignet med de andre ( figur 7C ) 23 , noe som indikerer at de produserte mer komplekse stavelser i den kvinnelige urintilstanden, men også at slike stavelser distribueres Over flere sekvenser.
Vi kan også beregne de betingede overgangssannsynlighetene fra en stavelsestype til en annen (24 overgangstypen totalt inkludert overgangene fra og til "stillhet" -tilstanden) 23 . Vi fant at i forskjellige sammenhenger er musens valg av overgangstyper for gitt start stavelser forskjellig, og at det er flere syntax divErstatning i den kvinnelige urintilstanden ( figur 8 ) 23 . Disse observasjonene er i tråd med tidligere rapporter som viser at menn kan endre de akustiske egenskapene eller repertoarens sammensetning av vokaliseringene som følge av ulike stimuli og erfaringer 4 , 5 , 24 .
Endelig gir den nåværende protokollen veiledning for å teste kvinnelige preferanser med avspillinger. Vi fant at B6D2F1 / J kvinner foretrekker mer komplekse sanger (som inneholder 2 eller flere "m" stavelser) i forhold til enkle sanger 23 . De fleste kvinner valgte å bli oftere på siden av Y-labyrinten som spilte kompliserte sanger ( figur 4B ).
Figur 1: Flytdiagram over SofTware Bruk og analyser. Hvert program og tilhørende kode er gitt et brevnavn for å forklare deres identitet og bruk i hovedteksten. I () er de spesifikke programmene vi bruker i protokollen vår. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppsett for innspilling av mannmusssang. (A) Bilde av en lyddempingsopptaksboks og satt opp for å registrere USV-vokaliseringer. (B) Eksempel på sonogram av et opptak laget med Software A ( Tabell 1 ), inkludert detaljerte spektrale funksjoner beregnet av "Mouse Song Analyzer v1.3": varighet, inter-syllable intervall (ISI), toppfrekvens min (Pf min) Toppfrekvens maks (Pf max), toppfrekvensstart (Pf start), toppfrekvens Ende (Pf ende) og båndbredde. (C) Sonogrammer av en annen mannlig sang til en levende kvinne, inne i lyddempingsboksen og utenfor boksen på laboratoriebenken i samme rom. Våre anekdotiske observasjoner indikerer at opptakene i boksen til det samme dyret viser større volum (sterkere intensitet) og mindre harmoniske, men ingen tegn på ekko i esken uten lydskum. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjermbilde av vinduet "Mus Song Analyzer v1.3" whis_gui Viser de forskjellige alternativene som er tilgjengelige for analyser. Parametrene som vises er brukt til å registrere mannlige USV i figurene og dataanalyser presentert (unntatt min notat varighet var 3 ms). .com / files / ftp_upload / 54137 / 54137fig3large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kvinnevalg mellom avspillinger av komplekse og enkle sanger. (A) Bilde av Y-danseapparatet som brukes og dimensjonsmålinger. (B) Tid brukt av kvinnene i hver arm, spiller enten fra en komplisert (kvinnelig urin fremkalt) eller enklere (våken kvinnelig fremkalt) sang fra samme mann. Data presenteres for n = 10 B6D2F1J kvinnelige mus som gjennomsnitt ± SE, med individuelle verdier også vist; 9 av de ti kvinnene viste en preferanse for den mer komplekse stavelsen / sekvensen sangen. * P <0,05 paret student t-test. Figur endret fra Chabout et al. 23 med tillatelse.Blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Antall Syllables Emitted og Repertoire Over Conditions . (A) Syllbar produksjon av menn i ulike sammenhenger. (B) Repertoar komposisjoner av menn når i nærvær av kvinnelig urin (UR), bedøvet kvinne (AF), våken kvinne (FE) og bedøvede mannlige (AM) sammenhenger. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. * P <0,03; ** p <0,005; *** p <0,0001 for post-hoc-paret student t-test etter Benjamini og Hochberg korreksjon (n = 12 menn). Figur fra Chabout et al. 23 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
together.within-page = "1"> 
Figur 6: Eksempler på spektrale funksjoner i forskjellig sammenheng. (A) Amplitude. * P <0,025 for post-hoc-paret student t-test etter korreksjon. (B) Frekvensområde eller båndbredde. *: P <0,041; **: p <0,005; ***: p <0,0001 etter korreksjon. (C) Spektral renhet av stavelsene. * P: <0,025; **: p <0,005; ***: p <0,0001 etter korreksjon. Forkortelser: kvinnelig urin (UR), bedøvet kvinne (AF), våken kvinne (FE) og bedøvet mann (AM). Tallene modifisert fra Chabout et al. 23 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
37fig7.jpg "/>
Figur 7: Sekvensmålinger. (A) Bruk av ISI for å skille sekvensen. Kort ISI (SI) og middels ISI (MI) brukes til å skille stavelser i en sekvens, og lang ISI over 250 ms (LI) skiller to sekvenser. (B) Lengden på sekvensene, målt som antall stavelser per sekvens, produsert av hanner i forskjellige sammenhenger. *: P <0,025; ** p <0,005; *** p <0,0001 etter korreksjon. (C) Forholdet mellom komplekse sanger over enkle sanger produsert av menn i ulike sammenhenger. * P <0,041; ** p <0,005; *** p <0,0001 etter korreksjon. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM (n = 12 menn). Figur fra Chabout et al. 23 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Syllbare syntaksdiagrammer av sekvenser basert på betingede muligheter for hver kontekst. Piltykkelsen er proporsjonal med den betingede sannsynligheten av en overgangstype i hver kontekst i gjennomsnitt fra n = 12 hanner: P (forekomst av en overgang gitt startstavelsen). For tydelighet er sjeldne overganger under en sannsynlighet på 0,05 ikke vist. Figur fra Chabout et al. 23 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne protokollen gir tilnærminger til å samle, kvantifisere og studere mannlige museprospedisjoner i laboratoriet på tvers av en rekke hovedsakelig kvinnelige relaterte stimuli. Som vist tidligere i Chabout et al. 23 og i de representative resultatene, fikk bruk av denne metoden oss til å oppdage kontekstavhengige vokaliseringer og syntaks som betyr noe for de mottakende kvinnene. Standardiseringen av disse stimuliene vil gi innsamling av et pålitelig antall USV'er og tillate detaljerte analyser av mannens rettssanger og repertoarer.
Når en levende kvinne er til stede hos hannen, tillater protokollen ikke oss å tydelig identifisere emitteren av vokaliseringene. Tidligere studier viste imidlertid at flertallet av vokalisasjonene utgitt i en slik sammenheng var av mann 26 , 29 . De fleste av studiene bruker en spesifikke (mann eller kvinne)Som et stimulus for mennene tror at mengden kvinners vokaliseringer i disse sammenhengene er ubetydelig 4 , 5 , 22 , 30 . Imidlertid brukte en nylig papir anvendt triangulering til å lokalisere vokaliseringen av emitteren i gruppebehørte betingelser 31 , og viste at i en dyed bidrar kvinnen til ~ 10% av USVene. I den foreliggende protokollen tillater bruken av den bedøvede kvinnen at brukeren studerer mannlige vokaliseringer i nærvær av en kvinne uten hennes vokalisering. I motsetning til forventningene til denne nylige studien 31 fant vi ingen forskjell i antall stavelser utstilt mellom FE og AF-betingelsene 23 . Det er mulig at levende kvinner ikke bidro signifikant til opptakene, eller at mennene vokaliserte mindre i nærvær av levende kvinner mot anestesiert females. Likevel tror vi at fremtidige eksperimenter bør vurdere bruken av denne trianguleringsmetoden for å vurdere den potensielle effekten av kvinnelige bidrag.
Det finnes annen programvare tilgjengelig som kan gjøre noen trinnene vi har skissert, selv om vi ikke tror på en måte som er tilstrekkelig for de spørsmålene vi spurte ved hjelp av en kombinasjon av tre programmer: Software A, Mouse Song Analyzer programvare skript C ved hjelp av programvare B, Syntaksanalyseprogramvare ved hjelp av en D + E-beregning av egendefinerte regnearkprogrammer og syntaksdekorere ved hjelp av R. For eksempel har et nylig papir foreslått en programvare med navnet VoICE som lar brukeren automatisk trekke ut akustiske variabler fra sonogrammer eller direkte på enheter som var manuelt Valgt av brukeren 32 . Men de automatiserte eller semi-automatiserte sekvensanalysene er ikke like detaljerte som vår tilnærming. Noen kommersielle programvare kan automatisk analysere de akustiske egenskapene, men gir ikke en bilAtisk klassifisering av stavelsene; Brukeren må sortere de forskjellige stavelsene etterpå. Grimsley, Gadziola, et al. 33 utviklet et tabellbasert virtuelt mus vokalorganprogram som klynger stavelser basert på delte akustiske funksjoner, men gir ikke automatisk gjenkjenning av stavelsene. Deres program 34 er unikt ved at det skaper nye sekvenser fra innspilte sanger ved hjelp av Markov-modeller, og har dermed mer avanserte funksjoner enn enkel redigering.
De fleste tidligere kommunikasjonsstudier på mus har fokusert på emitterens side 35 , 36 . Få studier har undersøkt mottakerens side 30 , 37 , 38 . Avspillings- og diskrimineringsprotokoller gir en enkel test for å studere mottakers side, som den som også nylig er beskrevet av Asaba, Kato, etal. 39 . I den studien brukte forfatterne en to-valg test boks skilt med akustisk skum i stedet for Y-labyrintboksen som er beskrevet her. Begge valgoppsettene har fordeler og ulemper. For det første isolerer Y-labyrinten ikke lyden fra den ene armen til den andre, men tovalgskassen gjør det. Imidlertid kan dyret ved å bruke Y-labyrinten raskt vurdere de to sangene som spilles samtidig, og bevege seg mot den foretrukne. Likevel hjelper avspillingseksperimenter generelt eksperimenter med å bestemme betydningen og dermed funksjonene til vokaliseringene som genereres for spesifikke dyr. I konklusjonen, etter å ha behersket teknikkene til denne protokollen og analysene, bør leserne kunne adressere mange spørsmål som påvirker konteksten, genetikken og neurobiologien til musen USVs.
Ved hjelp av B6D2F1 / J-mus utløses de kvinnelige assosierte stimuliene nesten alltid USVs fra hannene vi har testet i vårt laboratorium. Det er kritisk å kollegaCt nok stavelser (> 100 i 5 min) for å kunne få sterk statistisk analyse. For å feilsøke, hvis ingen USV er registrert (eller ikke nok), kontroller du konfigurasjonen for å sikre at lydene blir tatt opp. Gjør en levende inspeksjon av hva som skjer i buret under opptak ved å se på sanntids sonogrammet på dataskjermen etter introduksjonen av stimulansen. Ellers forsøk å re-eksponere hannen til en seksuelt moden / mottakelig kvinne over natten, og husk dem alene i flere dager eller opptil en uke før du tar opp igjen. Basert på anekdotiske observasjoner, finner vi at noen hanner synger mye på en dag (for nesten hele 5 min), og ikke mye neste dag, og så igjen en annen dag. Vi vet ikke hvorfor slike innenfor fagvariabilitet oppstår, men vi antar at det sannsynligvis er en motiverende eller sesongmessig for mennene, og estrusstaten for kvinnelig urin. Hvis det ikke er registrert noen USV'er, kan du prøve å registrere dyret på flere dager for å hente disse variabelen. UNLIke i sangfugler, har vi ikke notert åpenbare forskjeller i mengden sang basert på tid på dagen. Vi finner at mennene ikke synger mye (<100 stavelser om 5 min) før de er 7 uker gamle.
Deteksjonsmetodene som presenteres her, kan trekke ut tusenvis av stavelser og alle de akustiske parametrene om noen få minutter. Men som en hvilken som helst automatisk deteksjonsmetode er den svært følsom overfor bakgrunnsstøy. Ved bruk av Mouse Song Analyzer-programvaren med støyende opptak (for eksempel fra dyr registrert med sengetøy) kan det bli nødvendig å justere gjenkjenningsgrensen for å gi mer fleksibilitet. Dette vil imidlertid også øke antall falske positive stavelser, og den automatiske deteksjonen kan mislykkes. Under slike omstendigheter kan manuell koding brukes.
Som nevnt tidligere er antallet, repertoarene og latensen av vokaliseringer varierte avhengig av belastningen, og man må derfor endre parametere (innspillingslengde,Stimulering, automatisert stavelsesdeteksjon, etc. ) for enkelte stammer for å sikre optimale innspillinger for statistiske analyser.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Howard Hughes Medical Institute midler til EDJ. Vi takker Pr. Sylvie Granon (NeuroPSI - Universitetet Paris sør XI - FRANKRIKE) for å låne oss høyttalermaskinen. Vi takker også medlemmer av Jarvis Lab for deres støtte, diskusjoner, rettelser og kommentarer til dette arbeidet, spesielt Joshua Jones Macopson for hjelp med figurer og testing. Vi takker Dr. Gustavo Arriaga for å få hjelp med Mus Song Analyzer-programvaren, oppgradere den for oss til V1.3 og andre aspekter av denne protokollen. V1.0 av programvaren ble utviklet av Holy and Guo, og v1.1 og v1.3 av Arriaga.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sound proof beach cooler | See Gus paper has more info on specific kind | Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm): | |
| Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | Includes extension cable |
| Ultrasound Gate 1216H sound card | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34175 | 12 channel sound card |
| Ultrasound Gate Player 216H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #70117 | 2 channels playback player |
| Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #60103 | 2 playback speakers |
| Test cage | Ace | #PC75J | 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas |
| plexiglas separation | home made | - | 4 x 13 cm plexiglas with 1 cm holes |
| Video camera | Logitech | C920 | logitech HD Pro webcam C920 |
| Heat pad | Sunbeam | 722-810-000 | |
| Y-maze | Home made | - | Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm): |
| Tweezers | |||
| Software | |||
| Avisoft Recorder (Software A) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
| MATLAB R2013a (Software B) | MathWorks | - | MATLAB R2013a (8.1.0.604) |
| Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) | Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_ v1.3-2015-03-23.zip |
|
| Microsoft Office Excel 2013 (Software D) | Microsoft | - | Microsoft Office Excel |
| Song Analysis Guide v1.1 (Software E) | Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx | |
| Syntax decorder v1.1 (Software F) | Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis - in R studio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | |
| Graphiz (Software G) | AT&T Research and others | http://www.graphviz.org | |
| Avisoft SASLab (Software H) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
| Reagents | |||
| Xylazine (20 mg/mL) | Anased | - | |
| Ketamine HCl (100 mg/mL) | Henry Schein | #045822 | |
| distilled water | |||
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | |
| Cotton tips | |||
| Petri dish |
References
- Amato, F. R., Scalera, E., Sarli, C., Moles, A. Pups call, mothers rush: does maternal responsiveness affect the amount of ultrasonic vocalizations in mouse pups. Behav. Genet. 35, 103-112 (2005).
- Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PloS ONE. 2, e351 (2007).
- Moles, A., Costantini, F., Garbugino, L., Zanettini, C., D'Amato, F. R. Ultrasonic vocalizations emitted during dyadic interactions in female mice: a possible index of sociability. Behav. Brain Res. 182, 223-230 (2007).
- Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PloS ONE. 7, e29401 (2012).
- Yang, M., Loureiro, D., Kalikhman, D., Crawley, J. N. Male mice emit distinct ultrasonic vocalizations when the female leaves the social interaction arena. Front. Behav. Neurosci. 7, (2013).
- Petric, R., Kalcounis-Rueppell, M. C. Female and male adult brush mice (Peromyscus boylii) use ultrasonic vocalizations in the wild. Behaviour. 150, 1747-1766 (2013).
- Bishop, S. L., Lahvis, G. P. The autism diagnosis in translation: shared affect in children and mouse models of ASD. Autism Res. 4, 317-335 (2011).
- Lahvis, G. P., Alleva, E., Scattoni, M. L. Translating mouse vocalizations: prosody and frequency modulation. Genes Brain & Behav. 10, 4-16 (2011).
- Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. PloS ONE. 3, (2008).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds. PloS ONE. 7, (2012).
- Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3, 2177-2186 (2005).
- Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Amer. Assoc. Lab. Anim. Science: JAALAS. 46, 28-28 (2007).
- Wohr, M., Schwarting, R. K. Affective communication in rodents: ultrasonic vocalizations as a tool for research on emotion and motivation. Cell Tissue Res. , 81-97 (2013).
- Pasch, B., George, A. S., Campbell, P., Phelps, S. M. Androgen-dependent male vocal performance influences female preference in Neotropical singing mice. Animal Behav. 82, 177-183 (2011).
- Asaba, A., Hattori, T., Mogi, K., Kikusui, T. Sexual attractiveness of male chemicals and vocalizations in mice. Front. Neurosci. 8, (2014).
- Balaban, E. Bird song syntax: learned intraspecific variation is meaningful. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3657-3660 (1988).
- Byers, B. E., Kroodsma, D. E. Female mate choice and songbird song repertoires. Animal Behav. 77, 13-22 (2009).
- Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PloS ONE. 7, (2012).
- Pomerantz, S. M., Nunez, A. A., Bean, N. J. Female behavior is affected by male ultrasonic vocalizations in house mice. Physiol. & Behav. 31, 91-96 (1983).
- White, N. R., Prasad, M., Barfield, R. J., Nyby, J. G. 40- and 70-kHz Vocalizations of Mice (Mus musculus) during Copulation. Physiol. & Behav. 63, 467-473 (1998).
- Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic 'songs' with approach behaviour. Biology Letters. 5, 589-592 (2009).
- Ey, E., et al. The Autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations. Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).
- Chabout, J., Sarkar, A., Dunson, D. B., Jarvis, E. D. Male mice song syntax depends on social contexts and influences female preferences. Front. Behav. Neurosci. 9. 76, (2015).
- Hoffmann, F., Musolf, K., Penn, D. J. Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice. Physiol. & Behav. 96, 602-605 (2009).
- Roullet, F. I., Wohr, M., Crawley, J. N. Female urine-induced male mice ultrasonic vocalizations, but not scent-marking, is modulated by social experience. Behav. Brain Res. 216, 19-28 (2011).
- Barthelemy, M., Gourbal, B. E., Gabrion, C., Petit, G. Influence of the female sexual cycle on BALB/c mouse calling behaviour during mating. Die Naturwissenschaften. 91, 135-138 (2004).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS ONE. 7, (2012).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
- Whitney, G., Coble, J. R., Stockton, M. D., Tilson, E. F. ULTRASONIC EMISSIONS: DO THEY FACILITATE COURTSHIP OF MICE. J. Comp. Physiolog. Psych. 84, 445-452 (1973).
- Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in mice. PloS ONE. 9, 87186 (2014).
- Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. E. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. eLife. 4, (2015).
- Burkett, Z. D., Day, N. F., Penagarikano, O., Geschwind, D. H., White, S. A. VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models. Scientific Reports. 5, 10237 (2015).
- Grimsley, J. M., Gadziola, M. A., Wenstrup, J. J. Automated classification of mouse pup isolation syllables: from cluster analysis to an Excel-based "mouse pup syllable classification calculator". Front. Behav. Neurosci. 6, (2012).
- Grimsley, J. M. S., Monaghan, J. J. M., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PloS ONE. 6, (2011).
- Portfors, C. V., Perkel, D. J. The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication. Curr. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).
- Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PloS ONE. 9, 97244 (2014).
- Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PloS ONE. 9, 85405 (2014).
- Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136, 3401 (2014).
- Asaba, A., Kato, M., Koshida, N., Kikusui, T. Determining Ultrasonic Vocalization Preferences in Mice using a Two-choice Playback. J Vis Exp. , (2015).
