Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein schnelles und flexibles Protokoll für ein retrovirales In-vivo-Expressionssystem auf Basis eines einzelnen T-Zell-Rezeptors (TCR). Retrovirale Vektoren werden verwendet, um Vorläuferzellen des Knochenmarks zu transduzieren, um die Entwicklung und Funktion eines einzelnen TCR in vivo als Alternative zu TCR-transgenen Mäusen zu untersuchen.

Zusammenfassung

T-Zell-Rezeptor (TCR)-Signalübertragung ist essentiell für die Entwicklung und Differenzierung von T-Zellen im Thymus bzw. in der Peripherie. Die große Auswahl an TCRs macht es schwierig, eine spezifische antigene Reaktion zu untersuchen. Daher wurden TCR-transgene Mäuse dazu gebracht, die positive und negative Selektion im Thymus sowie die Aktivierung, Proliferation und Toleranz der peripheren T-Zellen zu untersuchen. Es wurden jedoch relativ wenige TCR-transgene Mäuse erzeugt, die spezifisch für ein bestimmtes Antigen sind. Daher fehlten Studien mit TCRs unterschiedlicher Affinitäten für dasselbe antigene Peptid. Die Generierung einer neuen transgenen TCR-Linie kann sechs oder mehr Monate dauern. Darüber hinaus können bestimmte Rückkreuzungen weitere sechs Monate dauern. Um eine schnellere Generierung und ein schnelleres Screening mehrerer TCRs zu ermöglichen, wurde ein Protokoll für die retrovirale Transduktion des Knochenmarks mit stöchiometrischer Expression der TCRα- und TCRβ-Ketten und der Erzeugung retrogener Mäuse etabliert. Jede retrogene Maus ist im Wesentlichen ein Gründer, wodurch ein Gründereffekt praktisch negiert wird, während die Zeitspanne für die Erzeugung eines retrogenen TCR-Maus von sechs Monaten auf etwa sechs Wochen verkürzt wird. Hier stellen wir eine schnelle und flexible Alternative zu TCR-transgenen Mäusen vor, die auf jedem gewählten Hintergrund mit einem bestimmten TCR exprimiert werden kann.

Einleitung

T - Zell - Rezeptor (TCR) Repertoire von Mensch und Maus wurde mit 1 x 10 ⁸ und 2 x 10 ⁶ einzigartige TCRs jeweils ^1,2 geschätzt. Diese große Vielfalt ermöglicht T-Zellen eine Vielzahl von Antigen-Epitope aus selbst Peptiden sowie von Pathogenen dargestellt durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) auf Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) abgeleitet zu erkennen. Die feinen Unterschiede in den Wechselwirkungen der TCRs mit einzigartigen Peptid-MHC-Komplexe diktieren, ob eine T-Zell-Apoptose durchlaufen wird, Anergie, Aktivierung, Differenzierung, Zytokinproduktion oder Zytotoxizität. Jedoch aufgrund der großen TCR-Repertoire, A....

Protokoll

Ethik - Statement: Es wird alles unternommen Tier Beschwerden oder Stress auf ein Minimum während der Bestrahlung und Schwanzvene Injektionen zu halten. Mäuse werden als Quelle der Zellen in diesen Experimenten verwendet wird; als solche sind keine Verfahren oder Manipulationen abgesehen von Euthanasie. Die Mäuse werden durch CO ₂ Inhalation durch Genickbruch folgte eingeschläfert Tod zu bestätigen. Dieses Verfahren ist mit den Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie von der American Veterinary Medical Association konsistent.

1. Bereiten Sie Retrovirale Construct

1. Sub-Klon der T-Zell - Rezeptor (TCR) alp....

Ergebnisse

Knochenmark Transduktionseffizienz bei Schritt 13.3 des Protokolls überprüft , bevor das Knochenmark in Schwanzvene iv In der repräsentativen bone marrow Transduktion Figur (1A) eingespritzt wird, ungefähr 10 & mgr; l der geernteten Knochenmark wurden zu 100-ul PBS und für ametrine Expression analysiert. Im allgemeinen der Prozentsatz der fluoreszierenden positiven Zellen liegt zwischen 25% und 70%, abhängig von dem Konstrukt und retrovirale Titer. Nach 6 Wochen Knoc.......

Diskussion

In dem Protokoll wir ausführlich einige kritische Schritte optimale Knochenmark Gesundheit, Transduktionseffizienz und Rekonstitution zu gewährleisten. Erster wichtiger Schritt ist die Erzeugung und die ordnungsgemäße Wartung der GP + E86 Virusproduzentenzellen. Verwenden frühen Passage Produktionszelllinien und halten bei 80% Konfluenz oder niedriger vor der Verwendung. Wenn frisch machen viralen Produzentenzellen GP + E86, sicherzustellen, sind die 293T-Zellen frühen Passage und wachsen in der Kultur für 24 bis 48 Stu.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM, hoher Glukosegehalt +	Glutamin Corning Cellgro	10-013-CV	Dulbecco's Modifikation von Eagle's Medium mit 4,5 g/L Glukose, L-Glutamin & Natriumpyruvat
FBS	Atlanta Biological	S11550
Trypsin-Versen	Lonza	17-161F
0,45 µ m Spritzenvorsatzfilter	Thermo Scientific	194-2545
Polybrene	Sigma	H9268-10G	Sterilfiltriert in dH2O
Ciprofloxacin	VWR	AAJ61970-06
5-Fluorouracil (5-FU)	VWR	AAA13456-06
Natriumpyruvat	Corning Cellgro	25-000-CI
MEM nichtessentielle Aminosäuren	Corning Cellgro	25-025-CI
HEPES 1 M Lösung	Corning Cellgro	25-060-CI
2-Mercaptoethanol	Gibco von Life Technologies	21985-023
Pen/Strept	Corning Cellgro	30-002-CI
L-Glutamin	Corning Cellgro	25-005-CI
150 mm Gewebekulturschalen	Greiner Bio-one	639160
Tisue kulturbehandelte 6-Well-Flachplatte	Greiner Bio-one	657160
70 µ m Nylon-Zellsiebe	Falcon	352350
Maus IL-3	Invitrogen	PMC0033
Humanes IL-6	Invitrogen
Maus Stammzellfaktor	Invitrogen	PMC2113L
10x PBS	Corning Cellgro	46-D13-CM
HANKS Buffer	Corning Cellgro	21020147
BD 10 ml Spritze	BD	300912
BD 1 ml Spritze	BD	309659
27 G x 1/2 BD Präzisions-Gleitnadel	BD
30 G x 1/2 BD Präzisions-Gleitnadel	BD	305106

PHC0063305109