Introduction
골수는 조혈 및 면역 조절에 관여하는 중요한 기관이다. 이는 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)를 함유하는 성분으로 구성 조혈 및 중간 엽 세포 하나를 야기 비 조혈 전구 세포를 포함하는 기질 성분. 조혈 활동 3 분의 2는 골수 세포 2의 생성에 전념하고 있습니다. 1-2 × 10 11 세포는 정상적인 인간 성인이 하루 당 생성에 특히 호중구의 다수는 골수에서 생성된다. 호중구는 미생물 감염에 대한 방어의 첫 번째 줄에있는 스트레스가 주변 호중구 1,3-을 보완하기 위해 자신의 동원을 트리거 할 때까지 주로 골수에서 예약되어 있습니다. 그 항균 효과에 더하여, 최근의 연구에 따라 바뀌는 성장 프로 및 항 종양 표현형 모두 갖는 암 생물학에서 호중구의 주요 역할을 시사종양 미세 환경의 4,5에 신호 인자 베타 (TGF-β). 또한, 연구는 순환 호중구 세포 독성, 항 전이 효과를 발휘하면서 8 차 종양에 축적 호중구, T 세포의 세포 독성 -6,7- 기능을 억제함으로써 프로 종양 및 전이성 영향을 미치는 것을 설명했다. 이와 같이, 골수의 조혈 세포, 특히 호중구의 조사가 종양 면역 조절의 역할을 밝히기에 중요하다.
조직 병리학 및 전체 말초 혈액 카운트는 정기적으로 골수 구 셀룰러 및 구조적 변화를 평가하기 위해 사용된다. 그러나, 이들 방법은 단지 다른 세포 집단 또는 조직의 미세 구조의 정적 인 정보를 제공한다. 생체 내 이미징 종 세포에서 C뿐만 아니라 여러 세포, 혈관 및 간질 성분의 동역학을 평가하기 위해 표준 방법을 병용 할 수있다길이 방식으로 엘 상호 작용. 미세한 분해능 10 살아있는 동물의 생체 내에 촬상 정의 현미경 (IVM)는, 동일한 샘플 시간에 걸쳐 동적 세포 과정을 평가할 필요 실험 동물의 수를 감소하는데 특히 유용하다. IVM은 종종 주 개월의 기간에 걸쳐 이미징 관심의 기관에 액세스 할 수있는 만성적 이식 윈도우 실 (WC)와 결합된다. 두개골과 지느러미 - 피부 집계 WC 모델은 다시 1990 년대 중반까지 거슬러 올라가는 사용의 긴 역사를 가지고 있습니다. 최근 이러한 유방 지방 패드 및 다양한 복부 장기의 것과 다른 기관 특이 WC 모델 (11)이 개발되었다.
생체 내에서 골수 이미징의 일반적인 접근 방식은 얇은 뼈가 최소한의 수술 적 치료 12-14 단일 세포의 직접 시각화를 가능하게 마우스의 덮개 뼈, 주로 참여 노출을 보유하고 있습니다. 그러나, 두개골 골수 ㄱ 수도E HSPCs (15)의 유지 보수 및 개발 감소 나타낸다의 두개골에 HSPCs 저산소 세포의 낮은 숫자에 의해 입증 된 바와 같이, 이러한 긴 뼈 다른 뼈의 구별. 따라서, 긴 뼈의 세포 구성 요소를 평가하기위한 다른 방법을 조사하고 있습니다. 다음은 대퇴 골수 (16)의 직접적인 노출과 등쪽 피부 집계 WC (17)의 분할 대퇴골의 이소성 이식을 포함한다. 그러나, 전자는 더 긴 기간에 걸쳐, 셀룰러 구조적 및 기능적 변화를 추적하는 것을 허용하지 않는 터미널 절차이고, 후자의 가능성 때문에 등쪽 피하 지방 WC 내부 자궁외 사이트 대퇴골 이식 정상적인 골수 기능을 방해한다. 시간이 지남에 따라 대퇴골 골의 소성을 연속 촬영을 가능하게하는 또 다른 방법은 대퇴골의 WC의 사용이다. 하나의 이전 보고서는를 사용하여 대퇴 골수 미세 장기 영상을 보여쥐 18 WC를 대퇴골. 또한 저자는 모니터링 골수 전이에서의 유틸리티를 나타내는 대퇴골에서 종양 세포의 가시화를 보여 주었다. 그러나,이 WC 설계가 큰 마우스 (26-34g 나이 3-6 개월)에만 적합했다 대형 사이즈 (1.2 cm 직경)과 상대적으로 작은 이미징 영역 (4mm 직경)에 의해 제한되었다함으로써 제조 일상적인 사용을위한 실용적 접근.
따라서, 작은 전체 크기 새로운 WC 큰 내부 이미징 영역이 연구의 목적으로 설계되었다. 본 연구의 목표는 대퇴골 골 다양한 세포 유형을 묘화 방법을 제공하는 것이다. 대퇴골의 WC 모델은 자체 개발하고, 3D 혈관 네트워크 내에서 호중구를 시각화하고 추적하는 데 사용되었다. 이 모델을 이용하여, 골수 IVM 40 일간 연속적으로 수행 할 수있다. 이 방법은 면역 조절 A를 조혈 과정의 해명을위한 다양한 분야에 적용될 수있다차 종양 개발.
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Protocol
참고 : 모든 동물의 작업은 대학 건강 네트워크 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜 # 2615에 따라 실시 하였다.
마우스 1. 수술 준비
- 이전 수술로, 모든 수술기구 및 고압 증기 멸균하여 윈도우 챔버 (WC)를 소독. 2 일전 수술 아목시실린의 50 mg / kg 체중으로 식수를 보충합니다. 복강 4 시간 전에 수술 부 프레 노르 핀의 0.1 ㎎ / ㎏ 체중와 마우스를 주입한다.
- 80 ㎎ / ㎏ 케타민 13 ㎎ / ㎏ 자일 라진 (주를 포함 350-400 μL 식염수 용액을 복강 내 주사에 의한 무 흉선 누드 마우스를 마취 :이 기관 동물 관리위원회의 승인을하고, 우리는 부작용 어떤 경험이 없었어요 ). 발 반사를 테스트하여 적절한 마취를 확인합니다. 절차를 수행하는 동안 호흡 패턴, 점막 색상과 발 반사에 대한 관찰을 계속합니다.
- 수술 홍보를 수행바이오 안전성 캐비닛에서 ocedures 수술시 무균 상태를 유지합니다. 수술 동안 체온을 유지하는 수술 용 드레이프 피복 전기 난로에 마우스를 놓는다. 실체 현미경 아래에있는 모든 수술 절차를 수행합니다.
- 수술하는 동안 촉촉한 눈을 유지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 수술하는 동안 필요한 경우 반복합니다. 연속적으로 7.5 % 포비돈 - 요오드, 70 % 이소 프로필 알코올 10 % 포비돈 - 요오드 닦아 마우스의 조작 영역을 소독 회이 과정을 반복한다.
- 측면에서 대퇴골에 접근, 블레이드 (# 15)와 메스를 사용하여 10mm 길이의 피부 절개를합니다. 근육의 기능을 보장하기 위해 집게와 지혈제를 사용 무딘 절개하여 굴근과 신근 근육 사이의 대퇴골을 노출.
- 뼈 아래에있는 U 자형 막대를 삽입하고, WC (그림 1)를 설치합니다. 2 개의 너트를 사용하여 창 막대를 고정하고, 용와 너트를 조이CEPS. 뼈 및 치과 시멘트와 화장실 사이의 공간을 채 웁니다.
- 골수 공동 광학 액세스하는 마이크로 드릴 6 × 2 ㎜ × 2 영역의 피질골을 분쇄.
참고 :이 절차를 수행하는 동안 조심스럽게 현미경으로 피질골의 숱을 검사합니다. 뼈의 손상, 거의 투명 골막 층을 둡니다. - 창에 8 밀리 커브 글라스를 놓고 장소에 보관하는 스냅 링과 커브 글라스를 고정합니다.
- 수술 다음 그 기능을 유지하기 위해 집게를 사용하여 다시 원래 위치로 굴근과 신근의 근육을 조정합니다. 5-0 봉합사와 바늘 홀더를 사용하여 진피 봉합사.
- 이 의식 자유롭게 움직일 수있을 때까지, 복구를 위해 마우스를 모니터합니다. 복구 할 때 새 케이지에 동물을 넣습니다.
- 복구 후, 같은 날 또는 다음 날 동물의 이미지 수집을 수행 (섹션 2 참조). 풍모를 모니터링매일 마우스의 칼 상태.
참고 : 무게가 빠르거나 얕은 호흡, 뒷다리의 부종, 자기 절단, 봉와직염, 심한 피부염을 hunching, 사지에 베어링과 같은 물리적 조건을 모니터링합니다. - 3 일간의 부 프레 노르 핀 / kg 체중 0.1 mg을 복강 내 주사를주고, 수술 - 후 통증 및 염증 치료를위한 수술 후 5 일간 멜 록시 캄의 1 ㎎ / ㎏ 체중. 5 일간 아목시실린 - 보충 물을 제공하는 계속합니다.
- 실험 엔드 포인트, CO에 의해 보조 방법 (예를 들어, 경추 탈구)이어서이 마취를 동물을 안락사.
복합 다중 광자 및 공 초점 현미경을 사용하여 2. 이미지 획득
- 종래 이미징 80 밀리그램 / kg 케타민, 13 밀리그램 / kg 자일 라진 함유 350-400 μL의 생리 식염수를 복강 내 주사하여 마우스를 마취. 가능한 경우 또는 흡입 마취제를 사용합니다.눈 연고를 적용합니다.
- 라벨 혈관에 대한 혈관 내 염료의 혼합물 (0.65 2 MDA 형광 (FITC) -dextran의 mg) 및 호중구 (Allophycocyanine (APC의 4 μg의) - 반대로 Ly6G 항체)를 주입한다.
- 청색으로부터 적색에 여기 파장을 제공하는 705-980 nm 내지 이광자 여기 레인 징 다중 광자 레이저뿐만 아니라, 단일 광자 레이저를 구비 한 직립 결합 다중 광자와 공 촛점 현미경을 사용한다.
- 현미경 (그림 1B)에 사용자 정의 만든 영상 단계를 설정합니다. 악어 클립으로 WC의 두 끝을 체결하여 무대에 마우스를 고정합니다.
WC를 유지하기 위해 두 악어 클립 및 가열 요소는 이미징 동안 마우스의 생리적 온도 (37 ° C)를 유지하기 위해 다음 단계의 중요한 구성 요소는 다음과 같습니다 있습니다. - 두 광자 레이저 공 초점 시스템의 전원을 켜고 "시작 시스템"을 클릭하여 이미지 수집 소프트웨어를 실행합니다. 4 탭 창이 (찾아획득, 처리 및 유지) 열립니다.
- 이미징 채널을 설정합니다. 획득 탭에서 "스마트 설치"를 클릭하고 영상에 사용되는 염료를 선택 FITC (488 nm의 여기, 493-588 nm의 방출)와 APC (633 nm의 여기 및 638-743 nm의 방출을). "최고의 신호"를 선택하고 "적용"을 클릭합니다.
- 수동 제 2 고조파 발생 (SHG) 화상 취득 채널을 추가한다. 획득 탭에서 "레이저"창 아래에있는 두 광자 레이저를 켭니다. [채널] 창에서 트랙을 추가하려면 "+"기호를 클릭합니다.
- SHG 트랙을 설정합니다. 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 채널 창 아래 840 nm의 파장을 변경하고 슬라이더 막대를 사용하여 "빛의 경로"창에서 415-425 나노 미터로 검출 범위를 선택합니다.
- 찾기] 탭에서 "접안 온라인"을 클릭합니다. FITC 관심의 영역을 확인하고 t을 돌려 초점을 수동으로 조정에 대한 필터 설정에서 FITC를 클릭합니다그 현미경 측에 손잡이를 집중한다. 관심 영역이있는 경우, 찾기 탭에서 "접안 오프라인"을 클릭합니다.
- 획득 탭을 클릭합니다. 채널 창에서 FITC 트랙을 선택하고, 5 배 목표와 FITC-덱스 트란의 이미지를 미리 "라이브"를 클릭합니다. 필요에 초점을 조정하고 미리보기를 중지 취득 탭에서 "중지"를 클릭합니다.
- 수동 렌즈 위의 휠을 이동하여 20 배의 물 목표로 설정합니다. 20 배 목표를 사용하여 FITC-덱스 트란에 대한 이미지를 다시보기 및 최적의 신호와 대비를 달성하기 위해 채널 창에서 마스터 게인 및 핀홀을 조정합니다. [채널] 창에서 APC 및 SHG 트랙을 선택하여 다른 채널에 대해 반복합니다.
- 이미징 매개 변수를 선택합니다. 그 창을 엽니 다 "수집 모드"를 클릭합니다. 고품질의 이미지를 얻기 위해, 프레임 크기는 1024 X 1024 픽셀로 설정하고, 4 배의 평균.
- 2 차원 스냅 샷을 취득. 채널 승리에서 모든 채널을 선택다우와 획득 탭에서 "스냅"을 클릭합니다. 이미지의 품질을 확인하고 필요한 경우 영상 매개 변수를 변경합니다.
- 2D 시간 경과 이미지를 획득.
- 시계열 창을 엽니 획득 탭에 "시간 시리즈"를 해제하십시오. 시간 간격없이 연속 40 이미지를 취할 검사의 총 수의 간격에 따라 0, 40을 입력합니다.
참고 : 40 스캔은 7.5 초 / 프레임의 스캔 속도 및 600 μm의 × 600 μm의 이미지 크기는 약 5 분 장시간 시리즈를 생성한다. 간격과 현미경 화상 취득 설정 및 카메라의 프레임 레이트에 따라 스캔의 수를 조정한다. 일정 간격의 시간 (> 0 초)은 상이한 시점에서 취득한 타임 랩스 영상과 비교하기 위해 사용될 수있다. 더 긴 시간 경과 영상 시간은 실험 조건에서 호중구 (또는 관심의 다른 세포)의 예상 평균 속도에 따라 요구 될 수있다.
- 시계열 창을 엽니 획득 탭에 "시간 시리즈"를 해제하십시오. 시간 간격없이 연속 40 이미지를 취할 검사의 총 수의 간격에 따라 0, 40을 입력합니다.
- 3D 이미지를 획득.
- Z 축 스택 창을 엽니 획득 탭에 "Z-스택"을 해제하십시오. FITC-덱스 트란의 "라이브"미리보기 모드를 시작합니다. 샘플의 상단에 초점 "우선 설정"을 클릭하고 샘플의 다른 쪽 끝을에 초점을 클릭 Z 스택 창에서 "최근 설정".
- Z 축 스택 창에서 10 μm의 것으로 간격을 설정합니다. 이전 단계에서 선택된 제 1 및 최종 광학 슬라이스에 따라이 90-180 ㎛, 전체 광학 두께, 10-20 슬라이스를 생성한다.
주 : Z 스택 간격 광학 슬라이스 두께를 결정 핀홀의 크기에 의존한다. 광학 슬라이스의 두께 이상이어야 간격을 설정합니다. - 이미지를 수집하기 시작 획득 탭에서 "시작 실험"을 클릭합니다.
- 3D 시간 경과 이미지를 획득.
- 시계열을 열 획득 탭에 "시간 시리즈"와 "Z-스택을"오프 확인그리고 Z-스택 창.
- 단계 2.14과 2.15에 설명 된대로 시간 시리즈 설정하고 Z 스택 획득 매개 변수를 설정합니다. 이미지를 수집하기 시작 획득 탭에서 "시작 실험"을 클릭합니다.
- 이 안정적이고 의식이 있는지 확인하기 위해 촬영하는 동안 마우스를 모니터합니다. 마우스가 촬영 중에 불안정 및 / 또는 의식이있는 경우, 무대에서 마우스를 제거 복강 마취 솔루션의 추가로 100 ~ 150 μl를 주입하고, 영상을 계속합니다.
참고 : 불안의 징후가 빠른 호흡과 획득 된 영상에서 아티팩트를 변화로 볼 수있다 마우스의 움직임을 포함한다. - 이미지 수집 한 후, 단계 떨어져 마우스를 가지고 케이지로 돌아갑니다. 따뜻하게 유지하고, 의식 때까지 마우스를 모니터링하는 가열 램프를 사용한다.
3. 이미지 분석 및 정량화
- 3 차원 및 시계열 데이터를 분석하는 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다. 소프트웨어를 열고"아레나"보기라고 열려있는 화면으로 드래그하여 이미지를 추가 할 수 있습니다. 를 열 수있는 이미지 파일을 더블 클릭; 이미지가 "능가"보기에서 열립니다.
- 2 차원 / 3 차원 이미지를 만듭니다.
- 오른쪽 상단에있는 "추가"줄에서 "디스플레이 조정"창을 엽니 다 "편집 /보기 표시 조정"을 클릭합니다. 각 채널에 대한 임계 값을 조정함으로써, 형광 표시를 최적화하며, 이미지를 저장하는 스냅 샷.
- 시간 경과 이미지를 사용하여 개체 트랙을 생성합니다.
- 이미지를 엽니 다하는 "능가"보기에 따라 분석한다. 은 "능가"아이콘 아래에있는 오렌지 도트의 이미지와 아이콘을 클릭합니다. 이 새로운 "관광 명소"창이 열립니다.
- "(시간 이상) 트랙 스포트를"오프 확인하고 다음 단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다. "소스 채널"에서 추적 할 개체를 포함하는 채널을 선택하고, 추정 된 개체 diamet 설정에 숫자를 입력하여 "예상 XY 직경"에서 어입니다. 다음 단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다.
참고 : 호중구 추적의 경우, 호중구에 대한 APC 형광을 포함하는 채널을 선택하고 호중구의 알려진 크기에 따라 12 μm의 객체 직경을 설정합니다. - 창에서 찾아 아래쪽 화살표를 클릭하여 "품질"필터를 선택합니다. 소프트웨어에 의해 정의 된 지점을 관찰하고 포함하거나 지점을 제외 수동으로 임계 값을 조정합니다. 임계 값이 정의되면, "추적"단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다.
- 알고리즘에서 찾아 아래쪽 화살표를 클릭하여 "회귀 모션 알고리즘"을 선택합니다. "최대 간격 크기"에 대한 "최대의 거리"에 대한 10 μm의 3 유형 매개 변수 아래에 있습니다. 추적을 시작하려면 "모든 탐지 된 개체와 격차를 채우기"오프 확인하고 다음 단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다.
주 : "회귀 모션 알고리즘"F를 사용또는 이전 운동에서 예측 된 위치에 따라 트랙을 생성하기 때문에, 운동을 지시 한 개체입니다. "최대 거리"와 "최대 간격 크기"추적뿐만 아니라, 시간 경과 이미지의 전체 지속되는 예상 치수 오브젝트의 속도에 따라 조정될 수있다. - 필터 유형에서 '추적 기간 "필터를 선택합니다. 추적을 완료하고, 생성 된 트랙을 확인하기 위해 녹색 화살표를 클릭합니다. 수동으로 트랙을 정렬 할 필요하면 이전 단계로 돌아갑니다.
- 번역 드리프트에 대한 올바른 생성 된 시간 경과 이미지 드리프트, 경우.
- 연필의 이미지로 아이콘을 클릭합니다. 이것은 "편집 트랙"창을 엽니 다 편집 탭입니다. 시간 경과 이미지를 검사하고 모든 이미지를 이동하지 않아야 참조 지점을 찾을 수 있습니다.
- 화면의 왼쪽 상단 모서리에서 "포인터"창을 찾아 오프 확인 용돈을 활성화하기 위해 "선택"자리를 선택하는 rsor. 기준 지점을 클릭합니다.
- "편집 트랙"창에서 "올바른 드리프트"를 클릭합니다. "번역 상 드리프트"를 해제하십시오. 이 소프트웨어는 자동으로 이미지를 보정 시리즈를 생성합니다.
- 시간 경과 영상에서 객체 추적에 의해 정의 된 세포의 움직임을 측정한다.
- "편집 트랙"창에서 "트랙"오프 확인하고 세포의 움직임을 나타내는 트랙을 선택합니다. 선택한 트랙은 시계열 이미지에서 노란색으로 강조 표시됩니다.
- 은 "통계"창 (통계 탭) 열 그래프의 이미지로 아이콘을 클릭합니다.
- "선택"에서 트랙 속도가 선택한 트랙에 대한 의미 생성 아래쪽 화살표를 클릭하여 "트랙 속도 평균"을 선택합니다. 다른 트랙을 선택하고 트랙 속도가 관심의 모든 세포에 대한 의미 측정하는 단계를 반복합니다.
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Representative Results
쥐 대퇴골 골 성공적 개별 호중구 및 혈관 네트워크의 시각화를 활성화 WC를 사용하여 액세스된다. 하나의 WC 구를 도시하고 내부 광 액세스하는 대퇴골과 피질골의 박형화의 노광을 수반 수술을 설명 도표 뼈. 수술은 생쥐에서 잘 허용된다 그들은 고통없이 보고서와 같은 오일 수술 후의 화장실에 뒷다리의 부종, 비 체중이 다리에 베어링, 자기 절단, 봉와직염 및 피부염뿐만 아니라, 손상 등의 부작용 물리적 반응에 대해 평가 하였다. 특히, 윈도우는 다음의 개입 셀룰러 및 구조 변경의 장기 평가를 가능하게 할 수있는 40 일 대한 IVM을위한 광학적으로 투명한 남아있다.
골수 내 혈관이 같은 FITC-덱스 트란과 같은 혈관 염료, 시각화 할 수 있습니다(그림 2). 콘트라스트 염료의 주입에 의존하기 때문에, 취득 된 화상은 충분한 혈류가 혈관 기능을 나타낸다. 혈관 외에 호중구 안티 Ly6G 항체를 사용하여 생체 내에서 염색 할 수있다.도 3a 및도 3b는 호중구가 혈관 및 혈관 외 공간에 모두 보이는 상이한 시점에서 관찰되는 골수의 동일한 영역을 나타낸다. 이러한 영역은 혈관 최적 특징 하였다. 로다 민 6G는 생체 내에서 호중구를 염색하는 안티 Ly6G의 대안으로 사용될 수있다; 그러나, 비 - 특정 방식으로 혈관 외 공간 내의 혈관 얼룩 단핵 세포 밖으로 확산한다. 따라서, 안티 Ly6G는 호중구의 특정 영상을 가능하게하기 때문이다.도 3c는 주로 콜라겐 섬유로 구성되어 피질골의 이미지를 나타내는 것이 바람직하다. 달성 이미징의 최대 깊이이 실험에서 180 μm의 (그림 3C)입니다.
시간 경과 형광 이미징은 생체 내에서 추적 및 세포 이동의 정량을 용이하게한다. 그림 4a는 골수 혈관 틈새 시장에서 호중구의 추적을 보여줍니다. 각 스캔 사이에 추가 시간 간격 이미징은 세포의 정확한 추적을 가능하게; 그러나, 일부 사용자 입력, 상기 소프트웨어에 의해 생성 된 추적의 정확성을 향상시키기 위해 필요하다. 관광 명소의 추적 (즉, 관심의 세포) 등의 평균 궤도 속도 (그림 4B)와 같은 다양한 매개 변수의 정량화 할 수 있습니다. 등을 측정 할 수 있지만, 이에 한정되지 않는 다른 파라미터는, 스폿 크기, 형상 및 강도 길이 변화를 추적. 이 분석은 세포의 움직임과 상호 작용의 특성을 개선하는 다양한 매개 변수의 정량화를 제공합니다.
그림 1 : 대퇴골 창 실 (화장실), 이미징 단계와 수술 장소에서 대퇴골를 해결하는 역할을하는 U 자형 막대 (A) 주문 제작 티타늄 대퇴골 WC.. WC는 스냅링으로 고정 직경 8 mm의 커버 유리를 보유하고있다. (B) 주문 제작 이미징 단계. 가열 소자는 촬상 동안 마우스의 생체 온도를 유지하는 상기 스테이지의 저면에 배치된다. 두 악어 클립은 WC를 개최하는 데 사용됩니다. (C - H) 대퇴골의 화장실을 설치하는 수술. (C)는 대퇴골 굴근과 신근 근육 사이에 노출된다. 근육이 절차를 수행하는 동안 제거되지 않습니다. (D)가 U 자형 바 대퇴골 아래에 배치되고, (E)이 WC를 설치하고 2 개의 너트를 사용하여 고정된다. (F) 치과 용 시멘트는 뼈와 사이에인가화장실은 공간을 채우기 위해. (G) 진피는 봉합과 (H) 커버 유리가 고정 링과 장소에 고정되어있다.되는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 생체 내 골수에서 혈관 네트워크의 3D 형광 이미징 골수에서 혈관의 대표 이미지, 대퇴골의 WC를 통해 몇 군데.. 혈관 (녹색) 2 MDA FITC-덱스 트란의 꼬리 정맥 주입에 의해 가시화된다. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 생체 내에서 골수의 혈관 네트워크 내에서 호중구의 움직임을 추적 혈관 네트워크 내에서 호중구의 (A) 트랙 경로.. 트랙은 소프트웨어의 회귀 기본 동작 알고리즘을 사용하여 자동으로 생성된다. 각각 백색 점은 입자의 중심점 (호중구) 추적되는 나타낸다. 스케일 바는 50 μm의 =. (B) 호중구의 이동의 차이를 나타내는, 혈관 및 혈관 외 호중구 측정 트랙 속도 평균 (평균 = 오류 바 + SD, * p = 0.0176, 두 개의 꼬리 t-테스트). 여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 이 그림.
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Discussion
실시간 골수에서 동적 세포 과정의 일련 촬상 그렇지 같은 조직학 총 혈구와 같은 종래 기술을 이용하여 수득 도전 정보를 제공한다. 여기에 설명 된 대퇴골 WC 모델은 시간에 따른 골수 세포 및 구조적 변화를 조사하는 독특한 기회를 제공한다. 대퇴골의 WC 모델은 이전에보고되었지만, 우리의 새로운 디자인 성인 마우스에 사용하기위한 더 호환도 작아 WC 전체 크기의 큰 이미지 필드를 제공한다. 대퇴골 WC 모델은 면역 및 / 또는 트랜스 제닉 리포터 생쥐 포함 마우스 균주의 다양한 이용 될 수있다.
전체 기간과 영상의 품질을 결정하는 수술 중 중요한 단계가 있습니다. 대퇴골을 노출 할 때, 굴근과 신근 사이의 근육의 무딘 절개가 수행된다; 이러한 근육의 제거는 마우스와 뮤스의 감소 이동성 될 수 있습니다t는 회피 될 수있다. 또한, 피질골의 분쇄하는 것은 신중하게 수행해야합니다. 대퇴부 혈관 네트워크의 구조적 무결성을 유지하면서, 약 50 ㎛의 연삭 결상 적합하다. 뼈 시멘트 주변 치아의 적용은 수술로 노출 된 부분을 밀봉 유체의 축적을 방지하고, 감염의 위험을 감소시키면서 개월 이상에 대한 명확한 결상 창을 유지하기위한 중요하다. 치과 용 시멘트는 대퇴골 주위를 회전하는 WC 방지 곳에 WC를 해결하는 역할을한다. 마지막으로, 커브 글라스를 보유하는 데 사용되는 스냅링 물 시일을 제공 물 액침 렌즈와 함께 사용하기에 적합하다. 스냅 링은 접착제를 첨가함으로써 대해 달성 침투 깊이를 감소 결상면에 약간의 각도의 커브 글라스를 뼈와 커버 글라스 사이의 틈을 증가 시키거나 배치 할 수 있기 때문에 WC로 커브 글라스를 부착 접착제 위에 권장 영상. 더욱이커브 글라스 청소 또는 변경 될 필요가있을 때, 스냅 링이 유용하다.
수술 외에, 골수 성공적 광학 영상을 달성하기 위해 여러 가지 중요한 단계가있다. 대퇴골 WC 내부 이미지의 WC는 대물 렌즈의 적절한 침지 촬상 스테이지 가로 놓인다. 이 렌즈에 대한 상기 WC의 각도 조정을 가능으로하는 맞춤형 촬상 단계는이 목적에 적합하다. 또한, WC는 U 자형 바 특히 크기의 설계는 최적의 침투 깊이를 달성하기 위해 가능한 커브 글라스에 가까운 수평 위치에서 뼈를 유지한다. 촬영하는 동안 호흡 유물은 형광 이미지의 가로 선으로 관찰 할 수있다. 상기 촬상 단계에 WC 확보 외에, 촬상 스테이지 아래 발열체의 온도가 충분히 과도한 호흡을 최소화하기 위해 동물을 가온 조정될 수있다. 거즈의 얇은 층마우스와 더 이미징 동안 호흡 아티팩트를 줄일 수있는 가열 단계 사이에 배치 될 수있다. 생체 촬상 대상에 따라 이러한 프레임 레이트 촬상 공간과 촬상 기간 같은 획득 파라미터는 실험적 질문을 해결하기 위해 충분한 이미지를 수집하도록 조절 될 수있다. 예를 들어, 호중구 마이그레이션 및 크롤링의 속도는 아무 곳이나 염증 상태 19-21에서 호중구 5 ~ 10 μm의 / 분 범위에 기초 조건에서 상주 호중구 2.8 μm의 / 분에서 다양한 실험 조건에 따라 다를 수 있습니다. 따라서, 생체 내에서 호중구 추적 적절한 이미징 속도와 지속 시간은 실험 조건에 따라 달라질 것이다. 또한, 같은 높은 프레임 레이트를 갖는 고속 촬상 카메라 (30 프레임 / 초)를 필요로 혈관 내 세포의 추적 결과로부터 알. 그러나, 표적 세포는 혈관 외 공간에 존재하거나하는 경우 세포 간 경우 interactio관심 N보다 천천히 화질 위에 우선되어야 묘화 속도가 발생할 것으로 예상된다.
세포 기능에 생체 세포 얼룩에 대한 주입 항체의 영향도 고려되어야한다. 우리의 연구에서, 우리는 일반적으로 순환에서 호중구을 고갈 및 각종 질병 모델에서의 역할을 연구하기 위해 높은 용량 (150 ~ 250 μg의)에 사용되는 항 Ly6G 항체 (1A8 클론)을 사용했다. Yipp 및 Kubes는, 형광 표지 항 Ly6G 항체가 낮은 혈관 내 주입 용량 (1-40 μg의) (22)에 백혈구 모집을 방해하지 않는다는 것을 보여 주었다. 그러나, 최근 연구는 형광 색소는 분자량 및 화학 구조에 큰 차이를 갖는 차동 항 Ly6G (23)의 기능에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 이 연구는 효율적으로 저농도 (30 μg의)에서 생체 내에서 호중구을 고갈 방지 Ly6G를 FITC 표지 만, PE-하지 항체를 APC 표지 것을 보여 주었다.우리의 연구에서는 APC 표지 항 Ly6G 4 μg의 사용 호중구 고갈 초과 근무 수당을 준수하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 생체 내에서, 형광 표지 항 Ly6G 항체의 기능의 추가 특성화 생체 내에 이미징의 사용의 유효성을 검증 할 필요가있다. 이것은 또한 세포의 상호 작용을 변경할 수있는 기능 능력이 다른 항체에 적용됩니다. 항체의 생체 내 세포 염색하는 대신, 트랜스 제닉 리포터 생쥐 (24) 및 / 또는 형광 표지 된 세포로서 호중구 (25) 또는 생체 내에서 관심있는 다른 세포 집단을 시각화 할 수있다.
이 프로토콜에 설명 된 대퇴골의 WC 모델은 수술 후 최대 40 일 동안 촬영을 할 수 있습니다. WC이 모델을 이용하여 장기 이미징 과제 중 일부는 지연 뼈 치유 과정 깨끗한 유리 창의 유지를 포함한다. 특히, 우리는 포함하여 것은 WC 주입 다음과 같은 명백한 뼈 치유의 징후를 관찰하지 않았다골막의 전자 비후; 이것은 뼈의 치유 과정은 일반적으로 1-½ 3개월 26,27 후에 발생 주어진 예기치 아니다. 깨끗하고 광학적으로 투명한 창 보수 치과 시멘트 적용하고 조직과 단단한 물 시일을 제공 스냅링 및 커버 글라스를 이용하여 달성 될 수있다. 커브 글라스 가끔 먼지와 부스러기를 제거하기 위해 외부면 팁 세정 할 수있다. WC 거의 이전에 발행 된 모델 (18)이 우수하게 골간 지역 (약 8.4-8.6 mm 28)의 전체 길이를 커버, 넓은 이미징 필드가 있습니다. 그러나, 원위 영역에 액세스하고 깊은 골 공동은 제한된다. 특히, 골간의 말단부에있는 해면골 풍부한 골간은, HPSCs 29 풍부한 것으로 알려져있다. 이 지역은 조직 학적으로 접근, 또는 터미널 절차와 IVM에 의해 할 수있다. 대안 적으로, 마이크로 빌려와 같은 다른 이미징 양식uted 단층 생체 (30)에 이미지에 대한 골수의 원위 영역을 사용할 수있다. 이러한 방법은 골수 내 해부학 및 다양한 세포 및 구조적 변형과의 상호 작용을 평가하기위한 통합 된 방법을 제공 IVM 상보이다.
여기에 설명 된 프로토콜은 셀룰러 해상도에서 쥐에서 대퇴 골수의 장기 시공 평가를위한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 제시된 방법은 동시에 골수의 구조 및 기능 정보를 획득하는 동안, 하나의 셀 또는 생물학적 관련 시간 단위를 통해 세포 집단의 이동을 추적하기 위해 생체 내에서 사용 직렬 촬상. 또한, 정량적 화상 분석은 또한 셀룰러 움직임 추적 셀룰러 및 기능적 변화를 특성화하기 위해 수행 될 수있다. 특히 유전자 변형 기자 마우스 (31) 마우스의 여러 변종,이 대퇴골의 WC 모델의 적용,상기와 같은 조혈 관련된 것과 같은 다중 개별적으로 표지 된 세포 집단의 조사를 가능하게 할 수있다. 따라서, 설명 된 프로토콜은 전임상 조혈 백혈병, HPSC 이식, 면역 조절, 골수 미세 환경 (예를 들면, 저산소 틈새)의 조사를 포함하여 살아있는 쥐의 골수 내의 다양한 생물학적 과정을 포함하는 연구와 다양한 널리 적용 할 수있다 암의 진행과 전이에 대한 면역 세포의 기여.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
저자는 현미경과 지원을 대학 건강 네트워크의 고급 광학 현미경 시설 (www.aomf.ca)를 감사하고, 화장실, 이미징 단계의 제조 프린세스 마가렛 암 센터의 기계 공장에서 씨 제이슨 엘리스 것이다. 우리는 또한 원고 편집 박사 아이리스 Kulbatski에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height) |
| Coverglass (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
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