利用连续块面扫描电子显微镜分析脑线粒体

摘要

对哺乳动物脑组织中线粒体的可视化与分析是一项具有挑战性的任务。本文介绍了如何利用连续块面扫描电镜（SBFSEM）进行三维（3D）重建分析，以深入了解这一关键能量生成细胞器的形态学和体积特征。

摘要

人脑是一个高能耗器官，主要依赖葡萄糖作为能量来源。葡萄糖由脑线粒体进行分解代谢 通过 糖酵解、三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化（OXPHOS）途径，以生成三磷酸腺苷（ATP）形式的细胞能量。线粒体ATP生成障碍会导致线粒体疾病，其临床表现为显著的神经和肌病症状。线粒体缺陷也存在于神经发育障碍中例如 自闭症谱系障碍和神经退行性疾病（例如 肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病和帕金森病）。因此，研究领域对在健康和疾病状态下进行线粒体形态、结构及分布的三维分析日益关注。脑组织中的线粒体形态极为多样，尤其在突触区域的线粒体，其大小处于 <200 nm，低于传统光学显微镜的分辨率极限。在脑组织中表达线粒体靶向的绿色荧光蛋白（GFP）可显著增强共聚焦显微镜下对细胞器的检测能力。然而，该方法无法克服在不使大尺寸线粒体图像过度饱和的前提下，对相对较小线粒体的检测灵敏度限制。尽管连续透射电子显微镜已成功用于神经元突触部位线粒体的表征，但该技术极为耗时，尤其在比较多个样本时更为明显。连续块面扫描电子显微镜（SBFSEM）技术则采用自动化切片、成像组织块及数据采集流程。本文提供了一种针对啮齿类动物脑区特定区域进行SBFSEM分析的实验方案，可快速重建并可视化线粒体形态。该技术还可用于精确获取特定脑区内线粒体的数量、体积、大小及分布信息。由于所获图像分辨率高（通常低于10 nm），亦可检测到明显的线粒体形态学缺陷。

引言

线粒体是动态的细胞器，其形态和位置会根据细胞信号和需求而变化，与细胞骨架紧密相互作用，并响应神经元中的钙流等细胞事件。 ¹线粒体还与其他细胞器相互作用 例如 内质网，进而调节其动态变化和代谢过程²线粒体形态在不同类型细胞中表现出异质性 即细胞器的形态从管状到由片状、囊状和椭圆形结构组成不等。 ³已发现线粒体融合与分裂循环相关蛋白能够调控线粒体的位置、大小、形态及分布 ⁴此外，线粒体形态的变化与神经退行性疾病、神经元可塑性、肌肉萎缩、钙信号传导、活性氧生成以及细胞寿命和细胞死亡密切相关，表明细胞特异性的线粒体形态对于维持正常的细胞功能至关重要。 ^5-11.

线粒体的一项主要生物能量功能是通过一系列涉及营养物质完全分解的代谢反应生成三磷酸腺苷（ATP）即 葡萄糖、脂肪酸或氨基酸 通过 三羧酸循环和氧化磷酸化途径 ¹²人类大脑仅占体重的2%，却消耗了全身产生总能量的约20%，是能量需求极高的器官。 ¹³因此，人类线粒体功能障碍导致大量神经系统表现也就不足为奇了 ^14-17氧化磷酸化组分的基因突变导致ATP生成受损，从而引发线粒体疾病 ^17,18，这是一组临床表现异质性的疾病，患病率约为每5,000人中1例，是儿童和成人代谢性疾病中最常见的病因之一。线粒体来源ATP的缺乏会影响多个器官系统，其中高能量需求的器官如脑、心脏和骨骼肌在这些患者中尤为受累。 ^14,17,18近年来，多项研究为线粒体功能障碍在神经发育障碍和神经退行性疾病中的作用提供了证据 ^15-17,19,20由于线粒体对大脑的发育和功能至关重要，因此迫切需要建立能够分析健康与疾病状态下脑组织中线粒体形态、结构、大小、数量及分布变化的实验方案。已有研究构建了表达线粒体靶向绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠模型，用于观察脑内线粒体的运动与定位 ^21,22尽管这是一种用于研究线粒体运动性和总体分布的极为有用的工具，但其存在一些局限性，包括荧光显微镜的分辨率和灵敏度有限。这些特性使得追踪相对较小的线粒体变得困难。类似地，连续透射电子显微镜已成功用于观察突触线粒体。 ²³，但这种方法非常耗时。线粒体形态具有高度动态性，因其持续经历分裂与融合循环，在大多数细胞中，线粒体维持着高度互联的网络结构 ^24-26神经元是具有多个树突和长轴突的高度极性细胞，位于胞体内的线粒体虽可形成相互连接的网状结构，但在进入这些神经突起时可能需要发生分离。图1）。这使得脑线粒体在大小和形态上具有极大的多样性。例如，通过连续块面扫描电镜技术（SBFSEM），我们先前观察到，突触外线粒体与存在于神经末梢中的线粒体在体积或大小上的差异可能高达十六倍 ²⁷.

目前有多种方法可用于体积分析²⁸，包括连续切片透射电镜（TEM）²⁹、自动卷带收集超薄切片扫描电镜（ATUM-SEM）³⁰、聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM）³¹以及连续块面扫描电镜（SBFSEM）³²。SBFSEM分析的优势在于其分辨率足以提供有关细胞器（如线粒体）形态、大小、分布和数量的定量数据，分析区域可高达1 mm³的脑组织。该技术的操作要求也最低，数据采集与分析均可由许多缺乏前期电镜经验的生物实验室独立完成。商用仪器的出现使得生成类似连续切片的图像成为可能，从而使组织的三维超微结构分析成为一种常规技术，进一步实现了快速、可重复且无偏倚的体积分析²⁸。SBFSEM最早于2004年在神经生物学领域被描述并应用³²，其原理基于Leighton在1981年提出的想法³³。此后大量研究已确立该技术作为神经环路重建分析的主要工具之一³⁴。此外，对于许多规模较小的研究项目，该方法亦可提供细胞器识别所需的重建分析^27,35-39。由于所获取的图像来源于低电压背散射电子，研究人员开发了新的染色方案，结合多种已知的重金属染色技术，以提高分辨率⁴⁰。

本文提供了一种利用三维电子显微镜成像和脑线粒体体积分析的实验方案，该方法基于我们及他人先前使用过的方法^38,39,41。组织后续处理方法参照Deerinck et al⁴⁰此前所述进行。

方案

伦理声明：涉及动物实验的程序已获得弗吉尼亚理工大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

注意：操作和处置本方案中使用的多种组分时，必须采取极端谨慎的措施。使用前必须建立并遵守当地机构的相关指南和健康安全规范，特别是四氧化锇具有挥发性且剧毒，醋酸铀酰既是重金属又具有放射性，硝酸铅为重金属毒物。硫羰酰肼（TCH）若操作不当，可能分解产生易爆且有毒的气体。许多机构设有常规使用这些试剂的电镜核心设施，可提供相应的协助。

1. 脑组织制备与扫描电镜块面成像

1. 使用4–5%异氟烷按照机构指南对一只年轻的（约2–4月龄）C57黑鼠（C57BL/6J品系）进行麻醉。通过监测肌肉张力丧失、无自主运动以及对尾部夹捏等厌恶刺激无反应来确认麻醉状态。
2. 将小鼠固定于解剖托盘上，沿腹侧中线在皮肤上做一切口。进一步剪开皮肤以暴露小鼠肋骨。切开膈肌，沿周围仔细解剖胸腔以暴露跳动的心脏，然后在右心房上做一切口。
3. 使用蝶形针头穿刺左心室。通过心脏灌注10–20 ml磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2），直至肝脏颜色改变，确认放血完全。
   注意：肝脏颜色的变化可用于判断放血程度。需确认肝脏颜色由红褐色变为淡粉色。
4. 通过心脏灌注 10–20 ml 0.10 M 卡可基酸盐缓冲液（pH 7.2）配制的 2% 戊二醛和 4% 多聚甲醛，以从内部快速固定小鼠脑组织。通过观察尾巴僵硬程度来监测固定效果。
   注意：将2.14 g二甲胂酸钠溶解于80 ml水中，加入盐酸调节pH至7.2，再加水定容至100 ml，即可配制0.10 M卡可基酸盐缓冲液（pH 7.2）。
5. 灌注后，处死小鼠并分离脑组织，随后在含有2%戊二醛和4%多聚甲醛的0.10 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）中于4℃固定48小时 ^oC.
6. 48 小时后，使用振动切片机切出 400 µm 的冠状切片，然后在解剖显微镜下仔细分离脑内目标区域（例如，海马体） ⁴²小心修剪组织，并拍照以保留方位信息。
   注意：SBFSEM 中组织染色的后处理方法结合了多种重金属染色技术，以提高分辨率，该方法基于 Deerinck 早前开发的方法。 等⁴⁰.
7. 用0.1 M卡考基缓冲液（pH 7.2）洗涤经戊二醛固定的组织3次，每次5分钟。
8. 将鞣酸溶于0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）中，配制0.1%鞣酸溶液。轻轻摇动至溶解，必要时经0.45 µm滤膜过滤。
9. 用1 ml含0.1%单宁酸的卡考基酸盐缓冲液在室温下孵育30–60分钟，对组织进行后固定。
   注意：孵育时间取决于组织大小，但大多数组织以30分钟为宜。
10. 用 cacodylate 缓冲液（pH 7.2）洗涤组织 3 次，每次 5 分钟。
11. 将0.3 g亚铁氰化钾和0.86 g二甲胂酸钠溶于10 ml蒸馏水中₂O (dH₂O）。将亚铁氰化钾溶液置于冰上保存。使用前立即加入10 ml 4%四氧化锇（OsO₄).
12. 在冰上用2%四氧化锇-铁氰化钾溶液染色90分钟，用去离子水洗涤3次，每次5分钟。₂O.
13. 将0.1 g TCH溶于10 ml dH₂O中，配制1%硫代碳酰肼（TCH）溶液₂O. 60 °C下每10分钟摇动一次，直至完全溶解。操作TCH时需遵守安全预防措施，特别注意避免使用金属、高温加热或使溶液干涸。
14. 用新鲜配制的1% TCH在室温下处理样品20分钟。用dH₂O洗涤3次，每次5分钟。₂O.
15. 稀释4% OsO₄₄ 至2% dH₂用2%的四氧化锇水溶液对组织进行染色，孵育1小时。用去离子水洗涤组织3次，每次5分钟。₂O.
16. 在含1%醋酸铀的dH₂O中4℃孵育样品过夜₂O，4 °C下
17. 配制Walton's铅天冬氨酸溶液（按Deerinck所述方法） 等⁴⁰).
    1. 将0.998 g L-天冬氨酸溶解于250 ml dH₂O中₂然后逐滴加入10 N氢氧化钾（KOH），直至pH达到5.5。调节pH后，在10 ml天冬氨酸储备液中加入0.066 g硝酸铅，加热至60 °C并维持30分钟。
18. 用 dH₂O 冲洗组织₂O，并在60 °C烘箱中用Walton's铅天冬氨酸染色剂孵育30分钟。用dH₂O洗涤3次，每次5分钟。₂O.
19. 使用预冷的20%、50%、75%、85%梯度酒精溶液对样品进行脱水处理 和 95% 每次5分钟的乙醇洗涤两次，随后用100%乙醇洗涤3次，每次10分钟。
    注意：使用新开封瓶装的100%乙醇，因为开封后的乙醇会从空气中吸收水分，导致包埋失败。较大的组织样本需要更长的孵育时间。
20. 用丙烯氧化物洗涤样品2次，每次15分钟。
21. 使用25 ml树脂、10.5 ml DDSA（十二烯基琥珀酸酐）、15.5 ml NMA（降冰片烯二甲基酸酐）和1 ml DMP-30（2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚）配制塑料包埋树脂。通过振荡混合树脂。离心后静置，直至气泡完全消失。
    注意：这是标准硬度的介质配方。可使用其他类型的电子显微镜（EM）塑料树脂，但应提前使用非关键性对照样品进行测试，因为并非所有树脂均适用于SBFSEM。
22. 将组织在含有50 : 50混合比例的包埋树脂与环氧丙烷的溶液中，于样品瓶内4℃过夜孵育；孵育开始时盖紧瓶盖，2小时后打开瓶盖，使环氧丙烷在约8–10小时内逐渐挥发。
23. 将组织转移至洁净小瓶中的100%新鲜包埋树脂中，孵育2小时。
24. 将样品包埋于新鲜包埋树脂中，置于含有打印纸标签的平底模具内，在60 °C烘箱中固化48小时。约1小时后，再次检查组织位置与排列方向，必要时进行调整。
25. 将样品修剪至目标区域，使用凝胶型氰基丙烯酸酯超级胶水或导电环氧树脂将其固定在铝针上，然后在样品块侧面涂覆胶体银浆，以提供通往铝针的导电通路。
26. 使用配备腔内超薄切片机载台和低电压背散射电子探测器的扫描电子显微镜系统检查组织样本 ³².
    注意：需接受扫描电子显微镜（SEM）使用的仪器和场地培训，并成为授权使用者。或者，可考虑与研究人员或核心设施合作开展小型项目。由于扫描电子显微镜会产生X射线，可能还需接受辐射安全培训。
27. 成像样品时，请使用以下参数：2.25 kV，分辨率为 5 - 10 nm/像素，x,y 方向视场大小为 80 - 250 µm（也可选择其他视场大小），切片厚度为 50 - 100 nm，总切片数为 250 - 600 张，耗时 16 - 20 小时。
    注意：不同显微镜、不同样本及所需分辨率之间的设置差异较大。这些参数设置应能产生适用于多种样本的清晰可辨图像。

2. 分析成像数据集

注意：使用 ImageJ/Fiji 软件分析数据集，并依赖 TrakEM2 插件。预处理步骤可使用多种软件完成，具体操作的复杂程度可能因操作者经验水平和所获得的图像堆栈而异。此处描述的是使用开源软件（ImageJ 版本 1.50b，FIJI 下载日期为 2015 年 10 月 1 日）进行的主要处理步骤。

1. 将原始的专有16位图像在软件中打开，并通过选择菜单项 图像→类型→8位，将其转换为8位TIFF格式。
   1. 如果在此步骤中自动对比度/亮度转换对图像效果不理想，请重新打开16位图像，然后按下 图像→调整→亮度/对比度。选择适用于所有图像的范围，然后点击 应用。再执行转换。注意：在某些扫描电镜（SEM）上，此步骤可能需要显微镜制造商提供的专用软件。
   2. 如果因切片间图像移动过大（例如，由于电荷积累引起的漂移）而需要校正，请对图像堆栈进行配准/对齐（菜单项 插件→配准→Linear StackAlignmentWithSIFT）。在大多数配准软件中，应设置为"仅平移"模式，而非"刚体"模式。
      注意：多种方法和软件均可实现此功能：SIFT配准插件适用于许多应用场景，且存在虚拟堆栈版本。
      1. 如有需要，在配准前可先扩大画布尺寸（图像→调整→画布大小），或将其裁剪至感兴趣区域（图像→裁剪）。
         注意：可能会出现一定程度的漂移或展开现象，尝试其他插件或软件可能获得更优结果。也可采用手动方式（例如，ImageJ/FIJI，插件→配准→ManualLandmarkSelection）。
   3. 如需要，可使用ImageJ将图像缩放到更小、更易处理的尺寸（例如，25%）（图像→缩放）。
2. 启动软件，选择 文件→导入→图像序列，然后选择TIFF文件。
3. 通过选择 文件→新建→TrakEM2（空白）启动插件。将打开两个窗口；一个用于管理项目和区域列表，另一个用于轨迹绘制，称为“画布”。
4. 在画布上右键单击以导入图像堆栈。选择 导入 并点击 导入堆栈。在弹出的选项中，勾选“虚拟堆栈”选项。
   注意：尽管图像堆栈已在软件中打开，但仍需在插件中再次加载。若勾选虚拟堆栈选项，计算机运行可能更为流畅。
5. 当mipmaps生成且堆栈加载完成后，在插件窗口中右键单击以命名项目。在模板列中右键单击“新项目”，并为该项目选择“添加新子项”。再次右键单击，选择“区域列表”。
6. 通过右键单击画布，然后点击 显示 并选择 校准，设置项目的Z轴比例，使其与原始电子显微照片的设置一致。同时，在插件窗口中选中所有图层，右键选择 缩放Z轴与厚度，以设定Z轴比例。
7. 将“项目”及其所有“子项”点击并拖动至项目对象部分，以在画布窗口的“Z空间”选项卡下创建“区域列表”。
8. 选择“区域列表”，右键单击以选择并设置颜色。现在使用画笔工具在电子显微照片图像中追踪线粒体等结构。使用“Shift + 单击”填充封闭区域，“Ctrl + 滚动”实现缩放，以及“Alt + 单击”将画笔光标切换为橡皮擦。
9. 在图像的左上角和右下角各选择一个约10 - 15 µm × 10 - 15 µm的区域，并识别这些区域内的所有线粒体，以实现对每个数据集中的线粒体进行无偏采样。
10. 在“画布”上观察并逐层追踪线粒体。注意：线粒体是外观较暗/致密的细胞器，直径相近，呈松散的圆柱形。其内膜形成的独特嵴结构在该细胞器内部清晰可辨。
11. 完成追踪后，右键单击“Z空间”选项卡下的区域列表，选择“在3D中显示”。这将启动3D查看器插件，以查看所追踪图像的三维重建结果。
    1. 如需进行线粒体体积测量，请在3D查看器中选择目标对象，点击“编辑”选项卡并选择“对象属性”。线粒体体积估计值将与其他若干测量参数一同列出。

结果

我们证明了脑内线粒体的形态和大小在不同神经元亚区室中具有异质性。通过对低密度神经元培养物转导表达线粒体靶向绿色荧光蛋白的慢病毒，并进行共聚焦显微镜观察，结果显示位于神经元胞体内的线粒体形成网状结构，而远端神经突中的线粒体则呈现离散的长条形形态。图1 A-B）。利用连续块面扫描电镜（SBFSEM）技术，分析了小鼠脑组织中线粒体的形态、大小、体积及分布情况。从小鼠脑 hippocampus 区域的神经突和突触中重建了线粒体的三维（3D）图像。鉴定了突触前线粒体，并量化了含有驻留线粒体的突触前终末数量。在树突与轴突区室之间观察到线粒体大小存在异质性。图1 C-D）。此外，小鼠脑海马体中许多小型的突触前区室缺乏线粒体（图2 A-C）。对突触前和突触外线粒体的体积测量结果显示，位于神经元突触前部位的线粒体体积或大小显著小于位于突触外区域的线粒体（图2 D-F）。有趣的是，通过对200个非胞体线粒体进行无偏采样所测得的二维（2D）线粒体大小分布显示，...

讨论

神经系统的复杂性在重建大体积组织并以足够分辨率分析线粒体等细胞器的形态和分布方面带来了重大挑战。脑组织内包含多种细胞，如神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，这些细胞具有大量在三维空间中延伸的突起，并相互作用⁴³。由于线粒体不仅存在于细胞胞体中，也分布于远端突起内，因此其在神经系统中的形态表现出极强的多形性（图1）。因此，传统的光学显微技术（如共聚焦显微镜或双光子显微镜）无法获取足够分辨率的三维结构信息^44,45。目前唯一能够以足够高分辨率实现神经组织大体积重建的技术是电子显微镜。传统上，神经组织的三维重建依赖于超薄切片的连续切片透射电子显微镜（SSTEM）技术²⁹。然而，近年来的技术进步显著提升了体积电子显微镜数据采集的质量和自动化水平。

SBFSEM 是一种自动化的块面成像技术，通过在扫描电子显微镜腔室内进行连续切片，实现对数百微米范围内组织结构的三维重建，其分辨率足以追踪最细小的细胞突起并识别小型细胞器。该技术为常规重建无脊椎动物和脊椎动物神经系统带来了新的前景。该方法包含多个步...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J 小鼠	Jackson laboratory	664
异氟烷	VETone，商品名 Fluriso	501017
解剖托盘	Fisher scientific	S65105
解剖剪	Ted Pella Inc.	1316
蝶形导管	Exel International	26704
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
滤膜（0.45 微米）	EMD Millipore	NC0813356
解剖显微镜	Olympus	SZ61
振动切片系统	Ted Pella Inc.	Vibratome 3000
二甲胂酸钠	EMS	12300
单宁酸	EMS	21700
亚铁氰化钾	J.T. Baker	14459-95-1
四氧化锇 4% 溶液	EMS	19150
硫代碳酰肼	EMS	21900
L-天冬氨酸	Sigma-Aldrich	A93100
氢氧化钾	Acros Organics	43731000
硝酸铅	EMS	17900
EMbed-812 包埋试剂盒	EMS	14120	包含 Embed 812  树脂、DDSA、NMA 和 DMP-30。
25% 电子显微镜级戊二醛	Polysciences Inc.	1909
多聚甲醛	EMS	19202
醋酸铀	EMS	22400
乙醇	EMS	15055
环氧丙烷	EMS	20400
包埋模具	EMS	70907
铝制样品针	EMS	70446
胶体银溶液	EMS	12630
剃刀	EMS	72000
超级胶水（Loctite Gel Control）	Loctite	234790	五金或手工用品商店有售
导电环氧树脂	Ted Pella Inc.	16043
扫描电子显微镜	Zeiss	Sigma VP
用于扫描电镜的腔内超薄切片机	Gatan Inc.	3View2	可适配其他扫描电镜
用于样品针制备的修块显微镜	Gatan Inc.	作为 3View 系统的一部分提供
低加速电压背散射电子探测器	Gatan Inc.	3V-BSED
ImageJ/Fiji 图像处理软件包	ImageJ 版本 1.50b，FIJI 于 2015 年 10 月 1 日下载	http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2