Introduction
Bentik süspansiyon besleyiciler deniz ekosistemlerinin 1 işleyişinde temel rol oynamaktadır. Su 2,3 geniş hacimli filtreleyerek, onlar kaldırmak ve partiküler (plankton ve detritus) ve (burada ve referanslar) çözünmüş bileşikler 1 ifraz ve bentik-pelajik bağlantı 4,5 ve besin döngüsü 6,7 önemli ajan vardır. Doğru partikül ve çözünmüş bileşikler kaldırılır ve (örneğin, süngerler, Ascidians, polychaetesi, ve Bivalvlerden gibi) bentik süspansiyon besleyiciler tarafından atılır ölçme onların fizyolojisi, metabolizma ve beslenme ekoloji anlamak esastır. Birlikte hızı ölçümleri pompalama ile, aynı zamanda bu organizmalar ve su kalitesi yanı sıra ekosistem ölçekli süreçleri ekolojik etkisi aracılık ettiği besin akı bir miktarının sağlar.
kaldırma ve üretim partikül oranı ve çözünmüş com ölçme uygun yöntemi seçmeSüspansiyon filtre besleyiciler tarafından lira beslenme aktivitesini 8 ile ilgili güvenilir veriler elde etmek için çok önemlidir. Riisgård ve diğerleri, uygunsuz yöntemler önyargı sonuçları işaret ettiği gibi, deneysel koşullar deforme yenmesi ve bazı maddelerin atılımı yanlış tahminler üretmek ve bu organizmalar tarafından işlenen besin akı hatalı ölçümü yol açabilir.
iki en sık kullanılan yöntemler inkübasyon (dolaylı teknikler) ya da ortam eşzamanlı toplama ve üfledi su (doğrudan teknikleri) ya dahil filtre besleyiciler partikül ve çözünmüş besin akıları ölçmek için. İnkübasyon yöntemleri inkübe su içinde parçacık konsantrasyonu ve çözünmüş besin değişim oranını ölçmek ve yeterli kontrol 8 ile karşılaştırıldığında, üretim veya kaldırma hızları tahmin dayanmaktadır. Bununla birlikte, bir inkübasyon odası içinde bir organizma içine kendi Feedin değiştirebilirg nedeniyle ve / veya gıda konsantrasyonda nedeniyle ya da boşaltım kuluçka su 7,9 bileşiklerin (ve referanslar orada) birikimine oksijen bir düşüş nedeniyle doğal akış rejiminde değişiklikler davranışı pompalama. Kapatılma ve modifiye su etkilerine ek olarak, inkübasyon teknikleri büyük bir eğilim yeniden filtreleme etkileri (örnek 10 bakınız) kaynaklanmaktadır. Bu metodolojik sorunların bazıları inkübasyon kabına 11 sağ hacim ve şekil kullanarak veya yerinde 12 bir sirkülasyon çan kavanoz sisteminin getirilmesi ile üstesinden olmasına rağmen, bu tekniğin genellikle çıkarma ve üretim oranları göz ardı etmektedir. Bu çözünmüş organik azot (DON) ve karbon (DOC) ya da inorganik besin olarak çözünmüş bileşiklerin metabolizması miktarının, inkübasyon teknikleri 13 kaynaklanan önyargılar özellikle yatkın olduğu kanıtlanmıştır.
60'ların sonlarında ve 70'lerin başlarında Henry Reiswig içinde9,14,15 ayrı yerinde organizmalar tarafından inhale ve üfledi su örnekleme yoluyla, dev Karayip süngerler tarafından parçacık kaldırma ölçmek için doğrudan tekniklerin uygulanmasını öncülük etmiştir. Daha küçük süspansiyon besleyiciler ve daha zorlu sualtı koşullarda Reiswig tekniğini uygulamak için zorluk nedeniyle, bu alandaki araştırmaların toplu çoğunlukla dolaylı kuluçka teknikleri 16 kullanılarak (in vitro) laboratuvara sınırlandırılmıştır. Yahel ve arkadaşları küçük çaplı şartlarında çalışmak için in situ tekniği Reiswig doğrudan sığdırılmıştır. Bu yöntem, Inex 16 olarak adlandırılan, rahatsız organizmalar tarafından (Ex) (In) inhale ve ekshale su eşzamanlı sualtı örnekleme dayanmaktadır. Numunelerin bir çift (inex) arasında bir bir madde (örneğin, bakteri) farklı konsantrasyonlarda hayvan tarafından bu maddenin tutma (veya üretimi) bir ölçüsünü sağlar. INEX tekniği açık uçlu tüpler istihdam vepasif toplama tüpünde ortam su yerine çalışılan organizmanın pompalama faaliyeti tarafından üretilen excurrent jet dayanır. Yahel ve arkadaşları başarılı 15 farklı süspansiyon çalışmada bu tekniği uygulanmış olsa da takson besleyiciler (örneğin, 17), yöntem bazı excurrent menfezlerin ufacık büyüklüğüne göre gerekli uygulama ve deneyimi yüksek seviyede ile kısıtlı olup, tarafından deniz koşulları.
Bu engelleri aşmak için, biz dakika tüpleri ile örneklenmiş suyun kontrollü emme (dış çapı <1,6 mm) dayalı alternatif bir teknik geliştirdi. Amacımız bu tür bentik süspansiyon besleyiciler excurrent deliği gibi temiz ve çok özel bir noktada, in situ su örnekleme kontrol sağlayacak basit, güvenilir ve ucuz cihaz oluşturmak oldu. Etkili olabilmesi için, yöntem, ortam akış rejimini etkileyen veya b değiştirmek şekilde değil müdahaleci olmayan olmak zorundaçalışılan organizmaların ehavior. Burada yer alan cihaz, VacuSIP olarak adlandırılır. Bu Yahel ve arkadaşları tarafından geliştirilen SIP sisteminin bir basitleştirme olduğunu. Derin deniz ROV tabanlı noktası örnekleme (2007) 18. VacuSIP orijinal SIP çok daha ucuzdur ve SCUBA-bazlı çalışmalar için adapte edilmiştir. Sistem laboratuvar ortamlarında için Wright ve Stephens (1978) 19 ve Møhlenberg ve Riisgård (1978) 20 tarafından sunulan ve test edilmiş prensiplere göre dizayn edilmiştir.
VacuSIP sistemi bentik süspansiyon besleyiciler metabolizmasının in situ çalışmalar için tasarlanmış olsa da, aynı zamanda, laboratuar çalışmaları için kullanılabilir ve daha kontrollü ve temiz, nokta-kaynağı, su örneği yerde gereklidir. In situ filtrasyon veya uzun süreli (en az-saat) boyunca entegre gerekmektedir sistem özellikle yararlıdır. VacuSIP 2011 yılından bu yana YAHEL laboratuarda başarılı bir şekilde kullanılmıştır ve ayrıca sahiptirKarayipler ve Akdeniz sünger türlerinin 21 aracılı besin akı iki son yıllarda yapılan çalışmalarda istihdam edilmiştir (Morganti ve ark. sunulmuştur).
VacuSIP uygulandığı özel numune, uzun örnekleme süresi ve tarla koşullarında, kullanımı toplama filtre ve duyarlı analitler için numune depolamak için, standart protokoller Okyanusbilimsel bazı sapmalar gerektirir. VacuSIP sistemi veya toplama sonra bakteriyel aktivite ile alınan su numunelerinin modifikasyonu riski ile kontaminasyon riskini azaltmak için, biz yerinde filtrasyon ve depolama işlemlerinde çeşitli test edilmiştir. Farklı filtreleme cihazları, toplama gemiler ve depolama prosedürleri çözünmüş inorganik (PO 4 3-, NO x - NH 4 +, SiO 4) analizi için en uygun tekniği elde etmek için incelenmiş ve organik (DOC + DON) bileşikleri ve ultra plankton (<1081 m) ve partiküler organik (POC + PON) örnekleme. Diğer bir özellikle alan koşulları altında, kirlenme riskini azaltmak için, işleme adımlarının sayısı minimumda edildi. yöntem sunulduğu görsel biçim tekrarlanabilirliği kolaylaştırmak ve verimli tekniği uygulamak için gereken süreyi azaltmak için aydınlatmaktadır.
Sistem görünümü
2 mm kadar küçük exhalant deliklerle süspansiyon besleyiciler in situ pompalanan su içinde örnek için, her bir numunenin pompa etkinliği ilk aşağıdaki uçucu menfezi (ler) i ve excurrent açıklığı 16 akışını gözlemleyerek fluorescein boyalı deniz suyu, süzüldü salgılayarak görüntülenmiştir (18 şekil 2b de bakınız). Çalışma örneğinin (Cari Olmayan ve excurrent) tarafından inhale ve üfledi su, daha sonra eş zamanlı olarak özel olarak oluşturulmuş bir manipülatör yüklü dakika tüpler bir çift kullanımı ile ya da "ar ikisine örneklenirbaş aşağı esnek taşınabilir tripod ms "(Şekil 1 ve Ek Video 1). Çalışma organizma tarafından inhale su dikkatlice içinde veya çalışma organizmanın uçucu madde diyafram yakın bir tüpün proksimal ucunu yerleştirerek toplanır. Bir özdeş tüp daha sonra excurrent menfez içine yerleştirilir. Bu işlem tortu tabanda, örneğin kişi veya hayvanın bozukluğu, önlemek için iyi bir bakım gerektirir. örneklemeyi başlamak için, bir dalgıç bağlı bir şırınga iğnesi ile toplama kabında bir septumu delip örnekleme tüpü içinden kap içine alınan su numuneleri zorlamak için harici su basıncı sağlayan, her tüpün uzak ucu. emiş önce şişelere oluşturulan vakum ile ve dış su ve tahliye numune kabı arasındaki basınç farkı ile başlatılır .
üfledi su temiz bir koleksiyon sağlamak ve ambi yanlışlıkla emme önlemek içinent suyu 16, su örnekleme hızı excurrent akış oranı önemli ölçüde daha düşük bir hızda (<% 10) muhafaza edilmesi gerekmektedir. Emme hızı, borunun uzunluğu ve iç çapı (ID) ile kontrol edilir. küçük iç çapı da ihmal edilebilir bir ölü hacmi (<boru metre başına 200 ul) sağlar. uzun süreli (saat dakika) üzerinde örnekleme mümkün ilgi çoğu maddelerin doğal patchiness entegre etmek için yapar. Numuneler yeterince laboratuara taşınması yanı sıra uzun süreli sualtı örnekleme oturumları korunur sağlamak için yerinde filtrasyon bir hassas analitler için tavsiye edilir. Örnekleme gemiler, filtrasyon montaj ve boru seçimi çalışması organizmalar ve özel araştırma sorusu tarafından dikte edilir. Aşağıda açıklanan protokol tam metabolik profili (genel bir bakış için bakınız Şekil 2) ilgi olduğunu varsayar. Ancak, protokolün modüler yapısı f veriyorveya kolay değişiklik basit, hatta çok farklı örnekleme planları karşılamak için. Tam metabolik profil için örnekleme protokolü aşağıdaki adımları içermelidir: (1) Akış görselleştirme; (2) Örnekleme ultra plankton besleme (plankton <10 mikron); (3) (in-line filtreleri kullanarak) inorganik besin alımı ve atılımı Örnekleme; (4) Örnekleme organik alımı ve atılımı çözünmüş (in-line filtreleri kullanarak); (5) Partikül besleme ve atılımı (in-line filtreleri kullanarak); (6) 2. adımı tekrarlayın (kalite kontrol gibi ultra-plankton besleme); (7) görselleştirme akış.
Lojistik mümkün, metabolik profil ölçümleri hızı pompalama ile birlikte kullanılması tavsiye edilir (örn, boya ön hız yöntemi, 16) yanı sıra solunum ölçümleri. Bu ölçümler en iyi örnekleme oturumun başında ve sonunda alınır. solunum ölçümü için, sualtı optodes veya mikro-elektrotlar tercih edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hazırlık Adımları ve Temizlik İşlemleri
- Temizlik çözümü
- her zaman koruyucu giysiler, bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin. toz ve duman ücretsiz temiz alanda bu hazırlık adımları uygulayın.
- Taze, yüksek kaliteli, iki kez distile su ile% 5-10 hidroklorik asit (HCl) çözeltisi hazırlayın.
- % 5 anyonik ve iyonik olmayan yüzey aktif madde çözeltisi, yüksek ölçüde çözünür bazik bir karışım hazırlayın, taze, yüksek kaliteli, iki kez distile su ile (Malzeme listesine bakınız).
- temiz tüm çözümleri saklayın, asit kapları yıkanır.
- Hazırlık aşamaları ve (laboratuvarda) temizleme prosedürleri
NOT: fosfor bileşikleri ilgi değilseniz, HCI yıkama kaliteli fosforik asit (H 3 PO 4) yıkama (% 8 H 3 PO 4 nihai konsantrasyon) ile değiştirilebilir.- her zaman koruyucu giysiler, bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin.
- YıkamaYüksek saflıkta su bol miktarda (in-line paslanmaz Swinney filtre tutturucunun hariç) numûne alma düzeneğini göstermektedir. bir gecede% 5-10 HCl çözeltisi iliklerine aparatı bırakın. yüksek kaliteli çift distile su bol miktarda tekrar aparatı durulayın.
- yüksek saflıkta su bol miktarda in-line paslanmaz çelik Swinney filtre sahipleri yıkayın. gece boyunca,% 5 anyonik ve iyonik-olmayan yüzey aktif maddeler çözeltisi yüksek derecede çözünür bazik karışımı nemlendirici filtre tutturucuları bırakın. bol kaliteli çift distile su ile tekrar yıkayın.
- Tüm örnekleme cihazı kurutun alüminyum folyoya sarın ve kullanıma kadar temiz kutuda saklayın.
- Emiş hızı kontrolü
- uzunluğu ve planlı çalışma derinliği ve su sıcaklığına göre emme boru iç çapını ayarlayarak örnekleme hızını kontrol edin. Tam devel için kullanılan Hagen-Poiseuille denklemi türetilen aşağıdaki denklem (kullanınBir kılavuz olarak lanan laminer boru akışı):
F = akış hızı (cm 3 dk -1), Ap = diferansiyel basıncı (bar), r = giriş iç yarıçapı tüp (cm), K = 2.417 x 10 -9 (sn -2), L = boru uzunluğu (cm ), V = su viskozitesi (g cm-1 sn-1). Daha fazla bilgi için Tablo 1'e bakınız. - çalışılan hayvan pompalama oranı% 1'in altına örnekleme oranı tutun.
NOT: bilinmiyor vakum ile bazen, tahliye kapları kullanarak ek komplikasyonlar oluşturmaktadır. Bu nedenle, bir saha testi şiddetle tavsiye edilir. 10 m derinlikte ve ~ 22 ° C, deniz suyu (40 PSU) 'de, 254 um'lik bir iç çapı olan bir 50 cm giriş hortumunu 26 ul sn-1 (-1 1.56 mi dakika) ~ ortalama emme oranı sağlar.
- uzunluğu ve planlı çalışma derinliği ve su sıcaklığına göre emme boru iç çapını ayarlayarak örnekleme hızını kontrol edin. Tam devel için kullanılan Hagen-Poiseuille denklemi türetilen aşağıdaki denklem (kullanınBir kılavuz olarak lanan laminer boru akışı):
- örnekleme gemiler
- Küçük hacimli numuneler (3-20 ml, örneğin, akış CYT ultra-plankton içinometry) Önceden Vakumlu steril plastik tüpler kullanın.
NOT: Ön vakumlu steril plastik tüpler rutin insanlarda standart kan testleri için kullanılır; Hiçbir katkı maddeleri ile steril tüpler kullandığınızdan emin olun. Bu vakumlanmış steril plastik tüpler en iyi merkez dışı Luer ile steril, tek kullanımlık tüp tutucu kullanımı ile örneklenir. Bu en güvenli ve etkili örnekleme cihazı da, basit bir iğneye kıyasla biraz daha büyük bir ölü hacme sahiptir. - Bu tür besinler ve çözünmüş organik olarak büyük su örnekleri için, uçucu organik analizler için Çevre Koruma Ajansı (EPA) kriterlerini karşılayan 40 veya 60 ml cam şişeleri kullanın. Bu şişeler, bir PTFE yüzlü silikon septum ile bir polipropilen kapak içerir.
- daha büyük hacimler için, kauçuk tapalar veya vakum şişeleri ile penisilin şişeleri kullanın.
- Silika örnekleri için yüksek yoğunluklu polietilen şişeleri (HDPE şişeler) kullanın.
- numune hacmi artırmak ve stoper çıkartılmasından riskini azaltmak içinçıkış sırasında, bir vakum pompası ile dalış öncesi (vakum) öğeleri 1.4.2-1.4.4 tahliye. Vakum manuel bir el vakum pompası ya da bir şırınga ile hava emerek kullanarak. Ancak en iyi sonuç için, iyi bir vakum pompası tavsiye edilir. Standart lyophilizers yüksek vakum içerir.
NOT: Daha hızlı başlangıç emme oranı üfledi su örnekleri kontamine olmaz emin olmak için büyük vakumlu şişeler kullanırken özel dikkat gösterin.
- Küçük hacimli numuneler (3-20 ml, örneğin, akış CYT ultra-plankton içinometry) Önceden Vakumlu steril plastik tüpler kullanın.
- Gemi temizleme prosedürleri
- Çözünmüş organik ve NH 4 + analiz için, yeni ön temizlenmiş EPA şişeleri kullanın.
- aşağıdaki gibi diğer besin analizi için şişeleri (cam ve HDPE) durulayın:
- şişeleri (cam ve HDPE) ve yüksek kaliteli çift distile su ile polipropilen kapakları durulayın. Yeni bir silikon septum takın.
- En az 3 gün boyunca HCl% 10 şişeleri (cam ve HDPE) ıslatın ve bol kaliteli çift distile su ile durulayın.
- 4 saat 450 ° C'de bir cam şişe yanma ve fırın içinde soğumaya bırakılırlar. kapağını takın ve kullanıma kadar alüminyum folyo ile sarın.
- Filtreler
- (Örneğin, DOC, DON) tüm çözünmüş organik örneklerin filtrasyon ve (örneğin, POC, PON) partikül organik maddelerin toplanması için bağlayıcı içermeyen cam elyaf filtreleri kullanın. Ayrı bir alüminyum folyo zarf içinde her cam filtre paketi. kullanılana kadar temiz ve kuru bir kap içinde, organik tortuları ve mağaza uçucu hale getirilmesi için 2 saat boyunca 400 ° C 'de yanma.
- Inorganik besin örnekleme için bağlayıcı içermeyen yukarıda cam elyaf filtreler, ya da 0.2 um polikarbonat membranlar ya kullanın (örneğin, PO 4 3-, NO x - NH 4 +). (1.7.3) aşağıda açıklandığı gibi bir kez filtre yuvasına monte ikincisi temizleyin.
- Silika örnekleme için 0.2 mikron polikarbonat membranlar filtreleri kullanın. bir kez Installe temizleyinizFiltre tutucuya d daha (1.7.3) aşağıda açıklanmıştır.
- Filtrasyon montaj hazırlanması
- Filtrasyon düzeneğinin temizlenmesi için kullanmadan önce, bir 0.2 mikron filtre içinden anyonik ve iyonik olmayan yüzey aktif madde çözeltisi ve yüksek kaliteli çift damıtılmış su yüksek ölçüde çözünür bazik karışımı filtre.
- besin ve silis dışındaki çözünmüş organikler için filtrasyon tertibatı:
- temizlenen in-line paslanmaz çelik Swinney filtre tutucu içinde yanmış bağlayıcı içermeyen cam elyaf filtreleri yerleştirin.
- Tüm düzenek arasından anyonik ve iyonik olmayan yüzey aktif madde çözeltisi,% 5 yüksek derecede çözünür bazik bir karışımı, 100 ml ve yüksek kaliteli çift damıtılmış su, sonra 100 ml çalıştırmak üzere bir asit-temizlenmiş şırınga kullanın.
- SiO 4 Filtreleme montaj:
- temizlenmiş polikarbonat filtre tutucu (PC filtre tutucusu) içindeki polikarbonat filtresi yerleştirin.
- r bir asit-temizlenmiş şırınga kullanınun% 5 HCI, 30 ml ve tüm montaj yoluyla yüksek kalitede iki kez damıtılmış 30 ml su.
- sistem montajı
- 1,6 mm dış çapı (OD) ve 254 mm veya 177 mikron iç çapı (ID) ile PEEK (Polieter Eter Keton) boru kullanılarak sualtı çalışmaları için sistemi monte edin.
- Gerekli uzunlukta tüpler kesmek için keskin bir bıçak veya PEEK kesici kullanın.
- distal ucunda (numune kabı tarafı) 'de, bir şırınga iğnesi bağlanmış bir erkek Luer konektörüne her tüp uygun. üreticinin talimatları izleyin ve yeşil somunu sıkma önce tüpün sonuna mavi flangeless halkasının düz tarafı hizaya emin olun.
- bir yalıtım bandı kullanarak tripod "silah" ya da özel yapım manipülatör için PEEK tüp takın.
- erkek Luer konektörüne bir tek kullanımlık şırınga iğnesi takın. yaralanmaları önlemek için koruyucu kapak ile iğne tutun. Açıkça örnekleme dişli ve renk kodunu etiket tüm inhale ve ekshale bileşenler (örneğin, = yeşil olarak kırmızı = Ex).
- Benzer renk kodu eşleştirilmiş örneklem gemilerin setleri ile örnekleme gemiler sırayla numaralandırılmış.
F = akış hızı (cm 3 dk -1), Ap = diferansiyel basıncı (bar), r = giriş iç yarıçapı tüp (cm), K = 2.417 x 10 -9 (sn -2), L = boru uzunluğu (cm ), V = su viskozitesi (g cm-1 sn-1). Daha fazla bilgi için Tablo 1'e bakınız. 2. Çalışma Sualtı
- Şantiye hazırlığı
- Ön araştırma ve örneklerin seçimi
NOT: nedeniyle sualtı örnekleme protokolü karmaşık doğası, verimli bir örnekleme dalış sağlayacak hazırlanması için gerekli zaman harcamaktadır.- şantiye anket ve vaktinden gerekli hazırlıkları yapmak.
- Seçin ve nispeten kolay ulaşılabilir uygun hedef organizmaları işaretleyin. tüm organizmalar mutlaka örnekleme dalış anda etkin olabilir beri, örnek beklediğinizden daha fazla iş istasyonları hazırlamak.
- Baz dayanakların montajı
- when tesviye substrat üzerinde çalışıyor:
- 1 kg dalış ağırlıkları esnek tripod özgün tutuşunu klip monte edin ve sadece bir sonraki hedef hayvana konumlandırmak.
- dikey duvarlar üzerinde çalışırken:
- şantiye hazırlık aşamasında (2.1.1) sırasında tepsiyi taşıyan toplama kabı için Dağı taban desteği VacuSIP sistemi için levhalar, aksesuar dişli kancalar ve askıları.
- Esnek taşınabilir tripodlar kullanıldığı zaman, her bir hedef hayvanın yanına 10x10 cm PVC levhaları sabitlemek için cıvataları veya iki bileşenli epoksi reçine kullanın. Her plaka esnek taşınabilir tripod tutuşunu klipleri eklemek için bir delik olması gerekir.
- reçine kuruduğu ve taban plakaları sağlam duvara iliştirilmiş sonra, VacuSIP sistemi için esnek taşınabilir tripod için sağlam bir bağlanma noktası olarak hizmet veren, çabuk klipleri vidalayın.
- when tesviye substrat üzerinde çalışıyor:
- Ön araştırma ve örneklerin seçimi
- Va TakmaCUSIP
- Numune uçucu deliğinin yanında, süzüldü, fluoresein boyası bırakarak pompalama olup olmadığını kontrol edin ve Yahel diğerleri de tarif edildiği gibi, boya exhalent menfez içinden çıkan onaylamak. (2005) 16.
- VacuSIP aygıtı yüklemek ve ona (5 ~ içinde mm) hemen yanında uçucu deliği içinde uçucu madde (IN) örnekleme tüp yerleştirmek ya da. Uçucu madde tüpü başka exhalant ağzının yakınında olmadığından emin olun.
- Dikkatle osculum / exhalant sifon doğru exhalant (EX) örnekleme tüpünü yönlendirmek ve osculum / exhalant sifon (Şekil 1 ve Ek video 1'e bakınız) içinde 1-5 mm yerleştirilir kadar çok nazikçe onu eklemek. ile temas veya başka örneklenmiş organizmayı rahatsız etmemek için büyük özen.
- Önce ve örnekleme sırasında her iki tüplerin yerini çift kontrol edin.
- Örnekleme kontrolünden sonra numune hala des olarak pompalama olup olmadığınıYukarıdaki (2.2.1) açıklanan şekilde.
NOT: oluşabilecek diğer işlenirken tripod bir kol hareketi, öncelikle daha hassas manipülasyon gerektiren uçucu örnekleme tüpü ve ikinci exhalant tüp, yere emin olun çünkü. exhalant örnekleme tüpünün manipülasyon uçucu madde tüpün hareketini neden olabilir bile, bu emri ardından, örnekleme etkilemez.
- Modüler sualtı numune alma prosedürü
NOT: araştırma sorusu üzerine bekleyen, aşağıda deneysel adımların her biri tek başına bir deney olarak yapılabilir. Aşağıda açıklanan tam metabolik profil örnekleme protokolü örnek başına 8 saate kadar gerektiren uzun bir süreçtir (genel bir bakış için Şekil 2 ve Tablo 2). dalış koşulları ve yönetmelikler örnekleme siteleri, bölgeler ve kurumlar arasında farklılık gösterdiğinden, dalış planları bu protokol dahil değildir. Bununla birlikte, son derece dikkatli ve Meti adamakdalış planı culous planlama. doygunluk ve yoyo dalış profillerini önlemek için özel bakım ödemek. Mümkün olduğunda, deneyler, sığ derinliğe (<10 m) yürütmek tavsiye edilebilmektedir. Kapalı devre devridaimleri tür uzun süreli örnekleme planları için çok kullanışlı olabilir.- Gerçek örnekleme başlamadan önce, floresein kalıntısının hiçbir görünür izleri kalır ve bu askıya sedimanlar yerleşmiş olan veya uzak wafted emin olun.
- Ultra plankton, (hiçbir filtre bu adımda yüklü!)
- (Ekzalasyon) IN (inhalasyon) ve EX steril plastik tüpler septa Vakumlu delmek için iğne kullanın. Suyun planlı oranda damlayan doğrulayın ve 2-6 ml su örnekleri toplamak.
- alma üzerine, buz üzerinde, soğuk kutu içinde örnekleri tutmak. Laboratuarda, 1 +% 0.05,% paraformaldehid EM notu glutaraldehid (nihai konsantrasyon) ya da% 0.2 EM derecesi glutaraldehid ile korunur. -80 & Sıvı azot ve mağaza cryovials dondurun# 176; analize kadar C.
- Silikat örnekleme ve saklama
- iğne ve borunun uzak ucunda Luer erkek konektör arasında 0.2 um polikarbonat membran ihtiva eden önceden temizlenmiş ve online paslanmaz bilgisayar Filtre haznesi takın.
- Pierce önceden temizlenmiş yüksek yoğunluklu polietilen şişeler (HDPE şişeler) arasında bölmeli kapak örnekleme başlatın. Her iki numune alma damlama emin olun ve her bir küçük şişe içinde 15 mL su toplanır.
- analize kadar soğutulmuş örnekleri (4 ° C) muhafaza edin. Analiz -20 ° C'de iki hafta, mağaza içinde başlaması mümkün değil. analizi için, numuneler, silika jel çözmek için en az 50 dakika boyunca 50 ° C'de eritildi emin olun.
NOT: Gerektiğinde zar mikroskopi veya DNA analizi için muhafaza edilebilir.
- Çözünmüş inorganik (PO 4 3-, NO x - NH 4 +)
- t değiştirinÖnceden yakılır cam filtre içeren bir önceden temizlenmiş in-line paslanmaz çelik filtre tutucusu ile o PC filtre düzeneği.
- numune önce, deniz suyu örneklerinde, en az 20 mi emme başlatmak için EPA, HDPE şişeler veya diğer vakum kabı kullanarak, tüm filtrasyon sistemi üzerinden geçirildi emin olun. Onlar atılır önce toplanan suyun hacmini ölçmek.
- Pierce, örneklemeye başlamak hem numune damlayan emin olun ve nitrat ve fosfat analiz için 25-30 ml toplamak için uygun EPA cam şişelerin septum kapağı.
- Amonyak analizi için yeni EPA cam şişe geçmek hem numune damlayan emin olun ve her şişede 20 ml toplamak.
- analize kadar -20 ° C'de bir buz ve deposunda soğuk kutu içinde örnekleri tutun.
NOT: Sadece Süzüntü ilgi ise, atılabilir şırınga filtreleri adımları 2.3.3 ve 2.3.4 için kullanılabilir.
- Çözünmüş organik (DOC + DON) örnekleme ve storing
NOT: böylece Numune su silikon septa ile temas etmez taşıma boyunca olduğunca dik mümkün olduğunca örnekleri tutun.- Paslanmaz çelik filtre tertibatı kullanılarak devam etmek ve yukarıda tarif edildiği gibi, yeni EPA cam şişelere deniz suyu numunelerinin 20 ml toplar.
- alma üzerine, buz üzerinde, soğuk kutu içinde örnekleri tutmak. Laboratuarda, ortofosforik asit ile örnekleri düzeltmek için bir ön-yakılır cam Pasteur pipet kullanın ya da hidroklorik asit (20 ml örnek, nihai konsantrasyon% 0.04 içine% 25 eser metal sınıf asit 5-6 damla) (2 damla eser metal derecesi 20 ml örnek, nihai konsantrasyon% 0.1) içine asit konsantre edildi ve frigorifik tutun.
- analize kadar soğutulmuş örnekleri (4 ° C) muhafaza edin. Numuneler analize kadar -20 ° C'de koleksiyonu, mağazanın bir hafta içinde analiz değilseniz.
- Partikül organik madde (POC, PON, POP)
- st kullanarak devamçelik filtre montajı ve filtre boşaltılmış 250 ml termos içine deniz suyu en az 500 ml ainless. Gerekirse şişeler değiştirin.
- alma üzerine, filtre sahibinden kalan tüm deniz suyunun tahliye alüminyum folyoya sarın ve buz üzerinde soğuk bir kutu içinde saklamak için bir hava ile dolu şırınga kullanın. Laboratuarda, filtre tutturucularda filtreleri çıkarın ve analize kadar -20 ° C'de saklayın.
- Gerçek örnekleme başlamadan önce, floresein kalıntısının hiçbir görünür izleri kalır ve bu askıya sedimanlar yerleşmiş olan veya uzak wafted emin olun.
Şekil 1. VacuSIP doğru tesislerin bir örnek: inhale ve solunan su numuneleri için sarı (fotoğraf için yeşil kullanılan renk kodu ile özel bir dahili manipülatör kullanarak ascidian Polycarpa mytiligera (Akabe Körfezi, Kızıl Deniz) örnekleme (A) ) Tom Shelizenger ve Yuval Yacobi tarafından; (B) (NW Akdeniz sünger Agelas oroides örneklemeVacuSIP cihazı kullanılarak 3 mm osculum genişliği, Deniz). Kullanılan renk kodu solunan su örnekleri için inhale ve kırmızı için sarı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Protokol bölümünde anlatılan VacuSIP tekniğinin 2. Genel Bakış Şekil. Laboratuvar çalışmaları sarı kutularda temsil edilir, mavi kutulara saha. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1. genel ortalama örnekleme oranları (ml dk -1) farklı konteynerler ile elde edilenSu koleksiyonları ve farklı vakum seviyeleri için kullanılan: şişeler (yok) vakumlu değildi; EPA cam şişe ve HDPE şişeler kendi hacminin (½ hacim) yarısını Karyolalar; steril plastik tüpler zaten üretici tarafından vakumlu bulundu. 5-8 m derinliğinde, 18-22 ° C su sıcaklığında çalışan 79 cm uzunluğunda ve 25 mikron iç çapa PEEK tüpleri kullanılarak.
Tablo 2. numune kabı, sabitleyici, in-line bir filtre tertibatının, depolama genel protokol bölümünde açıklanan analiz yöntemleri. Analiz bileşikler şunlardır: ultra-plankton bolluğu (plankton <10 mikron), silikat (SiO 4), fosfat (PO 4 3-), nitrit + nitrat (NO 2 - + NO 3 -), çözünmüş organik madde (DOM), amonyum (NH4 +) ve parçacık halinde organik madde(POM). Tüm örnekleme gemiler silikon septum kap ve örnekleme önce vakumlu. Fiksatif şunlardır: paraformaldehit + glutaraldehid (Glut + Parafor), ortofosforik asit (H3 PO 4) ve hidroklorik asit (HCI). kullanılan in-line filtre meclisleri vardır: polikarbonat filtre sahipleri ve polikarbonat membran 0.2 mikron filtre (PC filtre tutucu + PC membran) ve paslanmaz çelik filtre tutucular ve bağlayıcı içermeyen cam elyaf Gff filtreler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deniz suyu toplama yöntemleri optimizasyonu
Toplayıcı şişeleri ve temizlik prosedürü seçimi
VacuSIP uyumlu toplama hazneli numune bir şırınga iğnesi ile delinmesi ile başlatılabilir sağlayan bir septum olmalıdır. Onlar yüksek sualtı basıncı (derinlikleri çalışan tipik tüplü 2-3 bar) dayanıklı olmalıdır ve bir vakum tutmak gerekir. Birçok (hepsi değil markalar) uçucu organik maddelerin analizi için EPA tarafından onaylanan şişeleri bu kriterleri karşılar. DOC ve DON analizi için onaylanmış önceden temizlenmiş küçük şişeler de mevcuttur. toplama ve analiz besin ve temizlik prosedürlerini optimize etmek için bu şişeleri uygunluğunu test etmek için, yüksek kaliteli çift distile su asit temizlenmiş polipropilen tüpler (PP borular) toplanmıştır, yeni bir yer satınCID temizlenmiş yüksek yoğunluklu polietilen şişeler, (HDPE şişeler) ve EPA, cam şişeler içinde, tüm politetrafloroetilen (PFTE) bölmeli kapak ile donatılmıştır. Yukarıdaki bölüm 1.5.2 açıklandığı gibi HDPE şişeler ve polipropilen borular temizlenmiş ve EPA cam şişeler üretici tarafından temizlendi.
EPA cam şişe bulunan NH 4 + miktarı nispeten az oldu (≤ 0.1 mmol L-1) ve yüksek kaliteli çift distile su standart kalitesine bağlıdır. Bunun aksine, NH4 + konsantrasyonları belirgin bir şekilde (sırasıyla 3 ve 7 kat, kadar) artmış ve daha yüksek bir ANOVA F (asit temizliği polipropilen tüpleri içinde ve yüksek yoğunluklu polietilen şişelerde değişkenlik (5,53) = 7.183, p sergiledi < 0.001, Şekil 3). amonyum analizi silikon septum ile yüksek kaliteli çift distile su temas hiçbir etkisi yoktu.
Karşılaştırma temizlenmiş / geri dönüşümlü cam şişe karşı yeni bir cam şişeleri
EPA cam şişe kereden fazla besin analizi için yararlanılabilir olup olmadığını test etmek için, NO x - PO 4 3- NH, yeni EPA cam şişelere toplanan deniz suyu örneklerinde 4 + konsantrasyonlar EPA cam şişelere toplanan ile karşılaştırıldı. (1.5.2), yukarıda tarif edildiği gibi geri dönüştürülmüş cam viyaller temizlenmiş ise, yeni EPA cam şişe, üretici tarafından önceden temizlenmiş. Geri kazanılmış şişeler yeni bir cam şişelerde bulunan düzeyde katı 1.5 kadar önemli ölçüde daha yüksek NH4 + konsantrasyonuna sahip (t testi, p <0.001, n = 5). Anlamlı bir farklılık NO x bulundu - ve yeni cam toplanan geri dönüşümlü şişelerde toplanan örnekler ve numuneler arasında PO 4 3- içerikküçük şişeler (Şekil 4).
Silikat toplama ve depolama prosedürleri
silikat analizi için en iyi örnekleme kabı belirlemek için, yüksek kaliteli iki defa destillenmiş su olmayan temizlenmiş asit temizliği, yüksek yoğunluklu polietilen şişelerde, ve asit temizliği polipropilen tüplere (PP borular) 'de (HDPE şişeler) içinde toplanmış ve EPA, cam şişeler içinde. beklenen konsantrasyon sapma değerleri kontamine kabul edildi, böylece beklenen silikat konsantrasyonu, sıfıra yakın oldu. Silikat konsantrasyonu önemli ölçüde asit temizlenmiş HDPE şişelerde düşük SiO 4 konsantrasyonunu gösteren, farklı şişeleri (ANOVA, F (3,19) = 210,047, p <0.001) toplanan numuneler arasında farklılık göstermiştir. Borosilikat cam şişeler nihai SiO 4 konsantrasyon 7 umol kadar artarak birlikte, örnekleri kontamineL-1 (Şekil 5).
Çözülmüş organik madde (DOM) ve besin analiz için filtrasyon cihazının seçimi
Filtre cihazı çözünmüş organik (DOC ve DON) ve inorganik besin analizinde düşük boş üretir belirlemek için - paslanmaz çelik filtre tutucular polikarbonat karşılaştırılmıştır (NO x, NH 4 +, PO 4 3-), Swinney-line olarak filtre tutucular. Her filtre tutucusu türüyle biz polikarbonat membran ve ön yakılan cam elyaf filtre hem test etti. polikarbonat membran ile donatılmış polikarbonat Swinney filtre tutucu açıkça 9 kata kadar tarafından numuneleri kirlenmiş ise paslanmaz çelik filtre tutucu ve yanmış cam elyaf filtre kombinasyonu, düşük boşlukları sağladı. Yıkama hacimleri artan yaptım Bu sorunu (Şekil 6) çözmek değil.
Farklı şişeleri ile toplanan Şekil 3. Amonyum konsantrasyonu (umol L -1, ortalama ± SD): (1) Temizlenmemiş HDPE şişe; (2) Temizlenmiş HDPE şişe; (3) Temizlenmiş HDPE şişe + Parafilm; (4) EPA cam flakon; (5) EPA cam şişe + Parafilm; (6) PP tüp temizlenmelidir. Parafilm silikon septum su numuneleri kontamine olup olmadığını test etmek için yerleştirilmiştir. Her bir muamele için, yüksek kaliteli, çift damıtılmış su 9 numune analiz edilmiştir. Numuneler taze analiz edildi. Önemli farklılıklar dört örnekleme damarları (ANOVA, F (5,53) = 7.183, p <0.001, güç testi = 0.992) arasında bulunmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ve yeni (karanlıkta) toplanan ve geri dönüşümlü deniz suyu örneklerinin fosfat (PO 4 3-) konsantrasyonları (mmol L-1, ortalama ± SD) / temizlenir - (NH 4 +), nitrit + nitrat (NOx) Şekil 4. Amonyum (beyaz) EPA cam şişeler. Deniz suyu Deniz Bilimleri Enstitüsü Deneysel Aquaria Bölgesinde toplandı ve paslanmaz çelik filtre tutucu ve cam filtre ile süzüldü. Su numuneleri taze analiz edildi. Yıldız (*) farkın anlamlı olduğunu (t testi, p <0.001, n = 5, güç testi = 1) gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
.jpg "/>
Şekil 5. Silikat konsantrasyonu (umol L -1, ortalama ± SD) asit-temizlenmiş PP borular, PP borular, asit-temizlenmiş HDPE şişeleri, yeni EPA cam şişe: Yüksek kalitede çift distile su farklı şişelerde topladı. Önemli farklılıklar dört örnekleyici malzemeler arasında bulundu (ANOVA, F (3,19) = 210,047, p <0.001, güç testi = 1). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6. Farklı filtrasyon meclisleri etkisini incelemek ve nitrit + nitrat birimler yıkayın (NO x - ľmol L -1). NO x için Örnekleri - (SS f paslanmaz çelik deniz suyu örnekleri filtreleme elde edilmiştirilter tutucu) veya polikarbonat in-line bir polikarbonat membran (PC filtresi) ya da bir ön-yanmamış cam elyafı filtreler ya sahip Swinney filtre yuvası (PC filtre tutucusu). Bilgisayar filtreler için,% 5 HCI ve yüksek kaliteli çift damıtılmış su farklı hacimlerde (10, 30, 60, 90 ve 120 mi) filtre tertibatını yıkanması için kullanılmıştır, çamaşır hacmi, Şekil açıklamasında parantez içinde verilmiştir. Değerler olarak ortalama ± standart sapma olarak ifade edilmiştir (n = 5). Deniz suyu Deniz Bilimleri Enstitüsü Deneysel Aquaria Bölgesinde toplandı ve örnekler süzüldükten sonra taze analiz edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil deney sonuçlarının 7. Örnek: inhale (IN, siyahChondrosia Akdeniz'de reniformis sünger tarafından işlenen farklı maddelerin daire) ve (EX, kırmızı üçgen) eşleştirilmiş üfledi su numunesi konsantrasyonları (ľmol L -1): (A) amonyum (NH 4 +); (B) nitrit + nitrat (NOx -); (C), fosfat (PO4 3-); (D) Silikat (SiO 4); (E) çözünmüş organik karbon (DOC); Organik azot (DON) içinde eritildi (F) sağlanması; (G) planktonik organik karbon (LPOC); (H) planktonik organik azot (LPON). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 8. bir akış sitometride bir örneği,(A, B, C, D) fitoplankton popülasyonlarının;: inhale su çekilir eşleştirilmiş su örneklerinin Etry analizi (A, C, E, G) ve nefes verme (B, D, F, H) sünger ile Chondrosia reniformis (E, F, G, H) heterotrofik bakteri. AB ve EF örnekleme (tüm planktonik grupların etkin bir şekilde muhafaza edilmiş) temiz ve doğru oldu. CD ve GH tüm planktonik grupların düşük kaldırılmasını gösteren solunan su kirliliği örnekleridir. Syn:. Synechococcus sp, pico: ototrofik picoeukariotes, nano: ototrofik nanoeukaryotes,: yüksekten DNA içeriği ile heterotrofik bakteri, düşük. Düşük DNA içeriği ile heterotrofik bakteri bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Figuristiridye Chama pacifica farklı planktonik yırtıcı e 1. Hücre tutma verimliliği: Prochlorococcus sp. (Pro), Synechococcus sp. (Syn), piko-ökaryotlar (Pico Euk), nano-ökaryotlar (Nano Euk). Hata çubukları =% 95 CI. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Ek video 1. Örnekleme solunan su numuneleri için inhale için yeşil ve sarı kullanılan renk kodu ile özel bir dahili manipülatör kullanarak ascidian Polycarpa mytiligera. Örnekleme borular (PEEK, ID 54 um, 75 cm uzunluğunda) dikkatli ascidian arasında exhalant ve uçucu sifonlar yerleştirilir. Su daha bir oranda tahliye tüplere çekilir ~ 1 ml dk-1. Bu gösteriye floresein boya exhalant jet görselleştirmek için kullanılır. exhalant örnekleme borusu de Wi yerleştirilir unutmayınince exhalant jet. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hazırlık adımlar
DOM ve besin analizi için kolektör şişeler
Toplayıcı damarlar çözünmüş mikro bileşenleri ile etkileşime girebilir ve örnekleyici duvarları büyüme 30-34, DOM ve besin koleksiyonu için farklı şişeler test edildi bakteriler için bir substrat olabilir beri. Numuneler hızla 30 donmuş değilse cam şişe kadar iki kat silika ilk konsantrasyonunu artırabilir çünkü Borosilikat, silis miktarının 33,35 için tavsiye edilmez. Bizim sonuçlarımız, önceden temizlenmiş EPA şişeleri kullanarak en önemlisi amonyum için, DOC, DON ve inorganik besin düşük konsantrasyon boşlukları neden olduğunu göstermektedir.
DOC filtrasyon ve depolama
Filtrasyon pek çok durumda, gerekli ve deniz kimyada ilk analitik adımdır vemikrobiyoloji. Bu laboratuarda toplandıktan sonra numuneleri filtre mümkün olsa da, bu prosedür örnekleri uzakta uygun laboratuar olanaklarından genellikle uzak yerlerde, saatler ya da günler içinde, sualtı toplanır yerinde çalışmaları için tavsiye edilmez. In situ süzülerek in-line kullanımı numune muhafazası en aza indirir ve bu nedenle kirlenme riskini azaltır. Yerinde filtrasyon ayrıca bakteri çoğunu çıkarır ve örnek bileşim, uzun süreli numune alma ve taşıma sırasında bakteriyel metabolizma tarafından değiştirilebilir riskini azaltır zaman. filtrasyon düzeneği örnekleme cihazının ölü hacmini artırır ve aynı zamanda kirlilik kaynağı olabilir. Mümkün olan en küçük filtre sahiplerinin bir seçim (örneğin, in-line Swinney filtre tutucu 13 mm) ve dakika PEEK boru (örneğin, 254 mikron ID) ölü hacim ve çevre su ile kontaminasyon riskini azaltır.
Uygun filtre değilsekullanılan ya da özenle yıkanıp değilse, su örneklerinin eserler ve kirlenme 32,36-39 meydana gelme olasılığı. DOC analizi Çalışmalar iyice yüksek kaliteli çift distile su 38 ile boşaltılan olmadığında organik bileşiklerin (polikarbonat ve PFA-PTFE) yapılmış filtre ve filtre sahipleri, özellikle şiddetli DOC kontaminasyon 32,37 neden olabileceğini gösterdi. Mevcut protokol ve sonuçları bu kurallara uymak ve aynı zamanda polikarbonat filtre tutucular kaçınılması gerektiğini göstermektedir.
Yerinde iş ve interoperation içinde
VacuSIP sistemi kendi doğal ortamında rahatsız süspansiyon besleyiciler metabolizma ve sistemdeki ekolojik rolleri miktarının çalışma kolaylaştıran doğrudan örnekleme tekniğidir. tecrübeli ve donanımlı dalgıçlar için VacuSIP yönteminin uygulanması basit ve sadece kısa tr gerektirirTahliye. INEX VacuSIP deneyleri bu nedenle yüksek boşluklar dahil olmak üzere çoğu analitik eserler için kontrol bir 'within' tasarım istatistiksel analiz (yani, eşleştirilmiş veya tekrarlanan önlem analizi) için tasarlanmıştır. Kontrollü emiş kullanımı, böylece ortam su ile ekzale su kazara kontaminasyonu engelleyerek, yavaş ve ayarlanabilir örnekleme oranları sağlamaktadır. Mümkün olan yerlerde, düşük akım ve düşük bulanıklık ile çalışma alanlarının seçimi tavsiye edilir ve daha temiz ve daha doğru sonuçlar sağlayacaktır. Uzun süreli örnekleme süresi (saat dakika) bentik sınır tabakası karakterize yüksek patchiness entegrasyonunu sağlar. Tüm bu özellikler düzgün uygulandığında VacuSIP yöntemi çoğaltır az sayıda çalışırken bile güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar veren, son derece sağlam olduğundan emin olun. Akdeniz sünger ve Hint-Pasifik istiridye türlerinden elde edilen tipik sonuçların bir örneği Şekil 7 ve Supplemen gösterilmektedirtary Şekil 1.
herhangi bir teknik olduğu gibi, VacuSIP potansiyel tuzaklar ücretsiz değil. En yaygın sorun, ortam su ile solunan su numunesinin kirliliğidir. Bu eserler nedenleri yüksek emiş oranı, tüp yerinden oynamalar ve hayvan davranışı içerir. Doğru örnekleme oranının doğru seçimi excurrent akış hızının önceden tahminleri bağlıdır. Bu tür tahminler boya ön hız yöntemi 16 kullanılarak elde edilebilir. İdeal olarak, emme hızı pompa hızının (örneğin, 1 mi dak-1 6 L saat -1 hızı pompa) 1% altında tutulmalıdır. Ortam su ile kirlenmesini önlemek için, örnekleme hızı pompa hızının% 10'undan fazla olmamalıdır.
örnekleme hızı kontrol etmek için, emme boru uzunluğunun ve iç çapı, planlanan çalışma derinliği ve su sıcaklığına göre ayarlanmalıdır. Hagen-Poiseuille denklemi (bakınız bölüm 1.3.1 üzeri) bir kılavuz olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, bu denklem örnekleme zamanı ile bir birinci Ap yana sırası uyumu ve örnekleme oranı azalma olarak kabul edilir ve in-line filtrasyon belirsizlikler ekler edilmelidir. tahliye kapların kullanılması, bazen bilinmeyen vakum basınçları ile, ileri komplikasyonları tanıtır. Örnekleme oranları farklı vakum farklı tahliye kaplar bir fonksiyonu olarak değiştiği bir örneği, Tablo 1 'de gösterilmiştir.
örnekleme oranını düşürerek kolayca bu azalma teknik sınırlamalar tüp uzunluğu ve kimliğini ayarlayarak elde edilir (saatte kaç mikrolitre örnekleme oranları mümkün olan). Bununla birlikte, denemecileri yavaş pompalama oranı ile hayvanlar için bu sınırlama ile ve küçük organizmalar veya örnekler için dikte yavaş örnekleme oranı farkında olmalıdır. Yavaş örnekleme hızının hemen sonuç, bir tek numune Sessi sırasında toplanan suyun sınırlı hacmiüzerinde. Bu düşük hacimli bu numuneler ile çalıştırılabilir analiz ve çoğaltır sayısını sınırlamak olacak ve böylece aynı zamanda bu nüfus elde edilebilir bilgiler sınırlayacaktır.
Tüp değiştirmesi kolaylıkla lekeli olabilir ve örnekleme iptal veya yeniden, bir dalgıç sabit nöbet tutan şartıyla yapılabilir. Buna karşılık, örnekleme sırasında pompalama bırakma her zaman tespit etmek kolay değildir. Bu doğru değil sadece sünger, aynı zamanda gömlekliler, kabuklular ve polychaetesi için. Aslında, yaygın inanışın aksine, bir ascidian veya çift kabuklu pompalama durdu hangi olaylar sifon geometri (Yahel, yayınlanmamış veri) görünür hiçbir değişiklik ile belgelenmiştir. Ayrıca, bazı durumlarda, gömlekliler hiçbir örgü salgılanması ile aktif pompalama (yani, hiçbir filtreleme gerçekleşiyor olduğu) koruyabilirsiniz.
örnekleme oranını kontrol çok önemlidir. Bu bağlamda VacuSIP deney hayvanları, relativ, özellikle de diğer yöntemlere göre daha daely küçük ya da onlar yavaş yavaş pompa zaman. Enjektörler 2 kontrol etmek oldukça zordur. NO 3 - - NH Örneğin, Perea-Blázquez ve arkadaşları (2012a) 40 NO 2 (birkaç ılıman sünger türlerinin tarafından üfledi suyu örnek bir şırınga kullanılır ve şaşırtıcı belirli besinlerin yenmesi / atılımının genel bir model bulamadık 4 + PO 4 3-, SiO 4). açık bir deseni olmaması olasılığı nedeniyle Şırıngayı kullanmak için, ortam su ile dışarı verilen örneklerin kirlenmesi bir sonucudur. Heterotrofik bakteri 40 ± 14 ve% Synechococcus sp 54 ±% 18: Kirlilik kendi sünger Perea-Blázquez ve arkadaşları (2012b) 41 tarafından bildirilen pico plankton son derece düşük tutma verimliliği bellidir. Karşılaştırma için, VacuSIP, Mueller diğ. (2014) 21 heterotrofik bakteri giderme verimini bildirdiSiphonodictyon sp 72 ± 15%. ve Cliona delitrix 87 ±% 10.
Örnek kalitesinden emin ve ortam su hiçbir kirlenme meydana emin olmak için, şiddetle ilk flow sitometri kullanılarak pico ve nano plankton örnekleri analiz etmek önerilir. Bu, hızlı, güvenilir ve ucuz analiz numunesi kalitesinin derhal bilgi verecektir. Böyle Synechococcus sp gibi bazı av takson için çok yaygındır. sünger ascidian% 90 verim 14,42 yakın en temizlenmelidir. Bu kriter anlamlı sapmalar kirlenme (Şekil 8) meydana gelmiş olabileceğini düşündürmektedir.
güvenilir ve temiz numune alma, emin deney tasarımı tatmin yedi basit kurallar yapın: (1) (oran tahminleri pompalama dahil) bir ön anket yapmak ve iyi işyerini hazırlamak; (2) çalışılan hayvanlar biliyorum; (3) çalışılan örnek iyi tanımlanmış excurrent diyafram a sahip olduğunu doğrulamaknd ulaşabileceğiniz bir konuma; (4) çalışılan örnek önce ve her bir örnek toplandıktan sonra pompalıyor emin olun; (5) hafifçe excurrent açıklığı (Şekil 1) içinde solunan suyun toplanması için tüp yerleştirmek; (6) kullanmak örnekleme hızı <excurrent akış hızının% 10,% 1 şiddetle tavsiye edilir; (7) bir kalite kriteri tanımlamak ve şüpheli INEX çiftleri ihmal.
Bu basit kuralları ardından, VacuSIP sistemi nasıl aktif süspansiyon besleyiciler süreç partikül ölçüm pratik ve güvenilir bir yöntem ve çevresinde farklı ekosistemlerde filtre besleyiciler fonksiyonel rolünü değerlendirmek için kullanılabilecek doğru ve karşılaştırılabilir tahminler sağlayan doğal şartlarda, içinde çözünmüş bileşikler sunmaktadır Dünya.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz saha içinde yaptığı yardım için Manel Bolivar teşekkür ederiz. Biz araştırma ve örnekleme izinleri verdikleri destekten dolayı "Parc Natural del Montgri les Illes Medler i el Baix Ter" minnettarız. sualtı manipülatör Ayelet Dadon-Pilosof tarafından tasarlanan ve Sn Pilosof tarafından imal edilmiştir. Bu eser İspanyol Hükümeti projesi CSI-Mercan [RC ve MR hibe numarası CGL2013-43106-R] tarafından ve TM "Ministerio de Educación, Kültür y Deporte (• MECD)" bir FPU burs ile desteklenmiştir. Bu G. Yahel için Katalan Hükümeti [hibe sayısı 2014SGR1029] ve ISF hibe 1280-1213 ve BSF hibe 2012089 tarafından finanse edilen bir Deniz Biyojeokimya katkısı ve Küresel Değişim Araştırma grubudur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
| Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
| Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10 pk |
| Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
| Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
| Peek Tubing (254 µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used. |
| Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
| (TOC) EPA Vials | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09). |
| HDPE Vials | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
| Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
| Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
| Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
| Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42). |
| In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13 mm of diameter |
| PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
| TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13 mm of diameter |
| Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13 mm of diameter, pore size 0.2 µm |
| Contrad 70 Solution | Decon Labs | 1002 | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
| Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25 mm of diameter , pore size 0.2 µm |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100 g |
| Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
| Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7 mm x 30 mm |
| Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2 ml |
| Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml |
| Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1% | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500 g |
| Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
| Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump |
References
- Gili, J. M., Coma, R. Benthic suspension feeders: their paramount role in littoral marine food webs. Trends. Ecol. Evol. 13 (8), 316-321 (1998).
- Reiswig, H. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Bio. 9, 38-50 (1971).
- McMurray, S., Pawlik, J., Finelli, C. Trait-mediated ecosystem impacts: how morphology and size affect pumping rates of the Caribbean giant barrel sponge. Aquat. Bio. 23 (1), 1-13 (2014).
- Pile, A. J., Young, C. M. The natural diet of a hexactinellid sponge: benthic-pelagic coupling in a deep-sea microbial food web. Deep-Sea Res. Pt. I. 53 (7), 1148-1156 (2006).
- Nielsen, T., Maar, M. Effects of a blue mussel Mytilus edulis bed on vertical distribution and composition of the pelagic food web. Mar. Ecol. Prog. Ser. 339, 185-198 (2007).
- De Goeij, J. M., et al. Surviving in a marine desert: the sponge loop retains resources within coral reefs. Science. 342, 108-110 (2013).
- Maldonado, M., Ribes, M., van Duyl, F. C. Nutrient Fluxes Through Sponges. Biology, Budgets, and Ecological Implications. Advances in Marine Biology. 62, (2012).
- Riisgård, H. U. On measurement of filtration rates in bivalves - the stony road to reliable data: review and interpretation. Mar. Ecol. Prog. Ser. 211, 275-291 (2001).
- Reiswig, H. M. Water transport, respiration and energetics of three tropical marine sponges. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 14, 231-249 (1974).
- Jiménez, E., Ribes, M. Sponges as a source of dissolved inorganic nitrogen: nitrification mediated by temperate sponges. Limnol. Oceanogr. 52 (3), 948-958 (2007).
- Diaz, M. C., Ward, B. Sponge-mediated nitrification in tropical benthic communities. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156, 97-107 (1997).
- Ribes, M., Coma, R., Gili, J. Natural diet and grazing rate of the temperate sponge Dysidea avara (Demospongiae, Dendroceratida) throughout an annual cycle. Mar. Ecol. Prog. Ser. 176, 179-190 (1999).
- Jiménez, E. Nutrient fluxes in marine sponges: methodology, geographical variability and the role of associated microorganisms. , Universitat Politècnica de Catalunya. Barcelona. PhD thesis (2011).
- Reiswig, H. M. Particle feeding in natural populations of three marine demosponges. Biol. Bull. 141 (3), 568-591 (1971).
- Reiswig, H. M. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Biol. 9 (1), 38-50 (1971).
- Yahel, G., Marie, D., Genin, A. InEx - a direct in situ method to measure filtration rates, nutrition, and metabolism of active suspension feeders. Limnol. Oceanogr-meth. 3, 46-58 (2005).
- Genin, A., Monismith, S. S. G., Reidenbach, M. A., Yahel, G., Koseff, J. R. Intense benthic grazing of phytoplankton in a coral reef. Limnol. Oceanogr. 54 (2), 938-951 (2009).
- Yahel, G., Whitney, F., Reiswig, H. M., Leys, S. P. In situ feeding and metabolism of glass sponges (Hexactinellida , Porifera) studied in a deep temperate fjord with a remotely operated submersible. Limnol. Oceanogr. 52 (1), 428-440 (2007).
- Wright, S. H., Stephens, G. C. Removal of amino acid during a single passage of water across the gill of marine mussels. J. Exp. Zool. 205, 337-352 (1978).
- Møhlenberg, F., Riisgård, H. U. Efficiency of particle retention in 13 species of suspension feeding bivalves. Ophelia. 17 (2), 239-246 (1978).
- Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9 (2), e90152 (2014).
- Gasol, J. M., Moran, X. A. G. Effects of filtration on bacterial activity and picoplankton community structure as assessed by flow cytometry. Aquat. Microb. Ecol. 16 (3), 251-264 (1999).
- Koroleff, F. Determination of reactive silicate. New Baltic Manual, Cooperative Research Report Series A. 29, 87-90 (1972).
- Murphy, J., Riley, J. P. A. Modified single solution method for the determination of phosphate in in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Shin, M. B. Colorimetric method for determination of nitrite. Ind.Eng.Chem. 13 (1), 33-35 (1941).
- Wood, E. D., Armstrong, F. A. J., Richards, F. A. Determination of nitrate in sea water by cadmium-copper reduction to nitrite. J. Mar. Biol. Assoc. U. K. 47 (1), 23-31 (1967).
- Sharp, J. H., et al. A preliminary methods comparison for measurement of dissolved organic nitrogen in seawater. Mar. Chem. 78 (4), 171-184 (2002).
- Sharp, J. H. Marine dissolved organic carbon: Are the older values correct. Mar. Chem. 56 (3-4), 265-277 (1997).
- Holmes, R. M., Aminot, A., Kerouel, R., Hooker, B. A., Peterson, B. J. A simple and precise method for measuring ammonium in marine and freshwater ecosystems. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 56 (10), 1801-1808 (1999).
- Degobbis, D. On the storage of seawater samples for ammonia determination. Limnol. Oceanogr. 18 (1), 146-150 (1973).
- Tupas, L. M., Popp, B. N., Karl, D. M. Dissolved organic carbon in oligotrophic waters: experiments on sample preservation, storage and analysis. Mar. Chem. 45, 207-216 (1994).
- Yoro, S. C., Panagiotopoulos, C., Sempéré, R. Dissolved organic carbon contamination induced by filters and storage bottles. Water Res. 33 (8), 1956-1959 (1999).
- Zhang, J. Z., Fischer, C. J., Ortner, P. B. Laboratory glassware as a contaminant in silicate analysis of natural water samples. Water Res. 33 (12), 2879-2883 (1999).
- Yoshimura, T. Appropriate bottles for storing seawater samples for dissolved organic phosphorus (DOP) analysis: a step toward the development of DOP reference materials. Limnol. Oceanogr-meth. 11 (4), 239-246 (2013).
- Strickland, J. D. H., Parsons, T. R. A practical handbook of seawater analysis. , Fisheries Research Board of Canada. Ottawa. (1968).
- Eaton, A. D., Grant, V. Freshwater sorption of ammonium by glass frits and filters: implications for analyses of brackish and freshwater. Limnol. Oceanogr. 24 (2), 397-399 (1979).
- Norrman, B. Filtration of water samples for DOC studies. Mar. Chem. 41 (1-3), 239-242 (1993).
- Carlson, C. A., Ducklow, H. W. Growth of bacterioplankton and consumption of dissolved organic carbon in the Sargasso Sea. Aquat. Microb. Ecol. 10 (1), 69-85 (1996).
- Grasshoff, K., Ehrhardt, M., Kremling, K. Methods of Seawater Analysis. Second, Revised and Extended Edition. , (1999).
- Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Nutrient utilisation by shallow water temperate sponges in New Zealand. Hydrobiologia. 687 (1), 237-250 (2012).
- Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Estimates of particulate organic carbon flowing from the pelagic environment to the benthos through sponge assemblages. PLoS ONE. 7 (1), e29569 (2012).
- Pile, A. J., Patterson, M. R., Witman, J. D. In situ grazing on plankton <10 µm by the boreal sponge Mycale lingua. Mar. Ecol. Prog. Ser. 141, 95-102 (1996).
