Monozyten sind integrale Bestandteile des menschlichen angeborenen Immunsystems, die auf den glykolytischen Stoffwechsel angewiesen sind, wenn sie aktiviert werden. Wir beschreiben ein durchflusszytometrisches Protokoll zur Messung der Glukosetransporterexpression und der Glukoseaufnahme durch Gesamtmonozyten und Monozyten-Subpopulationen in frischem Vollblut.
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Methodenartikel
Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Monozyten sind angeborene Immunzellen, die mit bestimmten chronischen entzündlichen Erkrankungen durch Pathogene und Entzündung aktiviert werden kann. Die Aktivierung von Monozyten induziert Effektorfunktionen und eine damit einhergehende Verlagerung von oxidativem zu glycolytic Stoffwechsel, die durch eine erhöhte Glukosetransporter-Expression begleitet wird. Diese erhöhte Glykolyse-Stoffwechsel ist auch für geübte Immunität von Monozyten, eine Form der angeborenen immunologischen Gedächtnisses beobachtet. Obwohl in vitro - Protokolle Glukosetransporters - Expression und die Glucoseaufnahme durch Monozyten untersucht wurden beschrieben, keines hat durch Mehr parametrischer Durchflusszytometrie in Vollblut untersucht. Wir beschreiben eine Multi-Parameter durchflusszytometrischen Protokoll für die Messung von fluoreszierender Glucoseanalog 2-NBDG Aufnahme in Vollblut durch Total Monozyten und der klassischen (CD14 ++ CD16 -), intermediäre (CD14 ++ CD16 +) und nicht-klassischen ( CD14 + CD16 ++) monocyteSubpopulationen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Glukosetransporter-Expression und die Glukoseaufnahme für insgesamt Monozyten und Monozytensubpopulationen während Homöostase und entzündliche Erkrankungen zu untersuchen, und kann leicht die Glukoseaufnahme modifiziert werden Subpopulationen für andere Leukozyten und Leukozyten im Blut zu untersuchen.
Einleitung
Monozyten sind ein wichtiger Bestandteil der menschlichen angeborenen Immunsystems , die 1 bis Stellen der Infektion und Entzündung schnell mobilisiert werden. Aktivierung von Monozyten ist entscheidend für die Begrenzung akuten Schädigung durch Pathogene und auch von zentraler Bedeutung für die Pathogenese von verschiedenen chronischen Erkrankungen, einschließlich Atherosklerose 2, Krebs 3 und HIV 4,5.
Der Stoffwechsel von ruhenden und aktivierten Monozyten unterscheidet sich dramatisch, mit ruhenden Monozyten oxidativen Stoffwechsel zu nutzen und aktivierten Monozyten unter Verwendung von glyk....
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Protokoll
HINWEIS: HIV-infizierten und nicht infizierten HIV-Themen aus der Infectious Diseases Einheit am Alfred Hospital in Melbourne, VIC, Australien und von der örtlichen Gemeinde rekrutiert wurden, beziehungsweise. Eine Einverständniserklärung wurde von allen Teilnehmern erhalten, und die Forschung wurde von der Alfred Hospital Research und Ethikkommission genehmigt.
1. Glut1 Zelloberflächenerkennung auf Monozyten und Monozytensubpopulationen
- Sammeln Sie Blut in Citrat ACD-B Antikoagulans Rohre und beginnen, die Experimente in einem biologischen Sicherheitsschrank innerhalb 1 Stunde der Sammlung.
- 100 l Blut in Polypropylen....
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Ergebnisse
Vergütung ist für das individuelle Fluorochrome durchgeführt werden Fluoreszenzstreuung zu verhindern. Monozyten werden zunächst durch Gating basierend auf Vorwärts- und Seitenstreu angereichert. Die Grundstücke präsentiert sind Vertreter auf Vollblut durchgeführt mindestens sechs unabhängigen Experimenten von sechs oder mehr Teilnehmer als zuvor 10 berichtet 1A die anfängliche Gating von Monozyten durch Zellstreuung und den Ausschluss von T - Zellen durch Gat.......
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Diskussion
Das hier beschriebene Protokoll Details, ein einfaches Verfahren Glukosetransporter-Expression und fluoreszierende Glukose analoge Aufnahme durch Monozyten und Monozytensubpopulationen im Vollblut zu untersuchen. Durch die Bewertung 2-NBDG Aufnahme in Vollblut, erlaubt diese Technik für die Bedingungen ähnlich denen in vivo. In einer früheren Studie untersuchten 6-NBDG Aufnahme in Monozyten aus dem Vollblut durch Dichtezentrifugation 17 getrennt. Allerdings hat diese Studie nicht Monozytensubpopulati.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Forschung wurde von der australischen Zentrum für HIV und Hepatitis Virologie Forschung (ACH 2) und ein 2010 Entwicklungsbeihilfe (CNIHR) von der University of Washington Zentrum für AIDS - Forschung (CFAR), ein NIH finanzierte Programm unter Verleihungsnummer AI027757 finanziert , die unterstützt wird durch die folgende NIH Institute und Zentren (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP ist ein Empfänger der CNIHR und ACH 2 Zuschuss. SMC ist ein Empfänger einer National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) Hauptforschungsstipendium. Die Autoren danken den Beitrag zu dieser Arbeit der viktorianischen operative In....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| VACUETT Röhrchen 9 ml ACD-B Antikoagulanzienröhrchen | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile Polypropylenröhrchen | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin aus Rinderserum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16%ige Formaldehydlösung | Elektronenmikroskopie Science | 15710 | |
| BD FACS Lyselösung (10x) | BD Biosciences | 349202 | BD FACS Lyselösung 1/10 mit deionisiertem Wasser verdünnen, um die Arbeitskonzentration zu erhalten (bis zu 1 Woche bei 4 & Grad; C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & ; D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life Technologies | N13195 | Suspendieren Sie 5 mg 2-NBDG in 1 ml deionisiertes Wasser, um eine 14,60 mM Stammlösung herzustellen (bis zu 6 Monate bei 4 μm; C). Um die Arbeitskonzentration von 2-NBDG zu erreichen, verdünnen Sie das Material 1/100 mit 1x DPBS. Mit Folie abdecken. (bis zu 1 Woche bei 4 Grad lagern; C) |
| Dulbecco" s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x) | Life technologies | 14190-144 | Zur Herstellung einer Waschlösung 0,5 g BSA pro 100 ml DPBS zugeben (bis zu 2 Wochen bei 4 & Grad; C) |
Referenzen
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
- Richards, D. M., Hettinger, J., ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
