本论文的目的是介绍一种用于测定人血液样本中单核细胞和粒细胞吞噬作用及氧化爆发活性的方法。
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摘要
摘要
粒细胞和单核细胞的吞噬作用及氧化爆发（OB）活性检测可用于研究先天免疫系统。本文提供了将该检测方法纳入运动免疫学研究工具所需的方法学。该检测的第一步是制备两份全血（肝素抗凝）样品（分别标记为“H”和“F”）。然后向H份样品中加入二氢乙啶，将两份样品均在温水浴中孵育，随后转移至冷水浴。接下来，向H份样品中加入金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus），向F份样品中加入异硫氰酸荧光素标记的S. aureus（细菌：吞噬细胞 = 8:1），两份样品再次在温水浴中孵育后转移至冷水浴。随后，向每份样品中加入台盼蓝以淬灭胞外荧光，细胞用磷酸盐缓冲液洗涤。接着裂解红细胞，并固定白细胞。最后，使用流式细胞仪及相应的分析软件检测粒细胞和单核细胞的吞噬作用及OB活性。该检测方法已应用超过20年。在经历剧烈且长时间的运动后，运动员的吞噬作用会出现显著但短暂的升高，而OB活性则出现持续性下降。运动后吞噬作用的升高与炎症反应相关。与正常体重个体相比，超重和肥胖个体的粒细胞和单核细胞吞噬作用长期处于升高状态，且与C反应蛋白呈轻度相关。综上所述，这一基于流式细胞术的检测方法可评估吞噬细胞的吞噬作用和OB活性，可作为运动和肥胖诱导炎症的附加评估指标。
引言
粒细胞和单核细胞的吞噬作用/氧化爆发（OB）活性检测是一种简单直接的技术，常用于获取长时间高强度运动后先天免疫功能的相关信息。1-4 在研究免疫系统对刺激的反应时，粒细胞和单核细胞尤为值得关注，因为它们在宿主防御中起核心作用，并且是最早在感染部位聚集的免疫细胞。5 中性粒细胞作为粒细胞的一种，是在高强度运动后最先迁移至受损肌肉组织的细胞。6 吞噬作用和氧化爆发活性是评估粒细胞和单核细胞功能最常用的指标7，由于其在感染过程和修复过程中均发挥关键作用，因此被优先选作先天免疫细胞功能的指示参数。
本论文所述的方法利用基础流式细胞仪，对全血中粒细胞和单核细胞的吞噬作用及氧化爆发（OB）活性进行定量测定。该技术采用全血具有优势，因为它无需耗时的细胞纯化步骤即可完成检测。本方法可轻松调整，以适应多种研究设计和实验室条件。例如，Liao et al. 采用类似技术发现，创伤性脑损伤后中性粒细胞的OB活性升高，而吞噬功能下降。8 另一个例子中，McFarlin et al. 报道了对该技术的一项精巧改进，即使用别藻蓝蛋白（APC）偶联的CD66b抗体以及高性能APC串联偶联的CD45抗体，并结合基于成像的流式细胞术，对粒细胞的吞噬活性和OB活性进行分类分析。7,9
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方案
注意：所有血液采集程序均遵循阿巴拉契亚州立大学（ASU）机构审查委员会（IRB）制定的指南进行。
1. 检测准备
- 收集、准备并整理该实验步骤所需的材料（详见特定材料/设备列表）。
- 标记12 x 75 mm试管。
- 为每位参与者标记两支试管：一支用于吞噬作用检测（用黑色墨水标记该试管并标注“F”） "F" 用于异硫氰酸荧光素 [FITC]）以及一个用于氧化爆发（OB）活性检测的试管（用红色墨水标记该试管并标注 "H" 用于二氢乙啶 [HE]。
注意：建议使用无菌的12 x 75 mm试管，以尽量减少非预期的细胞活化及相关背景信号的升高。 - 为实验对照标记三支试管：一支用于吞噬作用检测（FITC对照：用黑色墨水标记该试管并标注 "F"），一管用于氧化爆发（OB）活性检测（HE对照：用红墨水标记此管并标注 "H"），以及一管用于阴性对照（仅血液：用绿色墨水标记该管） "仅血液").
- 为每位参与者标记两支试管：一支用于吞噬作用检测（用黑色墨水标记该试管并标注“F”） "F" 用于异硫氰酸荧光素 [FITC]）以及一个用于氧化爆发（OB）活性检测的试管（用红色墨水标记该试管并标注 "H" 用于二氢乙啶 [HE]。
- 至少在实验前一天配制储备液。
- 制备无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。将100 ml的10倍浓缩PBS与900 ml的18.2 MΩ·cm超纯水混合稀释。Ω H2O. 使用0.2 μm滤器过滤除菌 ....
- 标记12 x 75 mm试管。
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结果
长时间且高强度的运动对先天免疫功能具有显著影响，包括自然杀伤细胞功能、巨噬细胞通过细胞因子介导的抗病毒感染反应，以及粒细胞和单核细胞的吞噬作用和氧化爆发（OB）活性。多项研究表明，运动后粒细胞和单核细胞的吞噬作用显著增强，反映出由肌肉损伤和代谢需求所引发的炎症反应。相反，运动后粒细胞和单核细胞的OB活性下降，这可能是感染易感性增加的一个免疫学指标。例如，图1显示，在完成75公里自行车骑行（70% VO2MAX）后，粒细胞对S. aureus的吞噬作用立即升高，并在1.5小时后仍保持升高，至次日早晨恢复至正常水平。单核细胞的吞噬作用也受到类似程度运动的相似影响。图2显示，粒细胞的OB活性在75公里骑行后至少持续降低21小时。单核细胞的OB活性在75公里骑行后同样下降。
粒细胞和单核细胞对S. aureus的吞噬作用与全身性炎症生物.......
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讨论
本论文提供了一种测定粒细胞和单核细胞功能两项指标的逐步操作方案。我们已确定该实验成功所必需的若干关键步骤。其中一个关键步骤是在添加细菌前立即进行冰浴孵育。充分冷却所有样品可最大限度地减少温度对吞噬作用和氧化爆发（OB）活性的影响。另一个关键步骤是向每个样品中加入细菌。采用8:1的细菌：吞噬细胞比例可获得最佳结果；但其他研究人员可能会发现需要调整此比例以获得理想结果。另一个关键步骤是使用红细胞裂解液和白细胞固定液来裂解红细胞并固定白细胞。使用此类试剂可确保红细胞完全裂解，并使研究人员能够将处理后的样品安全地在4 °C下过夜保存，然后于次日进行流式细胞术检测。此前的未发表研究结果表明，使用红细胞裂解和白细胞固定方法可将固定样品的流式细胞术检测延迟长达12小时，而不会影响数据的完整性。
该实验方案可根据研究者的能力和兴趣进行灵活调整，但需要强调的是，任何修改均需进行必要的优化。已有报道中一些最常见的调整包括目标细菌、标记物/探针以及孵育时间。研究者在调整这些参数时已获得了优异的结果。 大肠杆菌7,8 代替 S. aureus 作为.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 Zack Shue、Casey John 和 Lynn Cialdella-Kam 在本实验方案优化过程中提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12 x 75 mm 带盖试管 | VWR | 20170-579 | 每个样本需要 2 支试管（“H”和“F”），每批次额外需要 3 支试管（用于检测对照；“F”、“H”和“仅血液”）。 |
| PBS（10 倍浓度），pH 7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| 瓶顶式 0.2 µm 醋酸纤维素滤器（500 ml 容量） | Fisher Scientific | 09-741-07 | |
| 葡萄糖，粉末 | Life Technologies | 15023-021 | |
| 柠檬酸（无水，经细胞培养测试，植物细胞培养测试） | Sigma-Aldrich | C2404-100G | |
| 三水合柠檬酸钠二水合物 | Sigma-Aldrich | S4641-25G | |
| 二氢乙啶（氢乙啶）（HE） | Life Technologies | D11347 | |
| 无水二甲基亚砜（DMSO） | Life Technologies | D12345 | |
| 金黄色葡萄球菌 （不含蛋白 A 的 Wood 菌株）BioParticles，荧光素偶联物（FITC） | Life Technologies | S2851 | |
| 金黄色葡萄球菌 （不含蛋白 A 的 Wood 菌株）BioParticles，未标记 | Life Technologies | S-2859 | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Life Technologies | 15250-061 | |
| 4.0 ml 真空采血管，含 7.2 mg 喷雾干燥 K2EDTA | VWR | BD367861 | 每个样本需要 1 支 K2EDTA 血液采集管。 |
| 4.0 ml 真空采血管，内壁喷雾涂覆含 68 USP 单位锂肝素 | VWR | BD367884 | 每个样本需要 1 支锂肝素血液采集管。 |
| COULTER Ac·T 5diff CP | Beckman Coulter | 6605705 | 即，血细胞分析仪 |
| COULTER Ac·T 5diff Rinse | Beckman Coulter | 8547167 | |
| COULTER Ac·T 5diff Fix | Beckman Coulter | 8547171 | |
| COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse | Beckman Coulter | 8547170 | |
| COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse | Beckman Coulter | 8547168 | |
| COULTER Ac·T 5diff Cal 校准品 | Beckman Coulter | 7547175 | |
| COULTER Ac·T 5diff Control Plus | Beckman Coulter | 7547198 | |
| AcT 5diff 稀释液 | Beckman Coulter | 8547169 | |
| 200 µl 加长型移液器吸头 | VWR | 37001-526 | |
| 隔热冰盘 | VWR | 89198-980 | 用于冰水浴。 |
| 开放式金属试管架 | VWR | 60916-702 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 26140-111 | |
| TQ-Prep 工作站 | Beckman Coulter | 6605429 | 即，自动化细胞裂解制备工作站 |
| ImmunoPrep 试剂系统 | Beckman Coulter | 7546999 | 即，红细胞裂解/白细胞固定试剂系统 |
| Cytomics FC500 MCL 流式细胞仪系统，配备 CXP 软件 | Beckman Coulter | 626553 | |
| IsoFlow 包围液 | Beckman Coulter | 8547008 | |
| COULTER CLENZ | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Flow-Check 荧光微球 | Beckman Coulter | 6605359 | 即，用于校准和流路验证的荧光微球 |
| FlowJo 软件 | FlowJo | FlowJo | 即，流式细胞术分析软件 |
| Excel 软件 | Microsoft | Microsoft Excel | 即，电子表格程序 |
参考文献
- Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725(2014).
- Knab, A. M., et al.
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