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방법 논문

쥐 뇌 혈관 벽의 맞은 편에 FITC로드 Ferritins의 생체 외 투과 년 : 모델 Nanoformulated 분자의 배달을 공부하기

7.5K 조회수

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DOI:

10.3791/54279

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2016년 8월 22일

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1Dipartimento di Scienze Biomediche e Cliniche Luigi Sacco, Università di Milano, 2Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze, Università di Milano-Bicocca

이 논문에서

요약

쥐의 뇌, 미세혈관 내피 세포 및 성상 세포의 공동 배양을 기반으로 혈액 뇌 장벽의 체외 모델을 확립하는 방법을 설명하고 검증합니다. 이 시스템은 형광 분자의 장벽 횡단 투과에 대한 나노 제형의 효과를 연구하는 유효한 도구임이 입증되었습니다.

초록

뇌 미세혈관 내피 세포는 주피세포와 성상세포 말단에 의해 지지되며, 혈액뇌장벽(BBB)을 통한 대형 수용성 약물의 낮은 투과를 담당하여 효과적인 약물 요법을 어렵게 만듭니다. 최근 몇 년 동안 뇌 표적화를 촉진하기 위한 다양한 전략은 BBB를 가로지르는 약물 전달을 위한 혁신적인 나노 시스템을 포함하여 이 부위에서 약물 전달 및 활동을 개선하는 것을 목표로 했습니다. 이러한 맥락에서 BBB의 단순화된 세포 모델을 기반으로 하는 in vitro 접근법은 분자의 trans-BBB 투과에 대한 나노 제형의 효과를 조사하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 이 연구는 상업적으로 이용 가능한 공동 배양된 1차 쥐의 뇌, 미세혈관 내피 세포 및 성상세포로 구성된 이중층 BBB의 발달을 설명합니다. 경내피 전기 저항의 측정과 고분자량 덱스트란의 겉보기 투과성을 기반으로 하는 모델 검증을 위한 다중 매개변수 접근 방식도 설명됩니다. 장벽을 가로지르는 형광 분자의 전좌에 대한 다양한 나노 제형의 효과를 연구하기 위해 이 BBB 모델을 사용하기 위한 개념 증명으로, 우리는 페리틴 나노 입자에 로드된 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)의 사용을 설명합니다. FITC의 trans-BBB 투과를 개선하는 페리틴의 능력은 플럭스 측정 및 컨포칼 현미경 분석을 통해 입증되었습니다. 결과는 이것이 BBB를 가로질러 약물 전달을 위한 나노 시스템을 검증하는 데 유용한 시스템임을 시사합니다.

서론

약물 요법에 대한 중추 신경계의 저항 (CNS) 질환 (예. 암, 간질, 우울증, 정신 분열증 및 HIV 관련 신경 장애)로 인해 뇌 혈관 장벽을 통과 곤란한 약물 투과 포함하는 다양한 다른 메커니즘이다 (BBB) . BBB를 혈액 순환 물질로부터 뇌 조직을 분리 경계이다. 이 배리어 내 혈관 주위 세포와 성상 세포의 endfeet 지원 뇌 미세 혈관 내피 세포 (BMECs)의 층은, 분자량이 400 이상인 다 1 hydrosoluble 이들 약물에 BBB의 높은 선택성을 담당한다. 또 다른 약물 관련 저항기구는 CNS에 약물 침투를 감소시키고 뇌 (2)로부터 자신의 압출을 용이하게하기 위해 협력 약물 유출 컨베이어 (P 당 단백질 및 약제 내성 단백질)의 BMECs에 존재 연결된다.

지난 10 년간, 나노 기술 방법 중 다수는 BBB 3-6 걸쳐 약물 전달의 임상 적 및 생물학적 과제를 해결하기 위해 개발되었다. 이러한 상황에서, 나노 페리틴 (FNN)는 완전히 혁신적이고 유망한 솔루션을 나타낸다. FNN 8 nm의 내경 중공 구형 구조로 배열되어 자기 조립 (24) 페리틴 (FN) 모노머, 12 nm의 구형이다. 페리틴 소단위는 산성 pH에서 분해 및 다양한 유기 분자를 캡슐화 할 수 있도록 중립성 pH를 가져와 형상 기억 방식으로 조립 될 수있다. 따라서, FNN 다기능 약물 전달 시스템 7,8의 개발이 흥미있는 모델을 나타낸다. 또한, FNN이 셀 (9)의 내강 막 상에 발현되는 트랜스페린 수용체 (TFR) (1)의 구체적인 포상 BMECs 감사와 상호 작용할 수있다.

지금까지, BBB의 시험 관내 모델이 다른 순으로 하였다 개발되어왔다R은 다양한 약물의 독성 BBB 향해 또는 유출 수송차와 분자의 상호 작용 트랜스 BBB 투과성 해명. 사실,이 모델은 생체 내 연구를 진행하기 전에 활성 분자의 신속한 검사를 위해 접근 체외에서 유효한 것으로 간주됩니다. 이 모델 동물 (쥐, 마우스, 돼지와 소) 또는 인간의 세포 라인 10,11,12에서 얻은 BMECs 또는 공동 배양 BMECs 및 성상 세포 (드물게 혈관 주위 세포)의 단일 내피 층으로 구성되어 있습니다. TransEndothelial 전기 저항 (봉사자)과 정의 분자량 추적자의 명백한 침투성 (P 응용 프로그램)은 체외 모델의 품질을 결정하는 데 사용되는 두 가지 중요한 매개 변수를 나타냅니다. 여기에 우리가 쥐 BMECs (RBMECs)의 공동 문화를 기반으로 BBB 체외 모델의 고용을 설명하고 쥐 대뇌 피질 성상 세포 (RCA 단자)는 형광 isothi을 캡슐화 페리틴 nanocages의 트랜스 BBB 투과를 공부ocyanate (FITC).

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프로토콜

1. BBB 모델 구축

참고 : 우리가 시판 차 RBMECs와 RCA 단자를 사용하는 것이 좋습니다 BBB를 모델을 구축하십시오. 모든 단계를 층류 후드에서 멸균 처리 시약 및 일회용으로 수행되어야한다.

  1. 세포 배양
    1. 폴리 -L- 라이신 100 μg의 / ㎖ (RT에서 1 시간) 또는 피브로넥틴 50 ㎍ / ㎖ (37 ° C에서 1 시간)와 코트 세포 배양 플라스크는 각각 RCA 단자 또는 RBMECs의 부착을 촉진. 이어서, 5 % 소 태아 혈청, 1 %의 내피 세포 성장 보충와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (SECM)으로 보충 된 1 × 106 RCA 단자와 내피 세포 배지에서 5 × 105 RBMECs, 해동. 10 ml의 SECM의 T75 플라스크에서 20 ㎖의 SECM과 RBMECs의 T175 플라스크에 종자 RCA 단자.
      주 : 해동 및 RCA 단자와 RBMECs 시드의 통로는 배양 세포 밀도와 시간의 조건으로 조정할 필요는 BBB 모델에서 시험 될 실험 조건의 수에 따라. 처음으로1 × 106 RCA 단자 1 바이알에 5 × 105 RBMECs 1 바이알로 보내고, 그것을 20 BBB 베어링 삽입까지 얻을 수있다.
    2. RCA 단자에 대해 80 %가 합류 할 때까지 37 ° C, 5 %, 약 6 일 동안 가습 분위기 중의 CO 2에서 세포를 유지하고 RBMECs 90 % 이상 합류. 5 분 (T75 플라스크 1 ㎖의 트립신과 T175 플라스크 2 ㎖)에 대해 : 트립신 EDTA 용액 (250 트립신 1)를 사용하여 세포를 분리합니다. SECM와 트립신 활동 정지 (2 : 1)로 5 분 동안 750 × g에서 원심 분리하고 세포 현탁액 60 ml를 SECM에 펠릿을 재현 탁.
    3. 삽입에 파종 전에 다른 3 일간 SECM 3 T175 플라스크와 문화에 RBMECs을 분할합니다. BURKER 챔버 내에 광학 현미경 하에서 트립 판 블루로 1 : 1 희석하여 세포 현탁액을 관찰함으로써, RCA 단자 생활의 총 수를 계산.
  2. 삽입 위에 셀 시드
    1. 6 멀티 웰 transpar의 폴리에틸렌 테레 프탈레이트의 일측 치료 (PET) 멤브레인100 μg의 / ㎖ 폴리 -L- 리신 피브로넥틴를 50㎍ / ㎖로 상대방과 ENT 인서트 RCA 단자와 BMECs의 부착을 허용한다. 애완 막과의 접촉을 피하기 위하여 핀셋을 삽입 핸들.
      1. 상부 챔버로 피브로넥틴 용액 (최소 500 μl를) 6 웰 플레이트에 삽입을 놓고 추가 할 수 있습니다. 37 ° C에서 배양 1 시간 후, 피브로넥틴 용액을 제거 멀티 웰 플레이트 떨어져 삽입을하고 대한 멸균 지원 여기에 사용되는 150cm 2 페트리 접시의 바닥에 거꾸로 넣어 이미 삽입 코팅.
      2. 부드럽게 (도 1a에 도시 된 바와 같이, RCA 단자 시드 라 함)를 인서트의 바닥면에 폴리 -L- 라이신 800 μL를 추가하고, 실온에서 1 시간 동안 인서트의 해결책을 유지한다.
      3. 솔루션을 대기음하고 삽입은 15 ~ 30 분 동안 실온에서 건조 할 수 있습니다. 인서트는 이제 셀 시딩에 대한 준비뿐만 아니라, 여러 가지의 멀티 웰 플레이트에 저장 될 수있다BBB를 건설을 진행하기 전에 4 ° C에서 일.
        참고 : FD40 유량 측정에 의해 BBB 설립의 유효성을 검사하는 컨트롤로 사용되는 세포에서 무료로 최소 3 코팅 삽입을 유지해야합니다.
    2. 시드 RCA 단자 삽입 (도 1a)의 아래에서 위쪽에 세포 현탁액 800 ㎕를 적하하여 폴리 -L- 리신 코팅 된 인서트의 바닥면 상 (35,000 / cm 2). 막에 세포의 효과적인 부착을 허용하기 위해, RT에서 4 시간 동안 인서트의 RCA 현탁액을 떠난다.
    3. 잔류 용액을 흡인 SECM 2 ㎖을 함유하는 웰에 삽입 배치하고 매 2 일 SECM을 변경 가습 분위기에서 37 ℃, 5 % CO 2의 멀티 웰 플레이트를 유지한다.
    4. 삼일 후에 때 RCA 단자는 인서트의 하부면을 코팅 한 다음이 단계 인서트의 상부면에 시드 RBMECs :
      1. T175 플라스크에서 RBMECs를 분리하고 계산총 살아있는 세포 단계 1.1.2과 1.1.3에보고.
      2. 아스트로 사이트만을 가진 3 삽입 이탈 SECM (1000 μL) (도 1B)에 삽입 체의 상면에 씨앗 RBMECs (60,000 / cm 2), 티이 배경으로 사용될 수있다. 표준 배양 조건에서 멀티 웰 플레이트를 놓습니다. 2 일마다 내측 하부 챔버 내의 SECM 변경 적어도 3 일간 배양하는 시스템을 유지한다.

2. BBB 검증

  1. 봉사자 측정
    1. 공동 배양 3 일째에, 적절한 챔버로 BBB 베어링 삽입물을 삽입하여 티이을 확인 (즉, 캡을 가지고 있으며, 챔버 뚜껑 모두 전압 검출 및 전류 쌍의 전극을 포함 할 경우) (4) 충전을 SECM ml의. 상피 조직의 볼트 / 저항계로 연결합니다.
    2. 함께 셀 BBB-시스템 티이 측정에 의해, RCA 단자 번째 베어링 3 인서트 봉사자 값을 기록에서 BBBs 얻은 값에서 차감됩니다. Ω cm의 X의 2와 같은 결과를 표현하기 위하여 인서트 (4.2 cm 2)의 표면에 의해 얻어진 티이 값을 곱한다.
    3. 공동 문화의 3 번째 날부터 매일 봉사자를 측정한다. 참고 : 봉사자가 증가 초기 기간 후 기록 된 값 (보통 5 일 및 공동 문화의 일곱 번째 일 사이에) 적어도 두 개의 연속 일 동안 안정적으로 유지해야한다. 그 시점에서 BBB 검증 (2.2 절) 및 / 또는 트랜스 BBB의 실험의 두 번째 단계에 대한 준비가되어 있습니다.
      참고 : 2.1 절에서 설명하는 절차는 다음 투과성 실험 (3 절)에 전념 같은 BBB-시스템에서 수행 할 수 있습니다. 무균 조건에서 작동합니다.
  2. 의 트랜스 BBB 플럭스 FITC-덱스 트란 40 (FD40)
    1. 3 빈 인서트 걸쳐 그 비교 BBB 모델의 하부 챔버 상부에서 FD40 광속 측정다음 단계에 따라 (섹션 1.2.1의 주 참조)
      1. 1 ㎎을 추가 / ㎖ FD40는 BBBs의 상부 구획으로 (SECM 희석) 및 λ를, 그들을 1, 2, 3 시간 후, 하부 챔버 200 μL의 SECM 인출 및 λ의 예를 (spectrofluorimeter으로 488 nm의 형광 강도를 측정 515 nm의) 5 슬릿.
      2. 동일한 분석 매개 변수를 사용하여 처녀 매체의 500 μl를 측정 fluorescenceby SECM 배경에 대한 값을 가져옵니다. 모든 FD40 형광 값의 SECM 배경 형광을 뺍니다.
      3. 공지 농도 (즉. 0.312, 0.625, 1.25, 2.5 μg의 / ㎖) SECM 500 μL에 용해 형광 추적자로 제조 한 검량선과 관찰 된 형광 값의 비교에 의해 투과 FD40의 양을 결정한다.
      4. 에 따라 평균 플럭스 값의 외관상 투과 계수 (P 응용 프로그램)을 계산한다 :
        P 앱 = J / AC , A는 투과 면적 (cm 2)이고, C는 상기 상부 구획실 (몰 / cm 3)의 분자의 농도이다.
        참고 : 적절한 봉사자 값에 도달했습니다 3 개 이상 BBB-시스템은 독점적으로이 검증 절차에 전념해야하며, 다음과 같은 투과성 실험 (섹션 3)에 이용되어서는 안된다. 불임은 필수가 아닙니다.

3. 횡단 BBB FITC로드 Ferritins의 침투 (FNN)

참고 : 다른 형광 분자의 캡슐화 nanocages (FNN)에서 대장균에서 생산 및 조립 인간 페리틴의 재조합 변형 (FN)이,의 교수 스페리의 NanoBioLab (대학 밀라노 - 비 코카, 이탈리아)에서 구할 수 있습니다. FNN은 FITC로드 이전에 설명 프로토콜 (13) 모두 Fn을로드 분자의 농도에 따라 정확하게 determin되어 있습니다에디션.

  1. FITC의 트랜스 BBB 플럭스 및 FITC-FNN
    1. 항에있어서, 배양 7 및 24 시간 후에 자유 염료에 비하여, - (CO 배양 7 일째 통상 5 일에서) 유효성 BBB 모델의 하부 챔버 상부에서 FITC-FNN 광속 측정 다음 단계 :
      1. FITC-FNN은 (50 μg의가 / ㎖ FNN 1.1 μM FITC) 순으로 각 제제에 대해 적어도 6 BBB 시스템의 상부 챔버로 프리 FITC의 동일한 양의 하부 챔버로부터 SECM 용액 2 ㎖을 인출 추가 7 시간 후, 24 시간 후 다른 3 인서트의 하부 챔버에서 최소 3 삽입.
      2. spectrofluorimeter에 의해 수집 된 시료 500 μL의 형광 강도를 측정 (λ의 전 488 nm의, λ 안에 515 나노 미터, 5 슬릿).
      3. 동일한 분석 매개 변수를 사용하여 매체의 500 μl를 측정하여 SECM 배경 형광을 얻습니다. SECM 배경 형광을 빼기모든 FITC 또는 FITC-FNN 형광 값에서.
      4. 500 μL SECM에 용해 유리 또는 nanoformulated 염료의 공지 된 농도 (즉. 6.87, 13.75, 27.5, 55 ㎚)로 제조 된 두 개의 서로 다른 캘리브레이션 곡선 얻어진 형광 값을 비교하여 투과 FITC 또는 FITC-FNN의 농도를 결정한다.
  2. RBMECs에 FITC-FNN 현지화
    1. 상기 BBB 시스템의 상부 챔버로부터 SECM 제거 PBS로 삽입 씻어 10 상부 구획에 500 ㎕의 파라 포름 알데히드 (인산염 완충 식염수 PBS 4 %)을 첨가하여, 각 실험군에 대해 적어도 두 개의 인서트에 RBMECs 해결 RT에서 분.
    2. 잔류 파라 포름 알데히드를 제거하는 PBS로 삽입을 세 번 씻으십시오.
      참고 :이 시점에서, 불임이 필요하지 않습니다.
    3. 애완 막의 적합한 부분을 절단하고, 다음의 단계를 따라 세포를 진행 immunodecoration :
      1. Permeabi10 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 리제 RBMECs. PBS 2 % 소 혈청 알부민 (BSA), 2 % 염소 혈청을 함유하는 용액으로 실온에서 1 시간 동안 차단하는 단계를 수행한다. RT에서 2 시간 동안 1:20 희석 항 폰 빌레 브란트 인자 (VWF)로 샘플을 인큐베이션.
      2. PBS로 3 회 세척 한 후, 2 % BSA로 RT에서 2 시간 동안 세포를 노출하는 하나에 적합한 차 항체를 함유하는 2 % 염소 혈청 용액 : 위해 300 희석 (A)에서 안티 VWR 및 DAPI를 공개 1 : 핵 탐지를위한 1,500 희석.
    4. antifade 장착 솔루션 (삽입 조각 당 하나의 드롭)를 사용하여 현미경 슬라이드 상에 삽입 조각을 탑재, 다음, 커버 슬립과 함께 샘플을 닫습니다. 40X 배율, 1.5 줌과 1,024 X 1,024 픽셀 해상도에서 기름 침지 렌즈를 사용하여 공 초점 현미경으로 분석합니다.

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결과

인서트의 BBB 모델, 세포 부착 및 성장의 확립 중에 PET 막의 특성상 투명 광학 현미경 감사를 사용하여 모니터링 할 수있다. 35,000 세포 / cm 2, RT (도 2A)에서 배양 4 시간 후, 인서트의 바닥면에 효과적으로 부착의 밀도로 시딩 RCA 단자와, 스핀들 형상의 형태를 가지고, 일에 막 표면을 덮도록 성장 (그림 2B). 60,000 세포 / ㎠의 밀도로 접종 RBMECs은, 가시적으로 37 ° C (도 2c)에서 배양 약 3 시간 후 PET 막의 상면에 부착된다. 현상 RBMEC 층으로 인해 하부 층 RCA (도 2D)와 오버랩, 광학 현미경으로 다음 일간 시각화하기 어려울 수있다.

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토론

여기에 설명 된 체외 방법은 나노 입자와 nanoformulation에 따라 형광 분자의 트랜스 BBB 전달을 연구하는 데 유용한 검증 된 접근 방식을 나타냅니다. 여기에서 우리는 BBB에서화물 분자의 전위를 연구 할 수있는 좋은 후보를 나타냅니다 FNN를 사용합니다. 그것은 구체적으로 BMECs의 내강 막에 표현 수용체 매개 내재화 경로를 사용하여 나노 입자의 흡수를 매개하는 TfR1 수용체에 의해 인식되기 때문에 FNN은 약물 / 에이전트의 트랜스 BBB 전달을위한 금 nanovector 간주됩니다. 또한, FNN 천연 나노 입자이며, 따라서, 양호한 생체 적합성 프로필을 갖는다. 마지막으로, FNN은 간단하고 효율적인 메커니즘을 저 차원 hydrosoluble 분자를 캡슐화 할 수있다. 유기 또는 무기 나노 입자를 다른 다른 타입의 트랜스 BBB 투과는 나노 입자의 특성에 대하여 몇 가지 고려 사항에 따라, 프로토콜로 평가 될 수있다. 제 1 pnanoformulated 약물 / 에이전트의 침투를 공부 r...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 Assessorato alla Sanità, Regione Lombardia 및 Sacco Hospital(NanoMeDia Project)에 연구 기금을 제공했다고 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
쥐 뇌 미세혈관 내피 세포 InnoprotP10308은 Sprague Dawley 쥐의 뇌 조직에서 분리되어 첫 번째 통로에서 동결 보존되어 동결
피질 성상세포InnoprotP102022일 쥐의 뇌 조직에서 분리하여 1항에서 동결 보존하고 냉동 상태로 배송되었습니다.
내피 세포 배지 키트InnoprotP60104ECM(500ml) 및 태아 보빈 혈청(25ml), 내피 세포 성장 보충제(5ml) 및 페니실린/스트렙토마이신(5ml). 37 °에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조를 사용하고 페
놀 없이 가벼운 트립신-EDTAEuroCloneECM0920D37°C에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조
Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000SigmaFD40S는 가벼운
파라포름알데히드로부터 보호합니다 시그마158127희석
Dulbecco의 인산염 완충액 식염수 (Ca 및 MgEuroCloneECB4004L
Triton ); X-100SigmaT8787
소 혈청 알부민 시그마A7906
염소 세럼 EuroCloneECS0200D
마우스 단클론 항 Von Willebrand 인자DakoM0616
AlexaFluor 546 결합 항체 마우스 IgGsThermoFischer ScientificA-11003빛으로부터 보호
DAPI (4' ,6-diamidino-2-phenylindole) ThermoFischer ScientificD1306빛으로부터 보호합니다
ProLong Gold Antifade MountantThermoFischer ScientificP36934
Poly-L-lysine HydrobromideSigmaP1274여러 번 사용할 수
.SigmaF1141동일한 용액을 여러 번 사용할 수 있습니다
폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 인서트FalconF3090투명 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 멤브레인; 표면적: 4.2 cm2; 기공 크기 0.4 &마이크로; m/표면 면적
T75 Primo TC 플라스크EuroCloneET7076
T175 Primo TC 플라스크EuroCloneET7181
EVOM2 상피 조직 볼트/옴미터     세계 정밀 기기 독일EVOM2
Endohm- 24SNAP 컵세계 정밀 기기 독일ENDOHM-24SNAP
빛/형광 현미경 카메라Leica MicrosystemsDM IL LED Fluo/ ICC50 W 카메라 모듈  카메라가 있는 살아있는 세포를 위한 도립 현미경 
컨포칼 현미경Leica MicrosystemsTCS SPE
분광 형광계JascoFP-8000
된 를 전달했습니다.는 로부터 보호하십시오 레드 화학 후드의 은 . 같은 용액은 소 혈장에서 피브로넥틴을 있습니다은 .

참고문헌

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