Summary
تحديات بالغة الأهمية للبحث ميداني مرض السكري لفهم الآليات الجزيئية التي تنظم جزيرة تكرار β خلايا وتطوير طرق لتحفيز تجديد خلايا بيتا. هنا طريقة فحص عالية المحتوى لتحديد وتقييم وقدم النشاط ودعم تكرار β-خلية من جزيئات صغيرة.
Introduction
مرض السكري يشمل مجموعة من الاضطرابات تقاسم نقطة النهاية المشتركة للتوازن الجلوكوز تعطلت. على الرغم من أن الآليات المسببة للأمراض من أنواع فرعية مرض السكري تختلف، إلا أنهما يشتركان نتيجة لانخفاض كتلة خلايا بيتا، أي فقدان القدرة على إنتاج الأنسولين 1،2. في الوقت الحاضر، واستراتيجيات علاج مرض السكري تعتمد على إدارة المزمنة من الأنسولين خارجي، وتحفيز الصيدلانية إنتاج مادة الأنسولين أو تعزيز الحساسية للانسولين، ونادرا ما، وزرع جزيرات البنكرياس أو كله البنكرياس 3،4. وللأسف، فإن نجاح هذه الاستراتيجيات قصيرة الأمد و / أو يفشل في تلخيص بما فيه الكفاية وظيفة إنتاج الأنسولين الذاتية. وعلى الرغم من فائدة من تطوير طريقة لتحفيز تجديد خلايا بيتا، لا يوجد نهج من هذا القبيل. ونتيجة لذلك، وهو هدف أبحاث مرض السكري الرئيسي هو تطوير طرق لتوليد خلايا β جديدة أو لتوسيع الذاتية β خلايا كتلة 5 6،7. الأهم من ذلك، المصدر الغالب للخلايا β جديدة في الجسم الحي هو موجودة من قبل خلايا β بدلا من الخلايا الاصلية المتخصصة 8،9. على الرغم من أن β خلايا يبدو أن لديها قدرة محدودة النسخ، زيادة صغيرة في كتلة β خلايا (~ 30٪) قد تكون كافية لاستعادة توازن الجلوكوز في كثير من مرضى السكر. وعلاوة على ذلك، في تحفيز الصيدلانية الموقعي من كتلة β-الخلية هو استراتيجية المعاملة التي قد تكون غير مكلفة وقابلة للتطوير. وهنا يرد طريقة فحص عالية المحتوى من أجل تحديد وتوصيف جزيئات صغيرة التي تحفز نمو خلايا بيتا.
ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من في المختبر الطرق التجريبية لتحديد المنتجات الجينات و / أو جزيئات ثار تشجيع تكرار β خلايا الأساسي. الجهود المبكرة لقياس خلايا بيتا تكرار الحث المستخدمة الجنين الثقافة القوارض بنكرياسات أو سليمة الثقافات جزيرة معزولة لقياس [3 H] التأسيس الثيميدين، BrdU التأسيس أو هيئات الإنقسامية داخل ألدهيد-thionine أو الأنسولين السكان الملون في استجابة لظروف علاج محدد 10، 11. هذه الأساليب في المختبر، والمتغيرات وثيقة يكون لها العديد من القيود. وتشمل أوجه القصور البارزة (1) استخدام الخلايا الجنينية التي، على عكس β خلايا ناضجة، عرض وارتفاع معدل تكرار β-الخلايا القاعدية وهي النمو ينظم بطريقة متميزة 12؛ (2) طبيعة الشخصية للتحكيم التي تعتمد على المجرب من أحداث النسخ المتماثل β-الخلية؛ (3) العمل وطبيعة مكثفة وقت العد التي تعتمد على المجرب من أحداث النسخ المتماثل β خلايا يؤخر الإنتاجية التجريبية. (4) استخدام النووي التأسيس / وصمة عار / مظهر لتحديد تكرار حتىالخبر وصمة عار هيولي غير متداخلة لتحديد خلايا بيتا يؤدي إلى misattribution من أحداث النسخ المتماثل غير β خلايا المباشرة لبيتا خلايا.
وفي الآونة الأخيرة تم استخدام ناضجة خلايا β الأولية لتقييم أثر التحوير الإفراط في التعبير وكذلك علاج الجين المنتج أو مركب على النسخ المتماثل β خلايا 13-16. ومع ذلك، فقد اعتمدت هذه الدراسات أيضا على العد شخصي لأحداث النسخ المتماثل، staining- حشوية أو غير محددة اساليب تحديد β خلايا و / أو خطوات كثيفة العمالة التي تحد من الإنتاجية، على سبيل المثال، الفردي الطلاء الشرائح جيدا من الخلايا أو جزيرة سليمة تضمين البارافين وتجهيز 17. والجدير بالذكر، وهو الإنسان β-خلية منهجية فرز تكرار الصورة القائمة، مماثلة لتلك الواردة في هذه الوثيقة، تم نشر 18. ومع ذلك، لم يثبت الاستخدام الناجح لهذا الاختبار واستخدام الجزر الإنسان لغربلة أولية قد لا تكون على نطاق واسع الهيئة الاتحادية للبيئةsible.
استراتيجية بديلة لتحديد المواد المعززة للتكرار هو تقييم تحريض نمو خطوط β-الخلية. الجهود الأولية المستخدمة تحولت β خلايا خطوط مثل min6 الخلايا أو INS 832/13 خلايا 14،19-21. ومع ذلك، هذه خطوط الخلايا تظهر النمو غير المقيد وتحمل شبها جيدا متباينة β خلايا 22. ونتيجة لذلك، والقدرة على النمو الاستقراء هو الحد الأدنى، من أهمية واضحة وصعبة في بعض الأحيان أن ألخص. استراتيجية محسنة لفحص المستندة إلى خط الخلية يستخدم "تحويل عكسية" الخلايا التي هي نمو اعتقل في غياب التتراسيكلين (الدوكسيسيكلين) معتمد على SV40 المستضد T التعبير 23،24. ومع ذلك، فإنه من غير الواضح ما إذا كانت هذه الخلايا تعود إلى "طبيعية" حالة شبيهة β-خلية على إزالة الدوكسيسيكلين. للأسف، واستخدام هذه الخلايا قد حقق المركبات المعززة للنمو المعممة التي لا يبدو أن لها فائدة فورية24. وعموما، قد يكون استخدام خطوط الخلايا لدراسة تنظيم نمو الخلية من نوع عرض الحد الأدنى من النشاط تكرار عفوية محدودة التطبيق.
وβ خلايا تكرار منصة فحص المقدمة هنا تستخدم الناضجة الفئران الأساسي β خلايا للاحتفاظ في تنظيم نمو الجسم الحي إلى أقصى حد ممكن والثقافات جزيرة الخلية المختلطة تكوين خلية من نوع لتمكين تحديد الأنشطة المعززة للنمو المقيدة النسب، متعددة -well تهيئة إلى تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية وتحليل الآلي للقضاء على التحيز وتسهيل الإنتاجية. وقد مكن الاستخدام الناجح لهذه المنصة تحديد العديد من المركبات التي تعزز تكرار خلايا بيتا 25،26. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام فحص للدراسات العلاقة بين الهيكل والنشاط والتجارب قشوة الكيميائية لتقديم رؤى الآلية في تنظيم الجزيئي للتكرار β-الخلية. تم تعديل منصة عرض بنجاح FOالتحقيق استنادا رني ص lentiviral النسخ المتماثل β خلايا الممرات 25. وتشمل القيود المفروضة على فحص قابلية محجوب (استخدام الخلايا الأولية)، واستخدام القوارض بدلا من جزيرة خلايا الإنسان (على الرغم من أن الفحص يمكن تكييفها للدراسات جزيرة الإنسان)، والنفقات المرتبطة التصوير القائم على الأجسام المضادة واستخدام جزيرة الأساسي، واستخدام من الجزر المتناثرة (تعطلت العمارة جزيرة) لتسهيل الحصول على الصور الآلي والاعتماد على توافر المجهر الآلي مع الحصول على الصور والقدرة على التحليل. على الرغم من أن سطحي جدا في الجسم الحي منهجية الفرز لتحديد المنتجات الجينات أو المركبات التي تحفز تجديد الخلايا بيتا في الموقع سيكون امرا مثاليا، مثل هذا المنبر ليست متاحة بعد 27. وبالتالي، فإن منصة وصف مناسبة للباحث مهتم في التحقيق في معظم جوانب تكرار β-الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجري هذا البروتوكول وفقا للجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة ستانفورد كلية الطب. يتم تحجيم بروتوكول صفها لعزل جزيرة من ستة 250-300 غرام (8-9 أسابيع من العمر) ذكور فئران سبراغ داولي، وهو ما يكفي لتوليد 228 بئرا من لوحة 384 جيدا لتقييم تكرار جزيرة خلايا.
1. تحضير المواد
- إعداد وسائل الاعلام الطلاء قبل الشروع في عزلة الجزيرة عن طريق جمع وسائل الإعلام مكيفة من 804G خلايا سرطان المثانة الفئران الحفاظ على التقاء لمدة 3 أيام (20 مل من RPMI1640) في 15 سم صحن زراعة الأنسجة 28. تصفية العقيمة وتخزينها (-20 درجة مئوية) وسائل الإعلام مكيفة لاستخدامها لاحقا.
- تعقيم الأدوات الجراحية (واحد 12 سم ملقط الأنسجة مسننة، واحدة 11.5 سم مقص غرامة، واحدة 14.5 سم مقص جراحي، وهما 16 سم ملقط المنحنية، واحد 12 سم مرقئ المنحني، واحد 12 سم مقبض مشرط) واحد غربال الأنسجة 30 شبكة قبل الحرف الأولiating عزل خلايا البنكرياس.
- يعد حل الهضم البنكرياس عن طريق إذابة 60٪: 40٪ خليط من الدرجة النقاء الأول: الطبقة collagenases الثاني (إجمالي النشاط كولاجيناز 300،000 - 400،000 وحدة) في 60 مل من 1X هانكس "محلول الملح المتوازن (HBSS) تستكمل مع الكالسيوم والمغنيسيوم. تحميل 10 مل من العازلة الهضم البنكرياس إلى 10 مل المحاقن (ستة) مع 1 "22 G إبرة ومكان على الجليد.
ملاحظة: يتم حقن 10 مل من محلول الهضم في الفئران. حجم وفقا لذلك. - إعداد 4.5 مل من كوكتيل مخدر في غطاء التهوية عن طريق خلط 1.3 مل من الكيتامين (100 ملغ / مل)، 0.2 مل من زيلازين (100 ملغ / مل) و 3 مل من برنامج تلفزيوني. تحضير كوكتيل مخدر داخل 1 ساعة من بدء العزلة جزيرة.
- إعداد غسل العازلة بإضافة 25 مل من مصل العجل إلى 500 مل من HBSS. ضع غسل العازلة على الجليد لاستخدامها لاحقا.
- إعداد 1 زجاجة متوسطة جزيرة وهو 500 مل من انخفاض مستوى السكر في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM)، 50 مل الجنين المصل البقري (FBS)، 5000 وحدة / مل من البنسلين و 5،000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين.
- إعداد جزيرة ظيفة المتوسطة من حل وظيفة / الجدوى (500 مل) مع 2٪ FBS، 2 مم الجلوتامين، 5 ملي الجلوكوز، 5000 وحدة / مل من البنسلين و 5،000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. تخزين وسائل الإعلام وظيفة جزيرة (4 درجة مئوية) لاستخدامها لاحقا.
- إعداد 40 مل عازلة تمنع عن طريق إضافة 2.5 مل مصل حمار و 0.12 مل تريتون X-100-37،38 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). مخزن عازلة تمنع (4 درجة مئوية) لاستخدامها لاحقا.
- الحصول على الأجسام المضادة المطلوبة قبل الشروع في البروتوكول.
ملاحظة: يستخدم PDX-1 (TRITC) وكي-67 (FITC) شارك في تلطيخ لفحص تكرار β خلايا الأساسي. لتحليل النسخ المتماثل نسب محددة، نفذ المناعي تلطيخ لعلامات إضافية هوية الخلية (الأنسولين، الجلوكاجون، فيمنتين أو السوماتوستاتين، TRITC) جنبا إلى جنب مع، PDX (Cy5) وكي-67 (FITC) تلطيخ النووية (دابي). مندوب البديلعلامات lication، على سبيل المثال، بكنا، ويمكن أيضا أن تستخدم. - إعداد خطة العلاج 228 بشكل جيد مع كل حالة العلاج التي أجريت في quadruplicate. تشمل positive- (5 Iodotubercidin [1 ميكرومتر] أو ديبيريدامول [15 ميكرومتر]) وسيارة تحكم ([دمس 1: 666 تمييع) بئرا.
2. الإرواء من البنكرياس
- تخدير الفئران عن طريق الحقن الملكية الفكرية من حل كوكتيل مخدر المخفف (0.30 مل / 100 غرام من وزن الجسم). وبمجرد أن الفئران هو تخدير كامل وغير مستجيب للمؤثرات الضارة، نفذ خلع عنق الرحم.
- وضع فأر الموت الرحيم في موقف (اتجاه الجمجمة، الذيلية) ضعيف على كومة من منشفة ورقية ورش منطقة البطن مع الايثانول 70٪.
- فتح تجويف البطن مع U-شق (قاعدة في منطقة العانة) وسحب الجلد في اتجاه منقاري على الصدر للكشف عن تجويف البطن.
- بعناية والاستيلاء على الاثني عشر باستخدام اثنين من أزواج من ملقط المنحنية، موقع الإدخال الاثني عشر للب مشتركةقناة إيل (مصرة أودي) والمشبك افتتاح الاثني عشر في حليمة مع مرقئ المنحني.
- رفع مرقئ المنحني تستخدم لكبح القناة الصفراوية المشتركة حليمة والاستيلاء على القناة الصفراوية بالقرب الكبد باستخدام ملقط المنحنية. استخدام تشريح حادة مع ملقط منحنية لعزل وفضح القناة الصفراوية.
- إعادة الفئران مع الداني الرأس والقدمين البعيدة.
- يقني؛ يدخل القنية القناة الصفراوية المشتركة (CBD) في أو مجرد البعيدة إلى تقاطع القنوات الكبدية الكيسي والمشتركة مع حل هضم البنكرياس -loaded 10 حقنة مل وحقن ببطء 10 مل من محلول الهضم البنكرياس. في حين حقن، ودعم اتفاقية التنوع البيولوجي مع مقبض مشرط. إعادة الإبرة إذا كان لاصق والبنكرياس تفشل لتضخيم.
- إزالة البنكرياس تضخم باستخدام ملقط المنحنية ومقص غرامة لفصلها من القولون النازل والأمعاء والمعدة والطحال. وضع البنكرياس مضخمة على الجليد في أنبوب 50 مل تحتوي على 5 مل من
3. التفكك من البنكرياس
- مرة واحدة يتم جمع جميع بنكرياسات، وضع أنابيب الهضم إلى 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 15 دقيقة. دوامة بلطف الأنابيب كل 3 دقائق.
- بعد 15 دقيقة، هزة بقوة (عموديا) الأنابيب 10 مرات، وإضافة 10 مل من العازلة غسل الباردة. هزة بقوة أنابيب ل5 مرات إضافية، ووضع على الجليد.
- ملء أنابيب الهضم إلى 50 مل مع العازلة غسل الباردة ومزيج من قلب أنابيب 5 مرات.
- أنابيب الطرد المركزي في 97 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وتصب قبالة طاف. يجب الحرص على عدم طرد الأنسجة مكعبات.
- إضافة 25 مل العازلة غسيل وإعادة تعليق الأنسجة قبل vortexing بلطف. كرر الخطوات من 3.4 و 3.5 ضعف أكثر.
- وضع غربال الأنسجة 30 شبكة على شارعerile 250 مل دورق وتصب تعليق الأنسجة على غربال. شطف أنبوب الهضم مع 20 مل إضافية من غسل العازلة وتصب على شبكة. تتم إزالة أنسجة البنكرياس والدهون غير المهضومة في هذه الخطوة.
- صب المواد التي تمت تصفيتها إلى قسمين جديدة 50 مل أنابيب وبيليه الأنسجة عن طريق الدوران في 97 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية. صب طاف وعكس أنابيب لتصريف عازلة الزائد.
4. تنقية من الجزر
- إضافة 20 مل من البرد polysucrose / الصوديوم محلول دياتريزوات (1.119 غرام / مل الكثافة) للأنسجة البنكرياس مكعبات. متجانس اعادة تعليق محتويات كل أنبوب من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا خمس مرات.
- تراكب بلطف الحل دياتريزوات polysucrose / الصوديوم مع 10 مل HBSS. الحفاظ على واجهة حادة السائلة بإضافة ببطء HBSS على طول الجدار أنبوب.
- الطرد المركزي بنكرياسات يهضم في 560 x ج لمدة 15 دقيقة (4 درجة مئوية) مع تسارع بطيء وليس الفرامل.
- شاركllect طبقة جزيرة من واجهة استخدام 10 مل ماصة ومكان الجزر في جديدة 50 مل أنابيب. لا تجمع الجزر في هذه المرحلة.
- إضافة 40 مل من غسل العازلة إلى كل أنبوب 50 مل وتدور لمدة 1 دقيقة في 140 x ج في 4 درجات مئوية.
- تخلصي من طاف واعادة تعليق الجزر المجمعة في 50 مل من غسل العازلة التي كتبها قلب الأنابيب عدة مرات. أنابيب الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 97 x ج في 4 درجات مئوية لجمع الجزر في بيليه.
- تخلصي من غسل العازلة وتكرار الغسيل. جلب الجزر في نسيج الثقافة هود ونضح طاف.
- اعادة تعليق كل أنبوب من الجزر في 6 مل من المتوسط جزيرة.
- نقل الجزر من كل أنبوب 50 مل في بئر من ستة جيدا طبق زراعة الأنسجة. دوامة طبق من 6 جيدا لجمع الجزر في منتصف البئر ومراقبة الجودة جزيرة والنقاء تحت المجهر.
- جمع يدويا الجزر باستخدام مل ماصة 1 و نقل الجزر التقطت في متاخمةكذلك تحتوي على 6 مل من وسائل الاعلام خلايا البنكرياس. ويتحقق كرر دوامات جزيرة واختيار حتى> 90٪ النقاء.
- نقل الجزر النقية إلى صحن زراعة الأنسجة 10 سم تحتوي على 20 مل من المتوسط جزيرة.
- مكان الجزر في نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2) بين عشية وضحاها (الشكل 1A).
- في إعداد خلايا الطلاء خلايا البنكرياس، ومعطف الآبار من 384 لوحة جيدا مع 40 ميكرولتر من 804G وسائل الإعلام مكيفة لكل بئر. احتضان بين عشية وضحاها في نسيج الثقافة الحاضنة.
5. تشتت والتصفيحات من الخلايا جزيرة
- في اليوم التالي، فصل بلطف الجزر من طبق 10 سم مع مكشطة خلية ونقلها الجزر في أنبوب 50 مل.
- بيليه الجزر بواسطة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 22 x ج في درجة حرارة الغرفة. نضح طاف.
- يغسل الجزر مع 20 مل من برنامج تلفزيوني الدافئ وصب على النحو الوارد أعلاه.
- اعادة تعليق الجزر في 0.25٪ التربسين (150 ميكرولتر في البنكرياس الفئران)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ماصة الجزر صعودا وهبوطا 10 مرات باستخدام 1 مل ماصة بعد 5 و 10 دقيقة من الحضانة.
- بعد 10 دقيقة، وتقييم عينة 20 ميكرولتر من الجزر trypsinized تحت المجهر لضمان الهضم الكامل والاعتماد على الخلايا جزيرة باستخدام عدادة الكريات. إذا ظلت الجزر غير مهضوم، ومواصلة حضانة لعدد إضافي من 3-5 دقيقة وماصة صعودا وهبوطا 10 مرات أكثر. كرر حسب الضرورة.
ملاحظة: العائد نموذجي هو ~ 125،000 - 150،000 جزيرة الخلايا في الفئران. - إزالة 804G مكيفة المغلفة وسائل الإعلام 384 لوحة جيدا من الحاضنة وإزالة الوسائط باستخدام الشافطة المتعددة 12-جيدا.
- تعليق الخلايا خلايا البنكرياس في مناطق ذات كثافة من 45،000 خلية لكل ميليلتر في جزيرة ظيفة المتوسطة ولوحة 70 ميكرولتر (3،150 خلايا) لكل بئر مع ماصة الأقنية (الشكل 1B).
ملاحظة: لأن β خلايا تقع في الآبار الخارجية تميل إلى الهجرة نحو محيط الصفوف استخدام لوحة C إلى N والأعمدة 421 لوحة 228 بئرا مع جزيرة خلايا معزولة من 6 الفئران. - وضع لوحة في نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 48 ساعة للسماح للالتصاق الخلية.
6. جزيرة خلية ثقافة العلاج، التثبيت وتلطيخ
- إعداد 200 ميكرولتر من السيارة والمركبات (يتم تنفيذ شروط العلاج في quadruplicate) في تركيز 2X في وظيفة جزيرة المتوسطة. ترتيب المركبات في العقيمة لوحة 96-جيدا لتسهيل متعددة جيدا pipetting ل.
- إزالة بعناية متوسطة جزيرة مع الشافطة المتعددة 12 جيدا واستبدال المتوسطة وظيفة جزيرة (35 ميكرولتر / جيد) باستخدام ماصة 12-جيدا. إزالة واستبدال وسائل الإعلام من صف واحد في وقت واحد للحد من خطر الجفاف (الشكل 1C).
- بدء العلاج عن طريق نقل 35 ميكرولتر / بئر الحلول مجمع 2X. العودة لوحة الحاضنة لمدة العلاج 48 ساعة.
- بعد 48 ساعة من العلاج، صب سائل الإعلام العلاج قلب اللوحة. </ لى>
- يغسل بلطف الخلايا جزيرة مع 50 ميكرولتر لكل بئر من برنامج تلفزيوني 1X (1 دقيقة). إضافة برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة متعدد القنوات.
- صب برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولتر لكل بئر من البرد بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) المخفف في برنامج تلفزيوني 1X. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- غسل الخلايا ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما) من قلب لوحة لإزالة PFA وإضافة بلطف 60 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر على النحو الوارد أعلاه.
- إعداد 15 مل مستضد حل استرجاع عن طريق خلط 14.25 مل الفورماميد و 0.75 مل 0.15 M سيترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6). جعل حل استرجاع المستضد مباشرة قبل الاستعمال.
- إزالة برنامج تلفزيوني من الآبار عن طريق عكس لوحة وإضافة 60 ميكرولتر حل استرجاع مستضد إلى كل بئر. تسخين لوحة في 70 ° C حمام الماء لمدة 45 دقيقة. وضع كتلة التدفئة في أعلى لوحة خلال هذه الحضانة لمنع تزييفها لوحة متعددة أيضا.
ملاحظة: يجب أن يكون الماء في منتصف الطريق حتى تنورة وحة؛ لا ينبغي أن تكون مغمورة لوحة. - غسل الخلايا مع 60 ميكرولتر لكل بئر من برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما). إضافة برنامج تلفزيوني مع ماصة متعدد القنوات وصب برنامج تلفزيوني من قلب اللوحة.
- استخدام ماصة متعدد القنوات لإضافة 40 ميكرولتر لكل بئر من العازلة الحجب واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المنطقة العازلة الحجب التي كتبها قلب لوحة والصب.
- إضافة 40 ميكرولتر من الماوس مكافحة الإنسان كي-67 (1: 200) والماعز مكافحة الإنسان PDX-1 (1: 100) الأجسام المضادة المخفف في عرقلة العازلة إلى كل بئر واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
- في اليوم التالي، صب الحل مكافحة الجسم وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما) كما هو موضح أعلاه. صب برنامج تلفزيوني.
- إضافة 40 ميكرولتر لكل بئر من المخفف (1: 200) المعقدة البيروكسيديز حمار المضادة للماوس مفتش وحمار رودامين مترافق مكافحة الماعز مفتش في عرقلة العازلة. احتضان لمدة 1 ساعةبدرجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما. إضافة 40 ميكرولتر من المخفف (1: 400 في عرقلة العازلة)، فلوريسئين مترافق streptavidin إلى كل بئر. احتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما. إضافة 40 ميكرولتر لكل بئر من دابي (300 نانومتر في عرقلة العازلة)، واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X مرتين وترك الخلايا في 40 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X. لوحة هي الآن جاهزة لتحليلها.
تحليل النسخ المتماثل 7. β خلية
ملاحظة: يجب أن يتم إنشاء لبروتوكول فحص لارتفاع مجهر فحص المحتوى المستخدمة لقياس تكرار خلايا بيتا. في تكوينه أبسط، وهذا البروتوكول هو فحص اللونين حيث يتم استخدام علامة هوية لتحديد خلايا بيتا يستخدم (PDX-1 + -cells) وعلامة التكرار (كي-67) لتحديد الأحداث انقسام الخلايا.
- تحديد الكائنات (β خلايا) استنادا إلى averagه كثافة مضان من PDX-1 تلطيخ (549 فلتر نانومتر) ضمن دائرة التقريبية (الطول: العرض <1.6) داخل منطقة بكسل المتوقعة من نواة β-الخلية (الشكل 2A).
- بعد ذلك، وضع الإعدادات لتحديد الأحداث التكرار (كي-67-الإيجابية) على أساس متوسط كثافة مضان (485 فلتر نانومتر) داخل PDX-1 + المنطقة (الشكل 2B).
يجب أن تكون ثابتة مرات التعرض للسماح مقارنات بكسل الكثافة عبر الصور: مذكرة. يتم تعديل المعلمات بروتوكول الفحص بحيث المكالمات آلة يستبعد باستمرار تلطيخ والحطام والركام الخلايا غير محددة التي يمكن أن تؤثر سلبا على جودة البيانات. - تحليل ما لا يقل عن 500 β خلايا لكل بئر إلى تحقيق أقصى قدر من الدقة والحد من التقلبات.
ملاحظة: من المتوقع أن يكون 0.5 المؤشر تكرار β-الخلايا القاعدية في الثقافات جزيرة الفئران - 3٪. عادة، 40 صور لكل بئر هي أكثر من كافية لتحديد 500 β-الخلايا. - قبل تحليللوحة كاملة، وتحليل negative- مختارة (المعالجة DMSO) والسيطرة الايجابية (5 iodotubercidin [1 ميكرومتر] أو ديبيريدامول [15 ميكرومتر]) المعالجة بالإثير الآبار لتقييم صلاحية بروتوكول الفحص. عندما يثبت الفحص بشكل صحيح، ومركبات مراقبة إيجابية تحفز على الأقل زيادة شقين في نسبة تكرار β-الخلايا.
- قراءة لوحة كاملة بمجرد التحقق من صحة بروتوكول الفحص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتقييم β-الخلية أو تكرار α خلايا، مطلوب بروتوكول فحص أربعة ألوان. أولا، ويتم تحديد الكائنات عن طريق تلطيخ دابي (القناة 1، 386 نانومتر). بعد ذلك، يتم عد β خلايا (الحدث 1): الكائنات التي تشترك في التعبير عن PDX-1 + (القناة 2، 650 نانومتر) والأنسولين شبه النووية (قناة 3، 549 نانومتر). وفي وقت لاحق، يتم عد تكرار β خلايا (الحدث 2): (حدث 1) التي شارك صريح كي-67 (قناة 4، 485 نانومتر) (الشكل 3) خلايا بيتا. يتم احتساب النسبة المئوية للتكرار خلايا بيتا: (الحدث 2 / الحدث 1) × 100. لتحديد تكرار خلايا ألفا، ويتم تحديد إجمالي الكائنات عن طريق تلطيخ دابي (القناة 1) ثم يتم تعداد خلايا ألفا (الحدث 1) من خلال غياب PDX-1 تلطيخ (قناة 2) وجود تلطيخ الجلوكاجون حول النواة (قناة 3). تكرار α خلايا (الحدث 2) هي عدد α-الخلايا التي تشارك في صريحة كي-67 (قناة 4) (الشكل 4).يتم احتساب النسبة المئوية للتكرار الخلايا α: (الحدث 2 / الحدث 1) × 100.
قبل البدء في التجربة، ويتم وضع خطة العلاج المركب (الجدول 1A). هنا، تم تشغيل مقايسة نطاق صغير باستخدام السيطرة السلبية ([دمس-تعامل) والسيطرة الايجابية (المعالجة ديبيريدامول [15 ميكرومتر]) شروط لتقييم PDX-1، β-خلية وتكرار α خلايا في شكل 384-جيدا ( 49 صور لكل بئر). وتظهر البيانات التجريبية ديبيريدامول لتعزيز انتقائي PDX-1 + -cell وتكرار β خلايا ولكن ليس تكرار خلايا ألفا. وكان متوسط عدد حددت PDX-1-خلايا لكل بئر 5541 ± 555 لالمعالجة DMSO و6،439 ± 363 للظروف المعالجة ديبيريدامول (ع <0.01)؛ مما يدل على زيادة تعتمد على ديبيريدامول في PDX-1 عدد الخلايا (الجدول 1B، أعلى). متوسط في المئة PDX-1 + -cell التكرار ([دمس] + PDX-1 + كي-67 + </ سوب> / DMSO + PDX-1 +) هو 3.35 ± 0.50٪ لالمعالجة DMSO و10.10 ± 0.98٪ لشروط المعالجة ديبيريدامول (ع <0.01) (الجدول 1B، أسفل). الأهم من ذلك، هناك مماثلة PDX-1 معدلات + -cell تكرارها في الآبار تحليلها في وقت لاحق لβ خلايا (صفوف قوات التحالف) وتكرار α خلايا (الصفوف GJ): [دمس = 3.3 ± 0.66 (صفوف قوات التحالف) و 3.4 ± 0.23 (الصفوف GJ) (ع = 0.80)؛ ديبيريدامول = 9.8 ± 0.86 (صفوف قوات التحالف) و 10.4 ± 0.1.1 (الصفوف GJ) (ع = 0.43). وبالتالي، فإن هذه الآبار، على الرغم الملون لمختلف علامات الخلية النسب (الانسولين والجلوكاجون)، رد بالمثل للعلاج بالعقاقير.
التالي معدلات تكرار β-الخلايا والخلايا α حسبت من البيانات الخام (الجدول 2). وقد ارتفع متوسط عدد β خلايا (الحدث 1) في الاستجابة للعلاج ديبيريدامول: DMSO 3930 ± 488 مباراة. ديبيريدامول 4589 ± 218 (ف <0.05). والملاحظ أن هناك انخفاضا كبيرا في عدد β خلايا (3930 ± 488) مقارنة PDX-1 الخلايا (5541 ± 555) (ف <0.01). هذا هو نتيجة استبعاد PDX-1 + -cells التي الأنسولين - من العد β خلايا، على سبيل المثال، δ الخلايا أو الخلايا β-خلية سلفية، والتشدد إضافية تتطلب خلايا بيتا ليكون الأنسولين +. والجدير بالذكر، فإن عدد α خلايا (الحدث 1) لا يزيد مع العلاج ديبيريدامول (DMSO 1465 ± 123 مقابل ديبيريدامول 1467 ± 74.7؛ P = 0.93). وبالتالي، ديبيريدامول يزيد بشكل انتقائي عدد β-الخلية. وارتفع عدد تكرار خلايا بيتا (الحدث 2) في الاستجابة للعلاج ديبيريدامول (DMSO 131 ± 31 مقابل ديبيريدامول 476.5 ± 39.6؛ P <0.01) ولكن عدد من تكرار خلايا ألفا (الحدث 2) ليست ([دمس] 10.25 ± 3 مقابل ديبيريدامول 9.0 ± 1.6؛ ع = 0.5). وأخيرا نسبة تكرار β-ميتم احتساب LLS والخلايا α ((الحدث 2 / الحدث 1) × 100). في الواقع، ديبيريدامول يزيد من نسبة تكرار خلايا β ولكن ليس خلايا ألفا (ملخصة في الشكل 5). الأهم من ذلك أن معدل تكرار β-الخلايا القاعدية ثقافة صحية يختلف بين التجارب (0،5-3٪)، ولكن يجب أن تكون متسقة للغاية عبر الآبار ضمن التجربة. لأن تكرار القاعدية هو متغير، فإن معدل تكرار β-الخلية التي يسببها مركب هو أيضا متغير عبر التجارب، ومع ذلك، فإن أضعاف تحريض تكرار β خلايا غير متناسقة عبر التجارب ويسمح فعالية مركب يمكن مقارنة موثوق عبر التجارب. تجدر الإشارة إلى أن معدل تكرار α خلايا أقل ~ 5 مرات من معدل تكرار β خلايا والثقافات تحتوي ~ 1/3 العديد من α الخلايا كخلايا بيتا؛ وبالتالي، زادت يعرض مؤشر تكرار α خلايا تقلب بالمقارنة مع مؤشر تكرار β-الخلية. للحد من التقلبات، وصور لكل بئريتم زيادة من 49 (المستخدمة هنا) لمدة أقصاها 81.
الشكل 1: معزولة ومتفرقة الجرذ الفشوت. (أ) صورة مجهرية من صحية الجزر الفئران المعزولة. شريط 100 ميكرون نطاق مبين. (ب) الميكروسكوب (5X و10X أهداف) من الجزر الفئران فرقت 1 ساعة بعد الطلاء. 100 ميكرون (يسار) و 200 ميكرون (يمين) مقياس الحانات مبين. (C) الميكروسكوب (5X و10X أهداف) من الفئران المشتتين الجزر 48 ساعة بعد الطلاء. 100 ميكرون (يسار) و 200 ميكرون (يمين) مقياس الحانات مبين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد الآلية من PDX-1 + + الخلايا جزيرة. (أ) الخلايا المعالجة مجمع جزيرة الفئران المشتتين الملون لPDX-1. وحلقت PDX-1 + الأشياء باللون الأزرق. وحلقت الأجسام استبعاد باللون البرتقالي. شريط حجم 150 ميكرون تظهر. (ب) نفس المجال من جزيرة خلايا الملون لكي-67. PDX-1 + كي-67 + وحلقت خلايا مزدوجة إيجابية باللون الأخضر. شريط حجم 150 ميكرون هو مبين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): يتم تحديد الآلية تحديد تكرار خلايا بيتا تكرار خلايا بيتا التي كتبها دابي (الزاوية اليسرى العلوية، والدوائر الزرقاء)، PDX-1 (الركن الأيمن العلوي، الدوائر الخضراء)، الانسولين (الركن السفلي الأيسر، أرجواني الدوائر) وكي-67 (الركن الأيمن السفلي، الدوائر الحمراء) المشارك هxpression. الصورة المدمجة (يمين) معارض عدة تكرار β-الخلايا. شريط حجم 150 ميكرون هو مبين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (4): يتم تحديد الآلية تحديد تكرار خلايا ألفا تكرار خلايا ألفا التي كتبها دابي (الزاوية اليسرى العلوية، والدوائر الزرقاء)، وغياب PDX-1 (الركن الأيمن العلوي، الدوائر الخضراء)، الجلوكاجون (السفلي الأيمن الزاوية، والدوائر أرجواني) وكي-67 (الركن الأيمن السفلي، دائرة حمراء) شاركت في التعبير. الصورة المدمجة (يمين) يظهر صدرة تكرار نادرة من α خلايا (السهم الأصفر). شريط حجم 150 ميكرون هو مبين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: ديبيريدامول يدفع PDX-1 + - والنسخ المتماثل β-الخلية ولكن ليس النسخ المتماثل خلايا ألفا التمثيل البياني للPDX-1-الخلية (أعلى اليسار)، β-الخلية (أعلى اليمين) وα خلايا (أسفل اليسار) وترد تكرارها في DMSO- والآبار المعالجة ديبيريدامول. تمثل بارات متوسط الآبار التي تمت معالجتها بشكل مستقل (PDX-1 تكرارها، ن = 8؛ β خلايا وتكرار α خلايا، ن = 4). أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري (* P <0.01). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| ا. | العلاج: | تلطيخ: | |
| 4 | 5 | ||
| C | [دمس] | ديبيريدامول | الأنسولين، دابي، PDX-1، كي-67 |
| د | [دمس] | ديبيريدامول | الأنسولين، دابي، PDX-1، كي-67 |
| ه | [دمس] | ديبيريدامول | الأنسولين، دابي، PDX-1، كي-67 |
| F | [دمس] | ديبيريدامول | الأنسولين، دابي، PDX-1، كي-67 |
| G | [دمس] | ديبيريدامول | الجلوكاجون، دابي، PDX-1، كي-67 |
| H | [دمس] | ديبيريدامول | الجلوكاجون، دابي، PDX-1، كي-67 |
| أنا | [دمس] | ديبيريدامول | الجلوكاجون، دابي، PDX-1، كي-67 |
| J | [دمس] | ديبيريدامول | الجلوكاجون، دابي، PDX-1، كي-67 |
| ب. | عدد PDX-1 + خلايا | ||
| [دمس] | ديبيريدامول | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 5158 | 6249 | |
| د | 6365 | 6795 | |
| ه | 4830 | 6974 | |
| F | 5988 | 6408 | |
| G | 5574 | 6532 | |
| H | 5939 | 6411 | |
| أنا | 5612 | 6387 | |
| J | 4862 | 5759 | |
| في المئة من PDX-1 + كي-67 + الخلايا | |||
| [دمس] | ديبيريدامول | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3.04 | 9.99 | |
| د | 3.91 | 10.57 | |
| ه | 2.51 | 8.58 | |
| F | <td> 3.7710.14 | ||
| G | 3.44 | 10.1 | |
| H | 3.06 | 10.69 | |
| أنا | 3.58 | 9.07 | |
| J | 3.52 | 11.74 | |
الجدول 1: الممثل الخطة التجريبية وPDX-1 + -Cell بيانات النسخ المتماثل. ويرد (A) الخطوط العريضة للخطة العلاج. وعولج الآبار مع DMSO (العمود 4) أو ديبيريدامول (العمود 5). تم تنفيذ تلطيخ مع دابي، ومكافحة PDX-1، المضادة للأنسولين (حروف العادي) أو مكافحة الجلوكاجون (حروف مائل) وكي-67 (ب) عدد PDX-1 + خلايا (أعلى، دابي +وتظهر PDX-1 +) لكل بئر ونسبة تكرار PDX-1 الخلايا (أسفل، دابي + PDX-1 + كي-67 + / + دابي PDX-1 + × 100) لكل بئر.
| الحدث 1: | |||
| [دمس] | ديبيريدامول | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3557 | 4352 | # دابي (+) PDX-1 (+) الأنسولين (+) |
| د | 4387 | 4542 | # دابي (+) PDX-1 (+) الأنسولين (+) |
| ه | 3462 | 4879 | # دابي (+) PDX-1 (+) الأنسولين (+) |
| F | 4315 | 4585 # دابي (+) PDX-1 (+) الأنسولين (+) | |
| G | 1594 | 1567 | # دابي (+) PDX-1 (+) الجلوكاجون (+) |
| H | 1477 | 1439 | # دابي (+) PDX-1 (+) الجلوكاجون (+) |
| أنا | 1491 | 1390 | # دابي (+) PDX-1 (+) الجلوكاجون (+) |
| J | 1298 | 1474 | # دابي (+) PDX-1 (+) الجلوكاجون (+) |
| الحدث 2: | |||
| [دمس] | ديبيريدامول | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 113 | 425 | # دابي (+) PDX-1 (+) الأنسولين (+) كي-67 (+) |
| د | 152 | 511 | # دابي (+) PDX-1 (+) الأنسولين (+) كي-67 (+) |
| ه | 97 | 466 | # دابي (+) PDX-1 (+) الأنسولين (+) كي-67 (+) |
| F | 163 | 504 | # دابي (+) PDX-1 (+) الأنسولين (+) كي-67 (+) |
| G | 13 | 9 | # دابي (+) PDX-1 (+) الجلوكاجون (+) كي-67 (+) |
| H | 10 | 9 | # دابي (+) PDX-1 (+) الجلوكاجون (+) كي-67 (+) |
| أنا | 6 | 11 | # دابي (+) PDX-1 (+) الجلوكاجون (+) كي-67 (+) |
| J | 12 </ م> | 7 | # دابي (+) PDX-1 (+) الجلوكاجون (+) كي-67 (+) |
| ٪ التكرار: | |||
| [دمس] | ديبيريدامول | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3.18 | 9.77 | |
| د | 3.47 | 11.25 | |
| ه | 2.8 | 9.55 | |
| F | 3.78 | 10.99 | |
| G | 0.82 | 0.57 | |
| H | 0.68 | 0.63 | |
| أنا | 0.4 | 0.79 | |
| J | 0.92 | 0.48 | |
الجدول 2: الممثل β خلايا وα خلايا بيانات النسخ المتماثل إجمالي عدد β خلايا (الحدث 1: دابي + PDX-1 + الأنسولين +، أعلى صفوف الجدول CF، حروف العادي).)، α خلايا (الحدث 1 : دابي + PDX-1 + الجلوكاجون +، أعلى صفوف الجدول GH، حروف مائل)، تكرار خلايا بيتا (الحدث 2: دابي + PDX-1 + الأنسولين + كي-67 +، صفوف الجدول الأوسط CF، حروف العادي) وα -cells (الحدث 2: دابي + PDX-1 + الجلوكاجون + كي-67 +، صفوف الجدول الأوسط GH، حروف مائل)لكل بئر ترد. بالإضافة إلى ذلك، فإن نسبة تكرار بيتا الخلايا (دابي + PDX-1 + الأنسولين + كي-67 + / دابي + PDX-1 + الأنسولين + × 100، أسفل صفوف الجدول CF، حروف العادي) والخلايا α (دابي + PDX -1 + الجلوكاجون + كي-67 + / + دابي PDX-1 + الجلوكاجون + × 100، وتظهر صفوف الجدول السفلي GJ، حروف مائل) لكل بئر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطرق التجريبية لدراسة المسارات الجزيئية التي تتحكم في نمو الخلايا وبيتا وتجديد أدوات مهمة للباحثين مرض السكري. هنا، يتم تقديم منصة الفحص القائمة على الفئران جزيرة لتحديد وتوصيف التحفيز والتشجيع جزيء صغير من تكرار β-الخلية.
في حين يتم تنفيذ معظم جوانب هذا البروتوكول بسهولة من قبل الباحثين من ذوي الخبرة، تتطلب خطوات قليلة تقنية معينة. أولا، خلال عزل خلايا البنكرياس، إقناء؛ إدخال القنية من الصفراء-القناة دون تعطيل سلامتها يتطلب الممارسة. استراتيجية مفيدة هي لتضخيم الحد الأدنى من القناة الصفراوية لضمان تحديد المواقع المناسبة من الإبرة قبل الاستغناء تماما الحل الهضم البنكرياس. ثانيا، كفاءة العزل جزيرة من الأنسجة الإفرازية تتطلب اهتماما وثيقا لمدة الهضم والتحريض المناسب. يجب توخي الحذر لضمان تسخين حتى في جميع أنحاء هضم من خلال دوامات متقطعة. ثالثا، نجاح التجربة يتوقفالصورة على التمييز يتقن بين الجزر والحطام الإفرازية أثناء اليدوي جزيرة قطف. تحسن هذه المهارة مع الممارسة. رابعا، يتم تشتت جزيرة والطلاء بحيث منتشرة جميع الجزر في خليط من الخلايا وحيدة ومجموعات صغيرة من اثنين أو ثلاثة من الخلايا. فوق وتحت الهضم من الجزر قبل الطلاء تتداخل مع الأداء التجريبي. وينبغي أن تكون مطلية حديثا خلايا جزيرة حوالي 50٪ متموجة قبل أن تنتشر وسمح لنعلق على مدى ساعة 48 دون أن بالانزعاج. يوضح الشكل (1) ومظهر نجاح زراعة الخلايا جزيرة في أوقات مختلفة بعد الطلاء. خامسا، تتم التغييرات الوسائط للثقافات جزيرة خلايا بعناية لتجنب تعطل الخلايا الملتصقة ضعيف. سادسا، يجب أن يتم استرجاع مستضد بحذر لتجنب تشويه لوحة متعددة جيدا لكن بما فيه الكفاية لتمكين الناجح كي-67 تلطيخ وهي حساسة لكلا الناقص والإفراط في التعرض لارتفاع درجة الحرارة؛ لوحات مشوه لا يمكن أن تستخدم لالحصول على الصور الآلي. ملاحظة، والإفراط في البنكرياس الهضم، والتعرض لحطام الأنسجة الإفرازية و / أو trypsinization هي الأسباب الشائعة لفشل ثقافة جزيرة خلايا.
واحد الحد من هذا البروتوكول هو الاعتماد على علامات التعبير محددة لهوية β خلايا والأحداث النسخ المتماثل. استخدام علامات واحدة لديه القدرة على أن تكون مضللة. على سبيل المثال، يتم التعبير عن PDX-1 بواسطة β خلايا، مجموعة فرعية من δ الخلايا، معربا عن السوماتوستاتين والأسلاف β-الخلية 29،30. وبالتالي، والمركبات التي تزيد من تكرار PDX-1-خلية قد تكون تعمل خصيصا على السكان غير β-الخلية. ونتيجة لذلك، دراسات تأكيدية التي تستخدم علامات β خلايا بديلة ضرورية. وبالمثل، كي-67 التعبير ليست علامة مثالية للنسخ المتماثل ومؤشرات إضافية مثل BrdU والفوسفات-هيستون 3 ينبغي أن تستخدم 31. والقيد الثاني من هذا الاختبار هو أن المركبات التي تحفز تكرار β-الخلية قد simultaneزيادة ously الخلايا خلايا بيتا أو إلغاء التمايز. وبالتالي، فمن المهم لتقييم ما إذا كان المركب يستحث زيادة مطلقة في عدد β خلايا، و / أو يحرض الخلايا خلايا بيتا وعما إذا خلايا β المعالجة مجمع تحتفظ ظيفة عادية (حفز إفراز الأنسولين الجلوكوز) 32. والقيد الثالث من هذا الاختبار هو الإنتاجية المتواضعة المرتبطة باستخدام جزيرة الخلايا الأولية؛ الجزر من ستة الفئران يولد 228 بئرا التجريبية التي تسمح ~ 55 المجمعات التي سيتم فرزهم في quadruplicate (بالإضافة إلى الضوابط الإيجابية والسلبية). قيود إضافية على منصة خلايا بيتا فحص تكرار وصفها هو استخدام الجزر الفئران بدلا من الجزر الإنسان. الاختلافات بين الجزر الإنسان والفئران هي كافية لتتطلب أن جميع المركبات ودعم تكرار حددت باستخدام وأكد الثقافات الفئران جزيرة باستخدام الثقافات جزيرة الإنسان. ومع ذلك، ونظرا لمحدودية، وارتفاع تكلفة الجزر الإنسان، غربلة أولية مع ط البشريslets غير عملي بالنسبة لمعظم الباحثين.
المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هي: 1) استخدام الجزر الأولية المعزولة حديثا للحفاظ على قيود النمو الطبيعي إلى أقصى حد ممكن، 2) استخدام شكل 384 بئر للسماح فحص سرعة معتدلة (عادة الجزر المعزولة من ستة الفئران تكفي ل 228 بئرا) و 3) استخدام الحصول على الصور الآلي وتحليل لتسريع وتيرة التجريب وللحد من التحيز. على النقيض من ذلك، النهج البديلة التي يشيع استخدامها تعتمد على الحصول على الصور اليدوية وتقييم شخصي لأحداث النسخ المتماثل β-الخلية أو كله جزيرة دمج ثيميدين المشعة التي لا تميز بين الخلايا linages، مثل الخلايا الليفية مقابل تكرار β-الخلية 15،17. وبالتالي، يمثل بروتوكول المعروضة أداة هامة ومحسنة لتحقيق نمو التنظيم من β-الخلايا.
نحن نتصور مجموعة متنوعة من تكييفهايستخدم لهذا النظام الأساسي الفرز. أولا، زيادة مطلقة في عدد β خلايا يمكن قياسها عن طريق حساب عدد من PDX-1 + - أو الأنسولين + -cells. لحساب التغير في عدد الخلايا مطلي لكل بئر عددا أكبر من مكررات لكل حالة قد يتم تضمين (عادة ن = 8). ثانيا، يمكن تكييفها منصة ل overexpression القائم الفيروسة البطيئة أو خروج المغلوب / لأسفل التجارب لتحديد المسارات المتضمنة في النسخ المتماثل β-الخلية. وباختصار، فإن تقنية تجريبية وصفه مفيدة على نطاق واسع لتحديد المركبات والمسارات الجزيئية التي تنظم تكرار خلايا بيتا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 g male Male Sprague Dawly Rat | Charles River | Stain # 400 | |
| 12 cm teeth tisuue forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 11.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| 14.5 cm surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | |
| 16 cm curved forceps | Fine Science Tools | 11003-16 | |
| 12 cm curved hepostat | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| 12 cm scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Tissue sieve-30 mesh | Bellco Glass | 1985-85000 | |
| Cizyme RI, 375,000 CDA units | VitaCyte | 005-1030 | |
| Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) | Gibco | 24020-117 | |
| Ketamine HCl (200 mg/20 ml) | JHP Pharmaceuticals | NDC# 42023-113-10 | to make anesthetic cocktail |
| Xylazine (5 g/50 ml) | LLOYD | NADA# 139-236 | to make anesthetic cocktail |
| Histopaque 1077 | Sigma | H-1077 | to make histopaque 1100 |
| Histopaque 1119 | Sigma | H-1119 | to make histopaque 1100 |
| Newborn Calf Serum 500 ml | Hyclone | SH30118.03 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Hyclone | SH30268.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose | Hyclone | SH30021.01 | |
| Functionality/Viability Solution | Mediatech | 99-768-CV | |
| RPMI1640 media | Hyclone | SH30096.01 | to make conditioned medium |
| 804G rat bladder carcinoma cell-line | Available upon request | to make conditioned medium | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 26160 | |
| GlutaMax-I | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml) | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Formamide 500 ml | Fisher BioReagents | BP227-500 | |
| Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0) | Vector Laboratories | H-3300 | to make 0.15 M Sodium Sitrate solution |
| Dextrose, Anhydrous | EMD Chemicals | DX0145-1 | to make 1 M glucose solution |
| Nomal Donkey Serum (Powder) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Mouse anti-human Ki67 antibody | BD Biosciences | 556003 | |
| Goat anti-human PDX-1 antibody | R&D Systems | AF2419 | |
| Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody | Dako | 2016-08 | |
| Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody | Dako | 2014-06 | |
| Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody | Dako | 2011-08 | |
| Polyclonal chicken anti-vimentin antibody | abcam | ab24525 | |
| Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | |
| StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated | Invitrogen | S32354 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-025-147 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-025-148 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-025-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-175-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG | Jackson ImmunoResearch | 703-175-155 | |
| DAPI | Millipore | S7113 | |
| Disposable Reagent Reservoir 25 ml | Sorenson BioScience | 39900 | |
| 384 well, black/clear, tissue culture treated plate | BD Falcon | 353962 | |
| 96 well, black/clear, tissue culture treated plate | Costar | 3603 | |
| Multi-channel pipettor | Costar | 4880 | |
| 12-channel vaccume aspirator | Drummond | 3-000-096 | |
| Cell Scraper | Falcon | 353085 | |
| Isotemp Water Bath Model 2223 | Fisher Scientific | ||
| High-content screening instrument: ArrayScan VTI | Thermo Scientific |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited. Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).
- Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. Current advances and travails in islet transplantation. Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).
- Nath, D. S., et al. Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).
- Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. Adult tissue sources for new beta cells. Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause. Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Meier, J. J., et al. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).
- Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures. Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).
- Brelje, T. C., Sorenson, R. L. Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy. Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).
- Chen, H., et al. PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells. Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).
- Liu, H., et al. Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets. Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).
- Metukuri, M. R., et al. ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation. Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).
- Wang, P., et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).
- Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
- Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets. J Vis Exp. (64), (2012).
- Walpita, D., et al. A human islet cell culture system for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).
- Miyazaki, J., et al. Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms. Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).
- Song, W. J., et al. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A). J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).
- Cozar-Castellano, I., et al. Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines. Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).
- Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).
- Wang, W., et al. Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).
- Annes, J. P., et al. Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).
- Zhao, Z., et al. Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication. Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).
- Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents. PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).
- Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells. Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochem J. 310, (Pt 3) 997-1003 (1995).
- Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus. Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).
- Rieck, S., et al. Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets. Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).
- Wang, P., et al. Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation. Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).
