Summary
Cruciale uitdagingen voor het onderzoeksgebied diabetes zijn de moleculaire mechanismen die eilandje β-cellen replicatie en op werkwijzen voor het stimuleren van β-celregeneratie ontwikkelen begrijpen. Hierin een high-gehalte screening methode voor het identificeren en evalueren van de β-cel-replicatie bevorderende activiteit van kleine moleculen wordt gepresenteerd.
Introduction
Diabetes omvat een verzameling van aandoeningen delen de gemeenschappelijke eindpunt van verstoorde glucose homeostase. Hoewel de pathogene mechanismen van diabetes subtypen worden onderscheiden, delen ze het gevolg van verminderde β-celmassa, bijvoorbeeld, verlies van insulineproductie capaciteit 1,2. Momenteel diabetes behandelingsstrategieën vertrouwen op chronische toediening van exogeen insuline, farmacologische stimulering van insulineproductie of verbetering van de insulinegevoeligheid, en zelden, de transplantatie van pancreaseilandjes of hele alvleesklier 3,4. Helaas, het succes van deze strategieën is van korte duur en / of niet voldoende herhalen de functie van endogene productie van insuline. Ondanks het nut van het ontwikkelen van een werkwijze voor β-celregeneratie te stimuleren, bestaat een dergelijke benadering. Bijgevolg is een belangrijk onderzoek naar diabetes doel is om methoden te ontwikkelen om nieuwe β-cellen te genereren of om endogene β-cell mass 5 uit te breiden 6,7. Belangrijk is dat de belangrijkste bron van nieuwe β-cellen in vivo bestaande β-cellen in plaats van gespecialiseerde progenitorcellen 8,9. Hoewel β-cellen blijken beperkte replicatie capaciteit, een kleine toename van β-celmassa hebben (~ 30%) kan voldoende zijn om glucose homeostase te herstellen in vele diabetici. Verder in situ farmacologische stimulering van β-celmassa is een potentieel goedkope en schaalbaar behandelingsstrategie. Hierin a high content werkwijze voor het identificeren en karakteriseren van kleine moleculen die de groei β-cellen stimuleren gepresenteerd.
Verscheidene in vitro experimentele werkwijzen kunnen worden gebruikt om genproducten en / of moleculen tha identificerent bevorderen primaire β-cel-replicatie. Vroege inspanningen voor het meten van β-cel-replicatie inductie gebruikt foetale knaagdier alvleesklieren cultuur of intacte geïsoleerde eilandje culturen te meten [3 H] thymidine, BrdU incorporatie of mitotische instanties binnen de aldehyde-thionine of insuline gebeitst bevolking in reactie op de specifieke behandeling voorwaarden 10, 11. Deze in vitro benaderingen en dicht varianten daarvan hebben een aantal beperkingen. Prominente deficiënties omvatten (1) het gebruik van foetale cellen die in tegenstelling tot rijpe β-cellen vertonen een hoge basale β-cel replicatiesnelheid en zijn groei gereguleerd een onderscheidende wijze 12; (2) de persoonlijke aard van de experimentator-afhankelijke berechting van β-cel-replicatie gebeurtenissen; (3) de arbeids- en tijdrovende karakter van de experimentator-afhankelijke tellen van β-cel-replicatie gebeurtenissen vertraagt experimentele throughput; (4) het gebruik van nucleaire inbouw / vlek / verschijning aan replicatie zelfs te identificerents en een niet-overlappende cytoplasmatische vlek β-cellen te identificeren leidt tot onterechte opname van nabij non-β-cel replicatiegebeurtenissen aan P-cellen.
Recenter rijpe primaire β-cellen werden gebruikt om het effect van transgene overexpressie alsmede genproduct of samengestelde behandeling op β-celdeling 13-16 beoordelen. Echter, deze studies ook ingeroepen subjectief tellen van replicatie gebeurtenissen, cytoplasma staining- of niet-specifieke methoden voor β-cell identificatie en / of arbeidsintensieve stappen die throughput te beperken, bijvoorbeeld afzonderlijke dia-en beplating van cellen of intacte eilandje paraffine inbedding en 17 verwerking. Met name, een beeld-gebaseerde humane β-celdeling screening methode, vergelijkbaar met de hierin gepresenteerde, is gepubliceerd 18; echter succesvol gebruik van deze assay niet aangetoond en het gebruik van menselijke eilandjes voor primaire screening niet ruim worden fealijk.
Een alternatieve strategie voor het identificeren van replicatie-bevorderende stoffen naar groei inductie van β-cellijnen te beoordelen. Initiële inspanningen gebruikt getransformeerde β-cellijnen zoals MIN6 cellen of INS 832/13-cellen 14,19-21. Echter, deze cellijnen demonstreren ongebreidelde groei en dragen weinig gelijkenis met goed gedifferentieerd β-cellen 22. Bijgevolg groei-inductie capaciteit is minimaal, onduidelijke relevantie en soms moeilijk te recapituleren. Een verbeterde strategie cellijn screening maakt gebruik van "reversibel getransformeerde" cellen die groei aangehouden in de afwezigheid van tetracycline (doxycycline) -afhankelijke SV40 T antigen expressie 23,24 zijn. Het is echter onduidelijk of deze cellen terugkeren naar een "normale" β-cel-achtige toestand na verwijdering doxycycline. Helaas, gebruik van deze cellen heeft opgeleverd algemene groeibevorderende stoffen die niet op onmiddellijk nut hebben24. Kortom, het gebruik van cellijnen groeiregulatie van een celtype weergave minimale spontane replicatie -activiteit kan beperkte toepasbaarheid hebben.
De β-cel-replicatie screening platform hierin gepresenteerd maakt gebruik van volwassen primaire rat β-cellen te behouden in vivo groei regelgeving voor zover mogelijk, eilandje-celkweken van gemengde cel-type samenstelling om identificatie van-lijn beperkt groeibevorderende activiteiten mogelijk te maken, multi -goed formatteren om de doorvoer en geautomatiseerde analyse te maximaliseren om vertekening te elimineren en de doorvoer te vergemakkelijken. Succesvol gebruik van dit platform is de identificatie van een aantal verbindingen die β-celdeling 25,26 bevorderen ingeschakeld. Daarnaast is de test is gebruikt voor de structuur-activiteit relatie studies en chemische epistasie experimenten om mechanistische inzichten in de moleculaire regulatie van β-cel-replicatie bieden. De gepresenteerde platform is met succes aangepast for lentivirale RNAi-based onderzoek naar β-celdeling trajecten 25. Beperkingen van de test omvatten geblokkeerde schaalbaarheid (gebruik van primaire cellen), gebruik van knaagdier plaats menselijke eilandjes-cellen (hoewel de test kan worden aangepast voor menselijk eilandje studies), kosten in verband met antilichamen gebaseerde beeldvorming en primaire eilandje gebruik, het gebruik van verspreide eilandjes (verstoord eilandje architectuur) om geautomatiseerde image Acquisition en de afhankelijkheid van de beschikbaarheid van een geautomatiseerde microscoop met het verwerven en analyseren vermogen vergemakkelijken. Hoewel een gemakkelijke in vivo screening methode voor het identificeren van genproducten of verbindingen die β-cel regeneratie in situ te stimuleren zou ideaal zijn, zoals een platform is nog niet beschikbaar 27. Bijgevolg is de beschreven platform is geschikt voor onderzoeker geïnteresseerd in het onderzoeken van de meeste aspecten van β-cel-replicatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol werd uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Stanford University School of Medicine uitgevoerd. De beschreven protocol wordt opgeschaald voor eilandje isolatie van zes 250-300 g (8-9 weken oude) mannelijke Sprague Dawley-ratten, die voldoende is om 228 putjes van een 384-wells plaat eilandjes celdeling assessment genereren.
1. Materiaal Voorbereiding
- Bereid coating media voorafgaand aan het initiëren eilandje isolement door het verzamelen van de geconditioneerde media van 804G rat blaas carcinoma cellen gehandhaafd op samenvloeiing gedurende 3 dagen (20 ml RPMI1640) in een 15 cm weefselkweek schotel 28. Steriel filter en opslag (-20 ° C) geconditioneerde media voor later gebruik.
- Steriliseren chirurgische instrumenten (een 12 cm getande weefsel tang, een 11,5 cm fijn schaar, een 14,5 cm chirurgische schaar, twee 16 cm gebogen pincet, een 12 cm gebogen hemostat, een 12 cm scalpel handvat) en een 30 mesh weefsel zeef voorafgaand aan initiating eilandje isolement.
- Bereid pancreatische digestie oplossing door het oplossen van een 60%: 40% mengsel van gezuiverde klasse I: klasse II collagenase (totale collagenase activiteit van 300.000 - 400.000 eenheden) in 60 ml 1 x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), aangevuld met calcium en magnesium. Load 10 ml van de pancreas spijsvertering buffer in 10 ml spuiten (zes) met een 1 "22 G naald en leg ze op ijs.
Opmerking: 10 ml ontsluitingsoplossing geïnjecteerd per rat. Schaal dienovereenkomstig. - Bereid 4,5 ml anestheticum cocktail in een zuurkast door het mengen van 1,3 ml ketamine (100 mg / ml), 0,2 ml xylazine (100 mg / ml) en 3 ml PBS. Bereid de verdoving cocktail binnen 1 uur van het initiëren eilandje isolement.
- Bereid wasbuffer door toevoeging van 25 ml van pasgeboren kalfsserum tot 500 ml HBSS. Plaats wasbuffer op ijs voor later gebruik.
- Bereid 1 fles eilandje medium dat 500 ml van laag glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 50 ml foetaal runderserum (FBS), 5000 eenheden / ml penicilline en 5000 ug / ml streptomycine.
- Bereid eilandje functie medium van functionaliteit / levensvatbaarheid oplossing (500 ml) met 2% FBS, 2 mM glutamine, 5 mM glucose, 5000 eenheden / ml penicilline en 5000 ug / ml streptomycine. Bewaar het eilandje functie media (4 ° C) voor later gebruik.
- Bereid 40 ml blokkerende buffer door toevoeging van 2,5 ml donkey serum en 0,12 ml Triton X-100-37,38 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Store blokkerende buffer (4 ° C) voor later gebruik.
- Het verkrijgen van de benodigde antistoffen voorafgaand aan het initiëren van het protocol.
Opmerking: PDX-1 (TRITC) en Ki-67 (FITC) co-kleuring wordt gebruikt voor primaire β-celdeling screening. Voor lineage-specifieke replicatie analyse uit te voeren immunofluorescentiekleuring voor een extra cel identiteit markers (insuline, glucagon, vimentine en somatostatine; TRITC) samen met kernenergie (DAPI), PDX (Cy5) en Ki-67 (FITC) kleuring. alternatieve repmaking markers, bijvoorbeeld PCNA, kunnen eveneens worden gebruikt. - Bereid een 228-well behandelplan met elke behandeling aandoening uitgevoerd in viervoud. Inclusief positieve- (5-Iodotubercidin [1 uM] of dipyridamol [15 pm]) en voertuig-control (DMSO 1: 666 verdunning) putten.
2. Perfusie van de alvleesklier
- Verdoven ratten door ip injectie van verdund anestheticum cocktail oplossing (0,30 ml / 100 g lichaamsgewicht). Zodra de rat is volledig verdoofd en reageert op schadelijke stimuli, uit te voeren cervicale dislocatie.
- Plaats de rat gedood in rugligging (craniale-caudale richting) op een stapel papieren handdoek en spuit de buikstreek met 70% ethanol.
- Open de buikholte van een U-incisie (base bij schaamstreek) en schuif huid in de rostrale richting over de borst te buikholte bloot.
- pak voorzichtig de twaalfvingerige darm met behulp van twee paar gebogen pincet, zoek de twaalfvingerige darm ingang van de gemeenschappelijke bile kanaal (sfincter van Oddi) en klem de duodenale opening aan de papil met een gebogen hemostaat.
- Til de gebogen hemostaat gebruikt om de galbuis papilla klem en pak de galwegen in de buurt van de lever met behulp van een gebogen pincet. Stompe dissectie met de gebogen forceps te isoleren en bloot de galwegen.
- Plaats de rat met het hoofd proximale en de distale voeten.
- Canule de galbuis (CBD) op of net distaal van de kruising van de blaas en hepatica kanalen met een pancreas verteringsoplossing -geladen 10 ml spuit en injecteer langzaam 10 ml van de pancreas ontsluitingsoplossing. Tijdens het injecteren, ondersteuning van de CBD met een scalpel handvat. Verplaats de naald als het kanaal en de alvleesklier niet op te blazen.
- Verwijder de opgeblazen pancreas met de gebogen pincet en fijne schaar te scheiden van de dalende dikke darm, ingewanden, maag en milt. Plaats de opgeblazen alvleesklier op ijs in een 50 ml buis met 5 ml
3. Dissociatie van de alvleesklier
- Zodra alle alvleesklieren worden verzameld, plaatst u de spijsvertering buizen in een 37 ° C waterbad gedurende 15 min. Zwenk de buizen om de 3 min.
- Na 15 min, krachtig schudden (verticaal) de buizen 10 keer en voeg 10 ml koud wasbuffer. Schud de buizen een extra 5 keer en plaats op ijs.
- Vul het spijsvertering buizen tot 50 ml met koude wasbuffer en mix door het omkeren buizen 5 keer.
- Centrifugeer de buizen bij 97 xg bij 4 ° C gedurende 1 min en giet het supernatant. Wees voorzichtig niet om het ingehulde weefsel te verwijderen.
- Voeg 25 ml wasbuffer en resuspendeer het weefsel door voorzichtig vortexen. Herhaal stap 3.4 en 3.5 nog twee keer.
- Plaats een 30 mesh weefsel zeef over een sterile bekerglas van 250 ml en giet het weefsel schorsing op de zeef. Spoel de spijsvertering buis met een extra 20 ml wasbuffer en giet op het gaas. De onverteerd pancreas en vetweefsel verwijderd bij deze stap.
- Giet het gefilterde materiaal in twee verse 50 ml buis en pellet het weefsel door het draaien bij 97 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. Giet supernatant en omkeren buisjes om overtollig buffer uitlekken.
4. Zuivering van eilandjes
- Voeg 20 ml koud polysucrose / natrium diatrizoaat oplossing (1,119 g / ml dichtheid) aan de gepelleteerde pancreas weefsel. Homogeen resuspendeer de inhoud van elke buis door zachtjes en neer te pipetteren vijf keer.
- Voorzichtig overlay de polysucrose / natrium diatrizoaat oplossing met 10 ml HBSS. Zorg voor een scherpe vloeistof-interface door het langzaam toevoegen van de HBSS langs de buiswand.
- Centrifugeer de gedigereerde pancreata bij 560 xg gedurende 15 min (4 ° C) met langzame versnelling en zonder rem.
- Collect het eilandje laag van de interface met behulp van een 10 ml pipet en plaats eilandjes in verse 50 ml buizen. Do eilandjes niet bundelen in dit stadium.
- Voeg 40 ml wasbuffer aan elk 50 ml buisje en centrifugeren gedurende 1 min bij 140 xg bij 4 ° C.
- Giet het supernatant en resuspendeer samengevoegd eilandjes in 50 ml wasbuffer met een paar keer omkeren van de buizen. Centrifugeer de buizen gedurende 1 min bij 97 xg bij 4 ° C om eilandjes te verzamelen in een pellet.
- Giet het wasbuffer en herhaal het wassen. Breng eilandjes in de weefselkweek kap en zuig het supernatant.
- Resuspendeer elk buisje eilandjes in 6 ml eilandje medium.
- Breng de eilandjes van elk 50 ml buis in een putje van zes-putjes weefselkweekplaat. Zwenk de 6-putjes op eilandjes verzamelen in het midden van de put en observeren eilandje kwaliteit en zuiverheid onder een microscoop.
- Handmatig verzamelen eilandjes met een 1 ml pipet overgebracht geplukte eilandjes in de naastliggendeputje met 6 ml eilandje media. Herhaal eilandje wervelende plukken tot> 90% zuiverheid wordt verkregen.
- Breng de gezuiverde eilandjes een 10 cm weefselkweek schaal bevattende 20 ml medium eilandje.
- Plaats eilandjes in een weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende de nacht (Figuur 1A).
- Ter voorbereiding van plating eilandje cellen, de vacht van de putjes van een 384-wells plaat met 40 ul van 804G geconditioneerde media per goed. Incubeer overnacht in een weefselkweek incubator.
5. Verspreiding en Plating van Islet Cells
- De volgende dag, voorzichtig los eilandjes van de 10 cm schaal met een cel schraper en breng de eilandjes in een 50 ml buis.
- Pellet de eilandjes door centrifugatie gedurende 1 min bij 22 xg bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant.
- Spoel de eilandjes met 20 ml warme PBS en decanteer zoals hierboven.
- Re-schorten eilandjes in 0,25% trypsine (150 ul per rat pancreas) En incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Pipet eilandjes op en neer 10 keer met behulp van 1 ml pipet na 5 en 10 min incubatie.
- Na 10 min, evalueert een 20 pl monster van de trypsine eilandjes onder de microscoop om volledige digestie verzekeren en het eilandje cellen te tellen met een hemocytometer. Als onverteerd eilandjes blijven verder incuberen gedurende nog 3-5 min en pipet op en neer 10 keer. Indien nodig herhalen.
Let op: De typische opbrengst bedraagt ~ 125.000 - 150.000 eilandjes van Langerhans-cellen per rat. - Verwijder 804G-geconditioneerde media gecoate 384-wells plaat uit de incubator en verwijder de media met behulp van een 12-well spruitstuk aspirator.
- Schorsen eilandje cellen bij een dichtheid van 45.000 cellen per ml in medium Islet functie en plaat 70 pl (3150 cellen) per putje met een multichannel pipet (Figuur 1B).
Opmerking: Omdat β-cellen in de buitenste putjes neiging om te migreren naar de omtrek van de plaat gebruik rijen C en N kolommen 4tot 21-228 putjes met het eilandje cellen geïsoleerd uit 6 ratten bord. - Plaats de plaat in de weefselkweek incubator gedurende 48 uur celadhesie mogelijk.
6. Islet cel Cultuur Treatment, Fixatie en kleuring
- Bereid 200 pl medium en verbindingen (behandelingsomstandigheden worden uitgevoerd in viervoud) in een 2x concentratie in functie Islet medium. Regelen verbindingen in een steriele 96-putjes multi-well pipetteren vergemakkelijken.
- Verwijder voorzichtig eilandje medium met een 12-well spruitstuk aspirator en te vervangen door eilandje functie medium (35 ul / putje) met behulp van een 12-well pipet. Verwijderen en media uit een rij te vervangen in een tijd om het risico van het drogen (figuur 1C) te beperken.
- Initiëren behandeling door de overdracht van 35 ul / putje van de 2x samengestelde oplossingen. Keerplaat naar de incubator gedurende de duur 48 uur behandeling.
- Na 48 uur van de behandeling, decanteren de behandeling media door het omkeren van de plaat. </ Li>
- Voorzichtig te wassen het eilandje cellen met 50 ul per putje van 1x PBS (1 min). Voeg de PBS een multi-kanaal pipet.
- Decanteer de PBS en de cellen vast door toevoeging van 50 ul per putje van koude 4% paraformaldehyde (PFA) verdund in 1 x PBS. Incubeer cellen gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
- Was de cellen drie keer (5 min elk) door het omkeren van de plaat om de PFA te verwijderen en voorzichtig toevoegen van 60 pi PBS per putje zoals hierboven.
- Bereid 15 ml antigeenterugtrekking oplossing door het mengen van 14,25 ml formamide en 0,75 ml 0,15 M natriumcitraat (pH 6). Maak de antigen retrieval oplossing onmiddellijk voor gebruik.
- PBS verwijderen uit putten door omkeren van de plaat en voeg 60 ul antigen retrieval oplossing in elk putje. Verwarm de plaat in 70 ° C waterbad gedurende 45 min. Plaats een verwarmingsblok bovenop de plaat tijdens deze incubatie om kromtrekken van de plaat met meerdere holtes voorkomen.
Let op: Het water moet halverwege de plaat rok zijn; de plaat mag niet worden ondergedompeld. - Was de cellen met 60 ul per putje van 1x PBS drie keer (5 min elk). Voeg PBS met een multi-channel pipet en decanteer PBS door het omkeren van de plaat.
- Gebruik een multi-channel pipet 40 ul per putje toevoegen van blokkerende buffer en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de blokkerende buffer door het omkeren van de plaat en decanteren.
- Voeg 40 ul van muizen anti-humaan Ki-67 (1: 200) en geit anti-humaan PDX-1 (1: 100) antilichamen verdund in blokkerende buffer aan elk putje en incuberen bij 4 ° C overnacht.
- De volgende dag, giet het antilichaam-oplossing en was de cellen met 1x PBS driemaal (5 min elk) zoals hierboven beschreven. Schenk de PBS.
- Voeg 40 ul per putje van verdund (1: 200) gebiotinyleerd ezel anti-muis IgG en rhodamine-geconjugeerd ezel anti-geit IgG in blokkeerbuffer. Incubeer gedurende 1 uurop kamertemperatuur.
- Was de cellen met 1x PBS driemaal, 5 minuten elk. Voeg 40 pl verdund (1: 400 in blokkerende buffer) fluoresceïne geconjugeerd streptavidine aan elk putje. Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen met 1x PBS driemaal, 5 minuten elk. Voeg 40 ul per putje van DAPI (300 nM in blokkeerbuffer) en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen met 1x PBS tweemaal en laat cellen in 40 pl 1x PBS. De plaat is nu klaar om te worden geanalyseerd.
7. β-Cell Replication Analyse
Opmerking: Een test protocol moet worden vastgesteld voor het hoge gehalte screening microscoop gebruikt om β-celdeling te meten. In zijn eenvoudigste samenstelling, dit protocol Twee-color assay waarbij een identiteit marker wordt gebruikt om β-cellen te bepalen (PDX-1 + -cellen) en een replicatie marker (Ki-67) wordt gebruikt om celdeling gebeurtenissen definiëren.
- Identificeer voorwerpen (β-cellen) op basis van de average fluorescentie-intensiteit van PDX-1 kleuring (549 nm filter) binnen ongeveer een cirkel (lengte: breedte <1.6) binnen de verwachte pixel gebied van een β-celkern (Figuur 2A).
- Vervolgens stellen instellingen replicatiegebeurtenissen (Ki-67-positiviteit) op basis van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (485 nm filter) in de PDX-1 + gebied (figuur 2B) te identificeren.
Opmerking: Exposure tijden moet worden vastgesteld om pixel intensiteit vergelijkingen tussen beelden mogelijk te maken. Assay protocol parameters worden ingesteld, zodat de machine oproepen consequent uit te sluiten specifieke kleuring, puin en mobiele aggregaten die negatief zou kunnen beïnvloeden kwaliteit van de gegevens. - Analyseer minste 500 β-cellen per putje nauwkeurigheid en beperken variabiliteit maximaliseren.
Opmerking: De basale β-celdeling index rat eilandjes culturen verwachting 0,5 te zijn - 3%. Gewoonlijk 40 beelden per putje is meer dan voldoende om 500 β-cellen te identificeren. - Voorafgaand aan de analyse van dehele plaat, analyseren geselecteerde negatieve- (-DMSO behandeld) en positieve controle (5-iodotubercidin [1 uM] of dipyridamol [15 pm])-behandelde putten om de geldigheid van de test protocol te beoordelen. Wanneer de test correct is ingesteld, positieve controle verbindingen veroorzaken ten minste een tweevoudige verhoging van het percentage van β-replicerende cellen.
- Lees de hele plaat zodra de test protocol wordt gevalideerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om β-cel of α-cel-replicatie te beoordelen, is een vier kleuren assay protocol vereist. Eerst worden objecten geïdentificeerd met DAPI kleuring (kanaal 1, 386 nm). Vervolgens β-cellen (event 1) worden geteld: objecten die co-express PDX-1 + (kanaal 2, 650 nm) en peri-nucleaire insuline (kanaal 3, 549 nm). Vervolgens replicerende β-cellen (event 2) geteld: P-cellen (event 1) dat co-express Ki-67 (kanaal 4, 485 nm) (figuur 3). Het percentage van het repliceren van β-cellen wordt berekend: (event 2 / event 1) x 100. Om α-cel-replicatie te kwantificeren, zijn in totaal objecten geïdentificeerd door DAPI kleuring (kanaal 1) en vervolgens α-cellen (event 1) worden opgesomd door de afwezigheid van PDX-1 kleuring (kanaal 2) en de aanwezigheid van perinucleaire kleuring glucagon (kanaal 3). Replicerende α-cellen (event 2) zijn het aantal α-cellen die co-express Ki-67 (kanaal 4) (Figuur 4).Het percentage van het repliceren van α-cellen wordt berekend: (event 2 / event 1) x 100.
Alvorens de proef wordt een verbinding behandelplan gemaakt (Tabel 1A). Hier werd een kleinschalige test uitgevoerd met behulp van negatieve controle (DMSO-behandelde) en positieve controles (-dipyridamol behandeld [15 pm]) de voorwaarden voor PDX-1, β-cel en α-cel-replicatie in een 384-wells formaat (te beoordelen 49 beelden per well). Experimentele gegevens tonen dipyridamol om selectief te bevorderen PDX-1 +-cel en β-cel-replicatie, maar niet α-cel-replicatie. Het gemiddelde aantal geïdentificeerde PDX-1-cellen per putje was 5541 ± 555 voor DMSO behandelde en 6439 ± 363 voor dipyridamol behandelen ziekten (p <0,01); blijk van een dipyridamol-afhankelijke toename van PDX-1 het aantal cellen (Tabel 1B, boven). De gemiddelde procent PDX-1 +-cel-replicatie (DMSO + PDX-1 + Ki-67 + </ sup> / DMSO + PDX-1 +) is 3,35 ± 0,50% voor DMSO behandelde en 10,10 ± 0,98% voor dipyridamol behandelen ziekten (p <0,01) (Tabel 1B, onder). Belangrijker, er soortgelijke PDX-1 + -cel replicatie prijzen putjes vervolgens geanalyseerd op β-cellen (rijen CF) en α-celdeling (tr GJ): DMSO = 3,3 ± 0,66 (tr CF) en 3,4 ± 0,23 (tr GJ) (p = 0,80); dipyridamol = 9,8 ± 0,86 (rijen CF) en 10,4 ± 0.1.1 (rijen GJ) (p = 0,43). Dus deze putten, hoewel gekleurd voor andere cel-afstammingslijn merkers (insuline en glucagon), reageerde vergelijkbaar met behandeling met geneesmiddelen.
Naast de replicatie tarieven van β-α-cellen en cellen werden berekend uit de ruwe gegevens (tabel 2). Het gemiddelde aantal β-cellen (event 1) werd verhoogd in respons op behandeling dipyridamol: DMSO 3930 ± 488 vs. dipyridamol 4589 ± 218 (p <0,05). Met name is er een significante vermindering van het aantal β-cellen (3930 ± 488) in vergelijking met PDX-1-cellen (5541 ± 555) (p <0,01). Dit is een gevolg van de uitsluiting van PDX-1 + -cellen die insuline - van het aantal β-cellen, bijvoorbeeld δ-cellen of β-cellen progenitorcellen en de bijkomende stringentie die van β-cellen insuline + zijn. Met name heeft het aantal α-cellen (event 1) niet toe met dipyridamol behandeling (DMSO 1465 ± 123 vs dipyridamol 1467 ± 74,7; p = 0,93). Derhalve verhoogt dipyridamol selectief β-celaantal. Het aantal replicerende β-cellen (event 2) wordt verhoogd in respons op behandeling dipyridamol (DMSO 131 ± 31 vs. dipyridamol 476,5 ± 39,6; p <0,01), maar het aantal replicerende α-cellen (event 2) niet (DMSO 10.25 ± 3 vs. dipyridamol 9,0 ± 1,6; p = 0,5). Tenslotte het percentage replicerende β-ceLLS en α-cellen wordt berekend ((event 2 / event 1) x 100). Inderdaad, dipyridamol verhoogt het percentage replicerende β-cellen, maar niet α-cellen (samengevat in figuur 5). Belangrijk is dat de basale β-cel-replicatie snelheid van een gezonde cultuur varieert tussen experimenten (0,5-3%), maar moet zeer consistent putten binnen een experiment. Omdat de basale replicatie is variabel, de verbinding geïnduceerde β-cel-replicatie rate is ook variabel over experimenten; De vouw-inductie van β-cel replicatie consistent experimenten en maakt verbinding werkzaamheid betrouwbare wijze vergeleken in experimenten. Met name de α-celdeling rate is ~ 5 keer lager dan de β-cel-replicatie rate en culturen bevatten ~ 1/3 zoveel α-cellen als β-cellen; bijgevolg de α-celdeling index geeft grotere variabiliteit vergeleken met de β-celdeling index. Om variabiliteit te beperken, worden de afbeeldingen per putjewordt verhoogd van 49 (hier gebruikt) ten hoogste 81.
Figuur 1: De geïsoleerde en versnipperde Rat Eilandjes. (A) Een microscoop van gezond geïsoleerd rat eilandjes; 100 micrometer schaal bar getoond. (B) Microfoto (5X en 10X doelstellingen) van de verspreide eilandjes van ratten 1 uur na plating; 100 urn (links) en 200 urn (rechts) schaal balken. (C) Microfoto (5X en 10X doelstellingen) van verspreide rat eilandjes 48 uur na plating; 100 micrometer (links) en 200 micrometer (rechts) schaal bars getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Geautomatiseerde Identificatie van PDX-1 + + Islet Cells. (A)-verbinding behandeld verspreide rat eilandjes van Langerhans cellen gekleurd voor PDX-1. PDX-1 + objecten worden omcirkeld in blauw; uitgesloten objecten worden omcirkeld in oranje. Schaal bar van 150 micrometer getoond. (B) Hetzelfde gebied van de eilandjes van Langerhans-cellen gekleurd voor Ki-67. PDX-1 + ki-67 + dubbel-positieve cellen worden omcirkeld in het groen. Schaal bar van 150 micrometer getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Automatische Identificatie van repliceren β-cellen repliceren β-cellen worden geïdentificeerd door DAPI (linker bovenhoek, blauwe cirkels), PDX-1 (rechter bovenhoek, groene cirkels), insuline (links onderste hoek, magenta cirkels) en Ki-67 (de rechteronderhoek, rode cirkels) co-eXpression. De samengevoegde afbeelding (rechts) toont verscheidene repliceren β-cellen. Schaal bar van 150 micrometer getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Geautomatiseerde identificatie repliceren α-cellen repliceren α-cellen worden geïdentificeerd door DAPI (linker bovenhoek, blauw cirkels), het ontbreken van PDX-1 (rechter bovenhoek, groene cirkels), glucagon (links-klein hoek, magenta cirkels) en Ki-67 (de rechteronderhoek, rode cirkel) co-expressie. De samengevoegde afbeelding (rechts) toont een zeldzame replicating doublet van α-cellen (gele pijl). Schaal bar van 150 micrometer getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Dipyridamol Veroorzaakt PDX-1 + - en β-cellen replicatie maar geen α-cel replicatie Grafische weergave van PDX-1-cellen (linksboven), β-cel (rechtsboven) en α-cellen (linksonder) replicatie in DMSO en dipyridamol behandelde putjes getoond. Staven stellen het gemiddelde onafhankelijk behandelde putjes (PDX-1 replicatie, n = 8; β-α-cellen en celdeling, n = 4). Fout balken geven de standaarddeviatie (* p <0,01). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| EEN. | Behandeling: | kleuring: | |
| 4 | 5 | ||
| C | DMSO | Dipyridamole | Insuline, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| D | DMSO | Dipyridamole | Insuline, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| E | DMSO | Dipyridamole | Insuline, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| F | DMSO | Dipyridamole | Insuline, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| G | DMSO | Dipyridamole | Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| H | DMSO | Dipyridamole | Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| ik | DMSO | Dipyridamole | Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| J | DMSO | Dipyridamole | Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| B. | Aantal PDX-1 + cellen | ||
| DMSO | Dipyridamole | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 5158 | 6249 | |
| D | 6365 | 6795 | |
| E | 4830 | 6974 | |
| F | 5988 | 6408 | |
| G | 5574 | 6532 | |
| H | 5939 | 6411 | |
| ik | 5612 | 6387 | |
| J | 4862 | 5759 | |
| Procent van PDX-1 + Ki-67 + Cells | |||
| DMSO | Dipyridamole | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3.04 | 9.99 | |
| D | 3.91 | 10.57 | |
| E | 2.51 | 8.58 | |
| F | <td> 3,7710.14 | ||
| G | 3.44 | 10.1 | |
| H | 3.06 | 10.69 | |
| ik | 3.58 | 9.07 | |
| J | 3.52 | 11.74 | |
Tabel 1: Vertegenwoordiger Experimentele Plan en PDX-1 + -cel replicatie van gegevens. (A) Een overzicht van de behandeling is opgenomen. Putjes werden behandeld met DMSO (kolom 4) of dipyridamol (kolom 5). Kleuring werd uitgevoerd met DAPI, anti-PDX-1, anti-insuline (normale letters) of anti-glucagon (cursieve letters) en Ki-67 (B) Totaal aantal PDX-1 + cellen (top, DAPI +PDX-1 +) per putje en het percentage replicerende PDX-1-cellen (onderste, DAPI + PDX-1 + Ki-67 + / + DAPI PDX-1 + x 100) per putje getoond.
| Event 1: | |||
| DMSO | Dipyridamole | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3557 | 4352 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+) |
| D | 4387 | 4542 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+) |
| E | 3462 | 4879 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+) |
| F | 4315 | 4585 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+) | |
| G | 1594 | 1567 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagon (+) |
| H | 1477 | 1439 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagon (+) |
| ik | 1491 | 1390 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagon (+) |
| J | 1298 | 1474 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagon (+) |
| Event 2: | |||
| DMSO | Dipyridamole | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 113 | 425 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+) Ki-67 (+) |
| D | 152 | 511 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+) Ki-67 (+) |
| E | 97 | 466 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+) Ki-67 (+) |
| F | 163 | 504 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+) Ki-67 (+) |
| G | 13 | 9 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagon (+) Ki-67 (+) |
| H | 10 | 9 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagon (+) Ki-67 (+) |
| ik | 6 | 11 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagon (+) Ki-67 (+) |
| J | 12 </ Em> | 7 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagon (+) Ki-67 (+) |
| % Replicatie: | |||
| DMSO | Dipyridamole | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3.18 | 9.77 | |
| D | 3.47 | 11.25 | |
| E | 2.8 | 9.55 | |
| F | 3.78 | 10.99 | |
| G | 0.82 | 0.57 | |
| H | 0.68 | 0.63 | |
| ik | 0.4 | 0.79 | |
| J | 0.92 | 0.48 | |
Tabel 2: Representatieve β-cel en α-cel-replicatie van gegevens Het totale aantal β-cellen (Event 1: DAPI + PDX-1 + insuline +; tafel rijen CF, normale letters).), Α-cellen (Event 1 : DAPI + PDX-1 + glucagon +; tafel rijen GH, cursieve letters), het repliceren van β-cellen (Event 2: DAPI + PDX-1 + insuline + Ki-67 +; midden tabelrijen CF, normale letters) en α -cellen (Event 2: DAPI + PDX-1 + glucagon + Ki-67 +; midden tabelrijen GH, cursieve letters)per goed worden weergegeven. Bovendien is het percentage replicerende β-cellen (DAPI + PDX-1 + insuline + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + insuline + x 100; onderste tabelrijen CF, normale letters) en α-cellen (DAPI + PDX -1 + glucagon + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + glucagon + x 100; onderste tabelrijen GJ, cursieve letters) per well worden getoond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Experimentele methoden voor het bestuderen van de moleculaire pathways dat de groei van β-cel en regeneratie onder controle zijn belangrijke hulpmiddelen voor diabetes onderzoekers. Hierin, een rat-eilandje-based screening platform voor het identificeren en karakteriseren van kleine moleculen stimulatoren van β-cel-replicatie wordt gepresenteerd.
Terwijl de meeste aspecten van dit protocol gemakkelijk worden uitgevoerd door ervaren onderzoekers, een paar stappen vereisen bijzondere techniek. In de eerste plaats tijdens het eilandje isolatie, infusen van de gal-duct zonder verstoring van de integriteit vereist oefening. Een behulpzame strategie is om minimaal opblazen van de galwegen om de juiste positionering van de naald te zorgen voor volledig afgeven van de pancreas spijsvertering oplossing. Ten tweede, efficiënte eilandje isolatie van exocriene weefsel vergt veel aandacht aan de spijsvertering duur en de juiste agitatie. Zorg moeten worden genomen om zelfs verwarming door het digest door middel van intermitterende wervelende garanderen. Ten derde, experimentele succes hangt afs op bedreven discriminatie tussen eilandjes en exocriene puin tijdens het handmatig eilandje plukken; deze vaardigheid verbetert met de praktijk. Ten vierde wordt eilandje dispersie en plating zodanig uitgevoerd dat alle eilandjes worden gedispergeerd in een mengsel van afzonderlijke cellen en kleine clusters van twee of drie cellen. Over- en onder-vergisting van eilandjes voorafgaand aan de beplating interfereren met experimentele prestaties. Vers plated eilandjes-cellen moet ongeveer 50% confluent zijn voordat spreiding en mogen verbinden via 48 uur ongestoord. Figuur 1 toont de verschijning van succesvolle eilandje celculturen op verschillende tijdstippen na uitplaten. Ten vijfde, zijn media veranderingen voor eilandje-celkweken zorgvuldig gedaan om verstoring van zwak hechtende cellen te voorkomen. Zesde moet antigeenterugtrekking voorzichtig gebeuren om kromtrekken van de multiwell-plaat te vermijden, maar voldoende succesvol Ki-67 kleuring die gevoelig is voor zowel onder- als mogelijk overmatige blootstelling aan temperatuurstijging; vervormde plaatjes niet kunnen worden gebruiktgeautomatiseerde beeldacquisitie. Let op, overmatig pancreas spijsvertering, blootstelling aan exocriene weefsel puin en / of behandeling met trypsine zijn vaak voorkomende oorzaken voor het eilandje-celcultuur mislukking.
Een beperking van dit protocol is het vertrouwen op specifieke expressie merkers voor β-cel identiteit en replicatiegebeurtenissen. Het gebruik van enkele markers heeft de potentie misleidend te zijn. Bijvoorbeeld, PDX-1 tot expressie wordt gebracht door β-cellen, een subset van somatostatine tot expressie δ-cellen en β-cell progenitors 29,30; vandaar zou verbindingen die PDX-1-celdeling verhogen specifiek werkzaam op niet-β-celpopulatie. Bijgevolg bevestigende onderzoeken die alternatieve β-cel markers nodig. Evenzo Ki-67 expressie is geen perfecte marker voor replicatie en aanvullende indicatoren zoals BrdU en fosfo-histon 3 worden gebruikt 31. Een tweede beperking van deze test is dat verbindingen die β-cellen replicatie induceren simultaanDUREND verhoging β-cel apoptose of de-differentiatie. Daarom is het belangrijk om te evalueren of een verbinding induceert een absolute toename van β-celaantal en / of induceert β-cel apoptose en of met verbinding behandelde β-cellen behouden normale functie (glucose-gestimuleerde insulinesecretie) 32. Een derde beperking van deze test is de geringe doorvoer verband met het gebruik van primaire eilandjes-cellen; eilandjes van zes ratten genereert 228 experimentele putjes waarmee ~ 55 verbindingen worden gescreend in viervoud (plus positieve en negatieve controles). Een extra beperking van de beschreven β-celdeling screeningsplatform is het gebruik van ratteneilandjes plaats menselijke eilandjes. Verschillen tussen mens en rat eilandjes voldoende zijn om te eisen dat alle-replicatie bevorderen verbindingen geïdentificeerd met behulp van ratten eilandje kweken worden bevestigd met behulp van menselijke eilandje culturen. Echter, gezien de beperkte beschikbaarheid, en de hoge kosten van de menselijke eilandjes, primaire screening met menselijke islets is onpraktisch voor de meeste onderzoekers.
De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn: 1) het gebruik van vers geïsoleerde primaire eilandjes normale groei beperkingen in de mate behouden mogelijk, 2) het gebruik van een 384-well formaat matige screening mogelijk (gewoonlijk eilandjes geïsoleerd uit zes ratten zijn voldoende voor 228 putten) en 3) het gebruik van geautomatiseerde beeldacquisitie en analyse om het tempo van de experimenten te versnellen en om vertekening te beperken. Daarentegen veelgebruikte alternatieve benaderingen vertrouwen op handmatige beeldacquisitie en subjectieve beoordeling van β-cel-replicatie gebeurtenissen of hele eilandje opname van radioactief thymidine die geen onderscheid maken tussen cell-linages, bijvoorbeeld fibroblast versus β-cel-replicatie 15,17. Vandaar dat de gepresenteerde protocol een belangrijk en verbeterd instrument voor het onderzoeken van de groei-regulatie van β-cellen.
Wij voorzien diverse aangepastegebruikt voor deze screening platform. Ten eerste kan een absolute toename van β-celaantal worden gemeten door het tellen van het aantal PDX-1 + - of insuline + -cellen. Om rekening te houden variabiliteit in het aantal cellen per putje van een hoger aantal herhalingen per toestand kan worden opgenomen (meestal n = 8). Ten tweede kan het platform worden aangepast voor-lentivirus gebaseerde overexpressie of knock-out / down experimenten om routes betrokken bij β-celdeling te identificeren. Samengevat, de beschreven experimentele techniek algemeen nuttig om verbindingen en de moleculaire mechanismen die β-celdeling reguleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 g male Male Sprague Dawly Rat | Charles River | Stain # 400 | |
| 12 cm teeth tisuue forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 11.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| 14.5 cm surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | |
| 16 cm curved forceps | Fine Science Tools | 11003-16 | |
| 12 cm curved hepostat | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| 12 cm scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Tissue sieve-30 mesh | Bellco Glass | 1985-85000 | |
| Cizyme RI, 375,000 CDA units | VitaCyte | 005-1030 | |
| Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) | Gibco | 24020-117 | |
| Ketamine HCl (200 mg/20 ml) | JHP Pharmaceuticals | NDC# 42023-113-10 | to make anesthetic cocktail |
| Xylazine (5 g/50 ml) | LLOYD | NADA# 139-236 | to make anesthetic cocktail |
| Histopaque 1077 | Sigma | H-1077 | to make histopaque 1100 |
| Histopaque 1119 | Sigma | H-1119 | to make histopaque 1100 |
| Newborn Calf Serum 500 ml | Hyclone | SH30118.03 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Hyclone | SH30268.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose | Hyclone | SH30021.01 | |
| Functionality/Viability Solution | Mediatech | 99-768-CV | |
| RPMI1640 media | Hyclone | SH30096.01 | to make conditioned medium |
| 804G rat bladder carcinoma cell-line | Available upon request | to make conditioned medium | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 26160 | |
| GlutaMax-I | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml) | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Formamide 500 ml | Fisher BioReagents | BP227-500 | |
| Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0) | Vector Laboratories | H-3300 | to make 0.15 M Sodium Sitrate solution |
| Dextrose, Anhydrous | EMD Chemicals | DX0145-1 | to make 1 M glucose solution |
| Nomal Donkey Serum (Powder) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Mouse anti-human Ki67 antibody | BD Biosciences | 556003 | |
| Goat anti-human PDX-1 antibody | R&D Systems | AF2419 | |
| Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody | Dako | 2016-08 | |
| Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody | Dako | 2014-06 | |
| Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody | Dako | 2011-08 | |
| Polyclonal chicken anti-vimentin antibody | abcam | ab24525 | |
| Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | |
| StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated | Invitrogen | S32354 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-025-147 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-025-148 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-025-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-175-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG | Jackson ImmunoResearch | 703-175-155 | |
| DAPI | Millipore | S7113 | |
| Disposable Reagent Reservoir 25 ml | Sorenson BioScience | 39900 | |
| 384 well, black/clear, tissue culture treated plate | BD Falcon | 353962 | |
| 96 well, black/clear, tissue culture treated plate | Costar | 3603 | |
| Multi-channel pipettor | Costar | 4880 | |
| 12-channel vaccume aspirator | Drummond | 3-000-096 | |
| Cell Scraper | Falcon | 353085 | |
| Isotemp Water Bath Model 2223 | Fisher Scientific | ||
| High-content screening instrument: ArrayScan VTI | Thermo Scientific |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited. Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).
- Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. Current advances and travails in islet transplantation. Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).
- Nath, D. S., et al. Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).
- Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. Adult tissue sources for new beta cells. Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause. Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Meier, J. J., et al. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).
- Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures. Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).
- Brelje, T. C., Sorenson, R. L. Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy. Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).
- Chen, H., et al. PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells. Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).
- Liu, H., et al. Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets. Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).
- Metukuri, M. R., et al. ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation. Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).
- Wang, P., et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).
- Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
- Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets. J Vis Exp. (64), (2012).
- Walpita, D., et al. A human islet cell culture system for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).
- Miyazaki, J., et al. Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms. Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).
- Song, W. J., et al. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A). J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).
- Cozar-Castellano, I., et al. Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines. Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).
- Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).
- Wang, W., et al. Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).
- Annes, J. P., et al. Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).
- Zhao, Z., et al. Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication. Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).
- Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents. PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).
- Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells. Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochem J. 310, (Pt 3) 997-1003 (1995).
- Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus. Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).
- Rieck, S., et al. Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets. Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).
- Wang, P., et al. Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation. Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).
