Summary
sfide critiche per il campo di ricerca sul diabete sono di comprendere i meccanismi molecolari che regolano la replicazione isolotto β-cellule e di sviluppare metodi per stimolando la rigenerazione delle cellule β-. Qui un metodo ad alto contenuto di screening per identificare e valutare l'attività di replica di promozione β-cellule di piccole molecole è presentato.
Introduction
Diabete comprende una raccolta di disturbi che condividono il punto finale di omeostasi del glucosio perturbato comune. Sebbene i meccanismi patogenetici dei sottotipi di diabete sono distinte, che condividono la conseguenza della riduzione della massa β-cellule, cioè, la perdita di capacità di produzione di insulina 1,2. Attualmente, le strategie di trattamento del diabete si basano su somministrazione cronica di insulina esogena, la stimolazione farmacologica della produzione di insulina o il miglioramento della sensibilità all'insulina, e raramente, il trapianto di isole pancreatiche o tutta 3,4 pancreas. Purtroppo, il successo di queste strategie è di breve durata e / o non sufficientemente ricapitolare la funzione di produzione di insulina endogena. Nonostante l'utilità di sviluppare un metodo per stimolare la rigenerazione β-cellule, non esiste tale approccio. Di conseguenza, uno dei principali obiettivi di ricerca del diabete è quello di sviluppare metodi per generare nuove cellule beta o per espandere la massa endogena β-cellule 5 6,7. È importante sottolineare che la fonte principale di nuove beta-cellule in vivo è preesistenti beta-cellule, piuttosto che le cellule progenitrici specializzate 8,9. Sebbene cellule beta sembrano avere capacità di replicazione limitata, un piccolo incremento della massa β-cellulare (~ 30%) può essere sufficiente a ripristinare l'omeostasi del glucosio in molti diabetici. Inoltre, in situ stimolazione farmacologica della massa β-cellule è una strategia di trattamento potenzialmente poco costoso e scalabile. Qui un metodo di screening ad alto contenuto per identificare e caratterizzare piccole molecole che stimolano la crescita delle cellule β-è presentato.
Una varietà di metodi sperimentali in vitro può essere utilizzato per identificare prodotti genici e / o molecole that promuovere la replicazione β-cellule primarie. I primi sforzi per misurare l'induzione replica β-cellule utilizzate fetale cultura roditore pancreas o culture isolate delle isole intatte per misurare [3 H] timidina, incorporazione di BrdU o gli organismi mitotico all'interno della aldeide-tionina o insulina popolazione macchiato in risposta a condizioni di trattamento specifiche 10, 11. Questi approcci in vitro e varianti dello stesso hanno diverse limitazioni. Carenze prominenti includono (1) l'uso di cellule fetali che, a differenza di beta-cellule mature, mostrano un alto tasso di replicazione β-cellule basali e sono la crescita regolata in modo distinto 12; (2) la natura personale di aggiudicazione sperimentatore-dipendente di eventi di replica β-cellule; (3) del lavoro e la natura intensiva tempo di conteggio sperimentatore-dipendente di eventi di replica β-cellule ritarda il throughput sperimentale; (4) l'uso di armi nucleari incorporazione / macchie / aspetto di individuare replica anchets e una macchia citoplasmatica non sovrapposizione di identificare cellule beta porta alla falsa attribuzione di eventi di replica non β-cellule prossimità cellule beta.
Più recentemente mature beta cellule primarie sono stati utilizzati per valutare l'impatto del transgene sovra-espressione, così come prodotto del gene o composto trattamento sulla replica β-cellule 13-16. Tuttavia, questi studi hanno anche invocato il conteggio personale di eventi di replica, metodi staining- citoplasmatica o non specifici per l'identificazione β-cellulare e / o passaggi alta intensità di lavoro che limitano il throughput, ad esempio, slide-ben placcatura individuale di cellule o isolotto intatto paraffina e l'elaborazione 17. In particolare, un β-cellula umana metodologia di screening replica basata su immagine, simile a quella qui presentata, è stato pubblicato 18; tuttavia, l'uso di successo di questo test non è stato dimostrato e l'uso di isole umane per lo screening primario può non essere ampiamente FEAbile.
Una strategia alternativa per identificare le sostanze replica di promozione è quello di valutare l'induzione della crescita delle linee di β-cellule. Gli sforzi iniziali usati trasformate cellule beta-linee come MIN6 cellule o INS 832/13-celle 14,19-21. Tuttavia, queste linee cellulari dimostrano la crescita incontrollata e somigliano poco a ben differenziati cellule beta 22. Di conseguenza, la capacità di crescita di induzione è minima, di rilevanza poco chiare e talvolta difficile ricapitolare. Una migliore strategia per lo screening basato linea cellulare utilizza "reversibile trasforma" le cellule che sono la crescita arrestato in assenza di tetraciclina (doxiciclina) -dipendente SV40 antigene T espressione 23,24. Tuttavia, non è chiaro se queste cellule ritornare allo stato β-cell-like "normale" dopo la rimozione doxiciclina. Purtroppo, l'uso di queste cellule ha ceduto composti promotori della crescita generalizzate che non sembrano avere utilità immediata24. In generale, l'uso di linee cellulari per studiare regolazione della crescita di una cellula tipo visualizzazione minima attività di replica spontanea può avere limitata applicabilità.
La piattaforma di screening replica β-cellule qui presentata utilizza maturi primari di ratto beta-cellule per mantenere nella regolazione della crescita in vivo, per quanto possibile, le culture isolotto-cellula di composizione delle cellule di tipo misto per consentire l'identificazione delle attività di promozione della crescita lignaggio-ristretta, Multi -well formattazione per massimizzare il throughput e analisi automatizzata per eliminare pregiudizi e facilitare il throughput. Uso di successo di questa piattaforma ha permesso l'identificazione di diversi composti che promuovono la replicazione β-cellule 25,26. Inoltre, il test è stato utilizzato per studi di relazione struttura-attività ed esperimenti epistatici chimici per fornire intuizioni meccanicistici nella regolazione molecolare della replicazione β-cellule. La piattaforma presentata è stata adattata con successo FOindagine R lentiviral RNAi-based di replica β-cellule Percorsi di 25. Limitazioni del test comprendono limitati scalabilità (uso di cellule primarie), uso di roditore piuttosto che isolotto-cellule umane (anche se il dosaggio può essere adattato per gli studi delle isole umane), spese associate con l'imaging a base di anticorpi e l'uso isolotto primaria, l'uso di isolotti dispersi (architettura isolotto interrotto) per facilitare l'acquisizione delle immagini automatizzata e dipendenza dalla disponibilità di un microscopio automatico con acquisizione delle immagini e capacità di analisi. Sebbene un metodo in vivo facile screening per identificare prodotti genici o composti che stimolano la rigenerazione β-cellule in situ sarebbe ideale, tale piattaforma non è ancora disponibile 27. Di conseguenza, la piattaforma descritto è appropriato per ricercatore interessa indagare molti aspetti della replica β-cellule.
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Protocol
Questo protocollo è stata effettuata in accordo con il Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) della Stanford University School of Medicine. Il protocollo descritto viene scalata per isolamento delle isole da sei 250 - 300 g (8 - 9 settimane) maschi ratti Sprague Dawley, che è sufficiente a generare 228 pozzetti di una piastra a 384 pozzetti per la valutazione replica isolotto-cellula.
1. Preparazione del materiale
- Preparare supporti di rivestimento prima di iniziare isolamento delle isole raccogliendo media condizionato di cellule di carcinoma della vescica di ratto 804G mantenuti a confluenza per 3 giorni (20 ml di RPMI1640) in 15 centimetri coltura tissutale piatto 28. filtro sterile e conservare (-20 ° C) i media condizionata per un uso successivo.
- Sterilizzare strumenti chirurgici (uno 12 cm pinze dei tessuti dentate, uno 11,5 cm forbici sottili, uno 14,5 cm forbici chirurgiche, due 16 cm pinze curve, uno di 12 cm emostatica ricurva, uno 12 cm maniglia bisturi) e un setaccio del tessuto 30 mesh prima di initiating isolamento delle isole.
- Preparare la soluzione di digestione pancreatica sciogliendo un 60%: 40% miscela di classe I purificata: classe collagenasi II (attività collagenasi totale di 300.000 - 400.000 unità) in 60 ml di soluzione salina bilanciata 1x Hanks '(HBSS) supplementato con calcio e magnesio. Carico 10 ml di tampone di digestione pancreatica in 10 ml siringhe (sei) con 1 "22 ago G e posto su ghiaccio.
Nota: 10 ml di soluzione di digestione viene iniettato per ratto. Scala di conseguenza. - Preparare 4,5 ml di cocktail di anestetico in una cappa ventilata miscelando 1,3 ml di ketamina (100 mg / ml), 0,2 ml di xilazina (100 mg / ml) e 3 ml di PBS. Preparare il cocktail anestetico entro 1 ora di iniziare isolamento delle isole.
- Preparare tampone di lavaggio aggiungendo 25 ml di siero di vitello neonato a 500 ml di HBSS. Mettere il tampone di lavaggio in ghiaccio per un uso successivo.
- Preparare 1 bottiglia di terreno isolotto che si trova a 500 ml di Modified Eagle Medium basso livello di glucosio Dulbecco (DMEM), 50 ml di siero fetale bovino (FBS), 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 mg / ml di streptomicina.
- Preparare funzione isolotto mezzo dalla soluzione funzionalità / vitalità (500 ml) con il 2% FBS, 2 mM glutammina, 5 mM di glucosio, 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 mg / ml di streptomicina. Conservare il supporto funzionalità delle isole (4 ° C) per un uso successivo.
- Preparare 40 ml di tampone di bloccaggio con l'aggiunta di 2,5 ml di siero asino e 0,12 ml di Triton X-100-37,38 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS). Conservare tampone bloccante (4 ° C) per un uso successivo.
- Ottenere gli anticorpi necessari prima di iniziare il protocollo.
Nota: PDX-1 (TRITC) e Ki-67 (FITC) co-colorazione viene utilizzato per lo screening primario replica β-cellule. Per l'analisi replica specifici lignaggio, eseguire immunofluorescenza per i marcatori supplementari identità delle cellule (insulina, glucagone, vimentina o somatostatina; TRITC) insieme a nucleare (DAPI), PDX (Cy5) e Ki-67 (FITC) colorazione. rep Alternativemarcatori licazione, ad esempio, PCNA, possono anche essere utilizzati. - Preparare un piano di trattamento 228-bene con ogni condizione di trattamento effettuato in quadruplicato. Includi comandata (5-Iodotubercidin [1] micron o il dipiridamolo [15 micron]) e il veicolo di controllo (DMSO 1: 666 diluizione) pozzi.
2. Perfusione del pancreas
- Anestetizzare topi mediante iniezione ip di soluzione di cocktail anestetico diluito (0.30 ml / 100 g di peso corporeo). Una volta che il ratto è completamente anestetizzato e non risponde agli stimoli nocivi, eseguire la dislocazione cervicale.
- Posizionare il topo eutanasia in posizione (orientamento cranio-caudale) in posizione supina su una pila di carta assorbente e spruzzare la zona addominale con il 70% di etanolo.
- Aprire la cavità addominale con una U-incisione (base alla regione pubica) e retrarre pelle in direzione rostrale sul torace per esporre la cavità addominale.
- afferrare con cautela il duodeno utilizzando due coppie di pinze curve, individuare la voce duodenale dei comuni Bcondotto ile (sfintere di Oddi) e serrare l'apertura duodenale presso la papilla con una pinza emostatica curva.
- Sollevare la pinza emostatica curva utilizzato per bloccare il dotto biliare comune papilla e afferrare il dotto biliare vicino al fegato utilizzando una pinza curve. Utilizzare smussa con le pinze curve per isolare ed esporre il dotto biliare.
- Riposizionare il topo con la testa prossimale e distale i piedi.
- Cannulate il dotto biliare comune (CBD) in corrispondenza o appena distale alla giunzione dei condotti epatici cistiche e comuni con una soluzione di digestione pancreatica MOLLA siringa da 10 ml e iniettare lentamente 10 ml di soluzione di digestione del pancreas. Mentre l'iniezione, sostenere il CBD con un manico bisturi. Riposizionare l'ago se il condotto e il pancreas non riescono a gonfiare.
- Rimuovere il pancreas gonfiati utilizzando le pinze curve e forbici sottili per separarlo dal colon discendente, intestino, stomaco e la milza. Posizionare il pancreas gonfiati su ghiaccio in una provetta da 50 ml contenente 5 ml di
3. La dissociazione del pancreas
- Una volta che tutti pancreas sono raccolti, posizionare i tubi di digestione in un bagno d'acqua a 37 ° C per 15 min. Mescolare delicatamente i tubi ogni 3 min.
- Dopo 15 minuti, agitare vigorosamente (verticale) i tubi per 10 volte e aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio a freddo. Agitare vigorosamente i tubi di un ulteriore 5 volte e disporli sul ghiaccio.
- Riempire i tubi di digestione a 50 ml con tampone di lavaggio a freddo e mescolare invertendo i tubi 5 volte.
- Centrifugare le provette a 97 xg a 4 ° C per 1 minuto e versare il sopranatante. Fare attenzione a non rimuovere il tessuto pellet.
- Aggiungere 25 ml di tampone di lavaggio e risospendere il tessuto vortex delicatamente. Ripetere i punti 3.4 e 3.5 altre due volte.
- Posizionare un setaccio da 30 mesh tessuto su una sterile 250 ml bicchiere e versare la sospensione di tessuto sul setaccio. Sciacquare il tubo di digestione con altri 20 ml di tampone di lavaggio e versare sulla rete. I tessuti pancreatici e grasso non digerito vengono rimossi in questa fase.
- Versare il materiale filtrato in due freschi provette da 50 ml e pellet tessuto facendo girare a 97 xg per 1 min a 4 ° C. tubi surnatante e invertire decantare per drenare l'eccesso di buffer.
4. Purificazione di isolotti
- Aggiungere 20 ml di soluzione diatrizoato freddo polysucrose / sodio (1.119 g / ml densità) per il tessuto pancreatico pellet. Omogeneamente risospendere il contenuto di ciascuna provetta delicatamente pipettando su e giù cinque volte.
- sovrapporre delicatamente la soluzione diatrizoato polysucrose / sodio con 10 ml di HBSS. Mantenere una interfaccia liquido tagliente aggiungendo lentamente l'HBSS lungo la parete del tubo.
- Centrifugare il pancreas digerito a 560 xg per 15 min (4 ° C) con lenta accelerazione e senza freno.
- collect lo strato isolotto dall'interfaccia con un 10 ml pipetta e posto isolotti in fresco provette da 50 ml. Non comune le isole in questa fase.
- Aggiungere 40 ml di tampone di lavaggio a ciascuna provetta 50 ml e centrifugare per 1 min a 140 xg a 4 ° C.
- Eliminare il surnatante e risospendere isolotti pool in 50 ml di tampone di lavaggio invertendo i tubi diverse volte. Centrifugare le provette per 1 min a 97 xga 4 ° C per raccogliere isolotti in un pellet.
- Eliminare il tampone di lavaggio e ripetere il lavaggio. Portare isolotti nella cappa coltura tissutale e aspirare il surnatante.
- Risospendere ogni tubo di isolotti in 6 ml di terreno isolotto.
- Trasferire le isolette di ogni tubo da 50 ml in un pozzo di sei pozzetti piatto di coltura di tessuti. Agitare il piatto 6 pozzetti per la raccolta isolette in mezzo del pozzo e di osservare la qualità e la purezza isolotto al microscopio.
- raccogliere manualmente isolotti usando una pipetta ml 1 e trasferire gli isolotti raccolti nella adiacentepozzetto contenente 6 ml di mezzi insulari. Ripetere vorticoso isolotto e raccogliendo fino a> 90% di purezza si ottiene.
- Trasferire gli isolotti purificati ad un 10 centimetri piatto di coltura tissutale contenente 20 ml di terreno isolotto.
- Inserire isolotti in un incubatore di coltura tissutale (37 ° C, 5% CO 2) durante la notte (Figura 1A).
- In preparazione di placcatura cellule insulari, cappotto i pozzetti di una piastra da 384 pozzetti con 40 ml di 804G mezzi condizionati per pozzetto. Incubare per una notte in un incubatore di coltura tissutale.
5. Dispersione e placcatura di cellule insulari
- Il giorno seguente, staccare delicatamente isolotti dal 10 centimetri piatto con un raschietto cellulare e trasferire gli isolotti in un tubo da 50 ml.
- Pellet gli isolotti di centrifugazione per 1 min a 22 xg a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante.
- Lavare le isolette con 20 ml di PBS calda e decantare come sopra.
- Risospendere isolotti a 0,25% tripsina (150 ml per il pancreas di ratto) E incubare a 37 ° C per 10 min. Pipetta isolotti su e giù per 10 volte con 1 ml pipetta dopo 5 e 10 minuti di incubazione.
- Dopo 10 minuti, la valutazione di un campione di 20 ml di isolotti trypsinized sotto il microscopio per garantire la completa digestione e per contare le cellule delle isole con un emocitometro. Se isolotti non digerito rimangono, continuare incubazione per un ulteriore 3 - 5 minuti e pipetta su e giù per 10 volte di più. Ripetere se necessario.
Nota: Il rendimento tipico è ~ 125.000 - 150.000 isolotto-cellule per topo. - Rimuovere 804G condizionata piastra a 384 pozzetti supporti rivestita dal termostato e rimuovere i supporti utilizzando un aspiratore 12-bene collettore.
- Sospendere cellule insulari ad una densità di 45.000 cellule per ml in mezzo funzione Islet e piastra 70 microlitri (3.150 celle) per pozzetto con una pipetta multicanale (Figura 1B).
Nota: Poiché cellule beta situati nei pozzetti esterni tendono a migrare verso il perimetro della piastra di uso righe C a N e colonne 4al 21 al piatto 228 pozzi con l'isolotto cellule isolate da 6 ratti. - Porre la piastra in cultura incubatore di tessuto per 48 ore per permettere l'adesione cellulare.
6. Cultura Islet-cellula di trattamento, fissaggio e la colorazione
- Preparare 200 ml di veicolo e composti (condizioni di trattamento vengono eseguite in quadruplicato) ad una concentrazione 2x in medium funzione Islet. Disporre composti in una piastra a 96 pozzetti sterili per facilitare multi-bene pipettaggio.
- Rimuovere con cautela media isolotto con un aspiratore 12-bene collettore e sostituire con il mezzo funzionalità delle isole (35 ml / pozzetto) usando una pipetta 12-bene. Rimuovere e sostituire il supporto di una riga alla volta per limitare il rischio di essiccazione (Figura 1C).
- Iniziare il trattamento con il trasferimento di 35 ml / pozzetto delle soluzioni composti 2x. Ritorna piastra al incubatore per la durata del trattamento 48 hr.
- Dopo 48 ore di trattamento, decantare il supporto trattamento invertendo la piastra. </ Li>
- Lavare delicatamente le cellule delle isole con 50 ml per pozzetto di PBS 1x (1 min). Aggiungere il PBS usando una pipetta multicanale.
- Decantare il PBS e fissare le cellule con l'aggiunta di 50 ml per pozzetto di freddo 4% paraformaldeide (PFA) diluito in PBS 1x. Incubare le cellule per 15 minuti a 4 ° C.
- Lavare le cellule tre volte (5 min ciascuna) invertendo la piastra per rimuovere il PFA e aggiungendo delicatamente 60 ml di PBS per pozzetto come sopra.
- Preparare la soluzione di recupero 15 ml antigene mescolando 14,25 ml di formammide e 0,75 ml 0,15 M citrato di sodio (pH 6). Rendere la soluzione di antigene recupero immediatamente prima dell'uso.
- Rimuovere PBS dai pozzi invertendo la piastra e aggiungere 60 microlitri soluzione di antigene di recupero in ogni pozzetto. Riscaldare la piastra a 70 ° C bagnomaria per 45 min. Posizionare un blocco riscaldante sulla parte superiore della piastra durante l'incubazione per evitare deformazioni della piastra multi-pozzo.
Nota: L'acqua dovrebbe essere a metà strada su per la gonna piatto; targa non deve essere immersa. - Lavare le cellule con 60 ml per pozzetto di PBS 1x per tre volte (5 minuti ciascuno). Aggiungere PBS con una pipetta multicanale e decantare PBS invertendo la piastra.
- Utilizzare una pipetta multicanale aggiungere 40 microlitri per pozzetto di tampone bloccante e incubare per 30 min a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone bloccante invertendo la piastra e decantazione.
- Aggiungere 40 ml di topo anti-umano Ki-67 (1: 200) e di capra anti-umano PDX-1 (1: 100) anticorpi diluiti in tampone bloccante in ciascun pozzetto e incubare a 4 ° C durante la notte.
- Il giorno successivo, decantare la soluzione anti-corpo e lavare le cellule con PBS 1x tre volte (5 min ciascuna) come sopra descritto. Decantare il PBS.
- Aggiungere 40 ml per pozzetto di diluito (1: 200) asino biotinilato anti-topo IgG e asino rodamina-coniugato anti-IgG di capra in tampone di bloccaggio. Incubare per 1 oraa temperatura ambiente.
- Lavare le cellule con PBS 1x per tre volte, 5 minuti ciascuno. Aggiungere 40 ml di diluito (1: 400 in tampone bloccante) fluoresceina coniugato streptavidina ad ogni pozzetto. Incubare 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule con PBS 1x per tre volte, 5 minuti ciascuno. Aggiungere 40 ml per pozzetto di DAPI (300 Nm nel tampone di bloccaggio) e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule con PBS 1x due volte e lasciare le cellule in 40 ml PBS 1x. La piastra è ora pronto per essere analizzati.
La replica Analisi 7. β-cellulare
Nota: Un protocollo dosaggio deve essere stabilito per l'alto contenuto di microscopio di screening utilizzato per misurare la replica di β-cellule. Nella sua composizione semplice, questo protocollo è un saggio a due colori in cui un marcatore di identità viene utilizzato per definire cellule beta (PDX-1 + -cellule) e un indicatore di replica (Ki-67) viene utilizzato per definire gli eventi di divisione cellulare.
- Identificare oggetti (cellule beta) basate sul averagintensità di fluorescenza e di PDX-1 colorazione (549 filtro nm) all'interno di un cerchio approssimativa (lunghezza: larghezza <1.6) all'interno dell'area di pixel previsto un nucleo β-cellulare (Figura 2A).
- Successivamente, stabilire le impostazioni per identificare gli eventi di replica (Ki-67-positività) basati sulla intensità media di fluorescenza (485 nm filtro) all'interno del PDX-1 + (Figura 2B).
Nota: I tempi di esposizione devono essere fissati per consentire il confronto di intensità dei pixel attraverso le immagini. parametri del protocollo del test vengono regolati in modo tale che le chiamate di macchine costantemente escludono colorazione, detriti e cellule aggregati non specifici che potrebbero influenzare negativamente la qualità dei dati. - Analizzare un minimo di 500 beta-cellule per pozzetto per massimizzare la precisione e limitare la variabilità.
Nota: L'indice replica β-cellule basali nelle culture delle isole di ratto dovrebbe essere 0,5-3%. Tipicamente, 40 immagini al bene è più che sufficiente per identificare 500 cellule beta. - Prima di analizzare ilintera piastra, analizzare negativo- selezionato (DMSO-trattato) e positivo di controllo (5-iodotubercidin [1 micron] o il dipiridamolo [15 micron]) -treated pozzi per valutare la validità del protocollo del test. Quando il test è stabilita in maniera corretta, composti di controllo positivi inducono almeno un aumento di due volte della percentuale di replicare cellule beta.
- Leggi l'intera piastra una volta che il protocollo di analisi viene convalidato.
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Representative Results
Per valutare β-cellula o la replicazione α-cellule, è necessario un protocollo di dosaggio a quattro colori. Innanzitutto, gli oggetti sono identificati dalla colorazione DAPI (Canale 1, 386 nm). Successivamente, le cellule beta (evento 1) sono contati: oggetti che co-esprimono PDX-1 + (canale 2, 650 nm) e di insulina peri-nucleare (canale 3, 549 nm). Successivamente, che replicano le cellule beta (evento 2) sono contati: le cellule beta (evento 1) che co-express Ki-67 (canale 4, 485 nm) (Figura 3). La percentuale di replicare cellule beta si calcola: (evento 2 / evento 1) x 100. Per quantificare la replicazione α-cellule, oggetti in totale sono identificati dalla colorazione DAPI (canale 1) e quindi alfa-cellule (evento 1) vengono enumerate da l'assenza di PDX-1 colorazione (canale 2) e la presenza di perinucleare colorazione glucagone (canale 3). Replica alfa-cellule (evento 2) sono il numero di alfa-cellule che co-express Ki-67 (canale 4) (Figura 4).La percentuale di replicare alfa-cellule è calcolato: (evento 2 / evento 1) x 100.
Prima di iniziare l'esperimento, un piano di trattamento composto è fatto (Tabella 1A). Qui, un test su piccola scala è stato eseguito utilizzando il controllo negativo (DMSO-trattati) e il controllo positivo ([15 mM] dipiridamolo trattati) condizioni per valutare PDX-1, β-cellule e la replica α-cella in un formato di 384 pozzetti ( 49 immagini per pozzetto). Dati sperimentali dimostrano dipiridamolo a promuovere in modo selettivo PDX-1 + -cell e la replicazione delle cellule β-α, ma non la replicazione delle cellule. Il numero medio di identificati PDX-1-cellule per pozzetto era 5.541 ± 555 per DMSO-trattati e 6.439 ± 363 per le condizioni di dipiridamolo trattati (p <0.01); dimostrando un aumento dipiridamolo-dipendente in PDX-1 numero di cellulare (Tabella 1B, in alto). La percentuale media PDX-1 + -cell replica (DMSO + PDX-1 + Ki-67 + </ sup> / DMSO + PDX-1 +) è 3,35 ± 0,50% per DMSO-trattato e 10,10 ± 0,98% per le condizioni dipiridamolo trattati (p <0,01) (Tabella 1B, in basso). È importante sottolineare che ci sono simili PDX-1 tariffe + -cell replica nei pozzi successivamente analizzati per la β-cellule (righe CF) e la replica α-cellule (file GJ): DMSO = 3.3 ± 0.66 (file CF) e 3,4 ± 0,23 (righe GJ) (p = 0,80); dipiridamolo = 9,8 ± 0,86 (righe CF) e 10.4 ± 0.1.1 (righe GJ) (p = 0,43). Quindi, questi pozzi, anche se macchiato di diversi marcatori di cellule-lignaggio (insulina e glucagone), ha risposto in modo simile al trattamento farmacologico.
Avanti i tassi di replicazione delle cellule beta e alfa-cellule sono state calcolate a partire dai dati grezzi (Tabella 2). Il numero medio di cellule beta (evento 1) è aumentata in risposta al trattamento dipiridamolo: DMSO 3.930 ± 488 vs. dipiridamolo 4589 ± 218 (p <0.05). In particolare, vi è una significativa riduzione del numero di cellule beta (3,930 ± 488) rispetto a PDX-1 cellule (5,541 ± 555) (p <0.01). Questo è il risultato di escludere PDX-1 + -cellule che sono insulino - dal conteggio β-cellule, ad esempio, δ-cellule o cellule progenitrici β-cellule, e il rigore addizionale di richiedere cellule beta essere all'insulina +. In particolare, il numero di alfa-cellule (evento 1) non è aumentata con il trattamento dipiridamolo (DMSO 1.465 ± 123 vs dipiridamolo 1.467 ± 74,7; p = 0.93). Quindi, dipiridamolo aumenta selettivamente numero di β-cellule. Il numero di replicare cellule beta (evento 2) è aumentata in risposta al trattamento dipiridamolo (DMSO 131 ± 31 vs. dipiridamolo 476,5 ± 39,6; p <0.01) ma il numero di replicare alfa-cellule (evento 2) non è (DMSO 10.25 ± 3 vs dipiridamolo 9.0 ± 1.6; p = 0,5). Infine la percentuale di replicare β-ceLLS e alfa-cellule è calcolato ((evento 2 / evento 1) x 100). Infatti, dipiridamolo aumenta la percentuale di replicare cellule beta ma non alfa-cellule (riassunti nella Figura 5). È importante sottolineare che il tasso di replica β-cellule basali di una sana cultura varia tra esperimenti (0,5-3%), ma dovrebbe essere altamente coerente in pozzi all'interno di un esperimento. Poiché la replica basale è variabile, il tasso di replica β-cellule compound-indotta è variabile attraverso esperimenti; tuttavia, la piega-induzione di replica β-cellule è coerente in tutti gli esperimenti e permette l'efficacia composto da confrontare in modo affidabile attraverso esperimenti. In particolare, il tasso di replica α-cellule è ~ 5 volte inferiore al tasso di replica β-cellulare e culture contengono ~ 1/3 il maggior numero di alfa-cellule come le cellule beta; di conseguenza, l'indice display replicazione α-cellule aumentato variabilità rispetto all'indice replica β-cellule. Per limitare la variabilità, le immagini al beneè aumentato da 49 (qui usato) ad un massimo di 81.
Figura 1: isolati e dispersi Rat isolotti. (A) Una microfotografia di isolotti isolati di ratto sano; bar 100 micron scala mostrato. (B) Micrografie (5X e 10X obiettivi) di isolotti di ratto dispersi 1 ora dopo la placcatura; 100 micron (a sinistra) e 200 micron (a destra) in scala bar indicati. (C) Micrografie (5X e 10X obiettivi) di ratto dispersa isolotti 48 ore dopo la placcatura; 100 micron (a sinistra) e 200 micron (a destra) in scala bar indicate. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: identificazione automatizzata di PDX-1 + + cellule insulari. Cellule delle isole (A) composti trattati dispersa ratto colorate per PDX-1. PDX-1 + oggetti sono cerchiati in blu; oggetti esclusi sono cerchiati in arancione. barra della scala di 150 micron mostrato. (B) Lo stesso campo della isolotto-cellule colorate per Ki-67. PDX-1 + ki-67 + cellule doppio positive sono cerchiati in verde. Barra della scala di 150 micron indicati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Automatizzato di identificazione di replicare cellule beta Replica di beta-cellule sono identificati da DAPI (sinistro-superiore, cerchi blu), PDX-1 (angolo destro superiore, cerchi verdi), insulina (sinistra-angolo inferiore, magenta cerchi) e Ki-67 (nell'angolo inferiore destro, cerchi rossi) co-eXpression. L'immagine risultante dalla fusione (a destra) mostra diversi replicano cellule beta. Barra della scala di 150 micron indicati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Automatizzato di identificazione di replicare alfa-cellule Replica di alfa-cellule sono identificati da DAPI (sinistro-superiore, cerchi blu), l'assenza di PDX-1 (angolo destro superiore, cerchi verdi), glucagone (sinistra-bassa angolo, cerchi magenta) e Ki-67 (nell'angolo inferiore destro, cerchio rosso) co-espressione. L'immagine risultante dalla fusione (a destra) mostra una rara replica doppietto di alfa-cellule (freccia gialla). Barra della scala di 150 micron indicati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Dipiridamolo Induce PDX-1 + - e replica β-cellulare, ma non α-cellule replica Rappresentazione grafica di PDX-1-cella (in alto a sinistra), β-cellule (in alto a destra) e α-cellule (in basso a sinistra) replica in DMSO e pozzi dipiridamolo trattati sono mostrati. Le barre rappresentano la media dei pozzetti trattati indipendentemente (PDX-1 replicazione, n = 8; β-cellule e replicazione α-cellule, n = 4). Le barre di errore indicano la deviazione standard (* p <0.01). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| UN. | Trattamento: | La colorazione: | |
| 4 | 5 | ||
| C | DMSO | DIPIRIDAMOLO | L'insulina, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| D | DMSO | DIPIRIDAMOLO | L'insulina, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| E | DMSO | DIPIRIDAMOLO | L'insulina, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| F | DMSO | DIPIRIDAMOLO | L'insulina, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| sol | DMSO | DIPIRIDAMOLO | Il glucagone, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| H | DMSO | DIPIRIDAMOLO | Il glucagone, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| io | DMSO | DIPIRIDAMOLO | Il glucagone, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| J | DMSO | DIPIRIDAMOLO | Il glucagone, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| B. | Numero di PDX-1 + Cells | ||
| DMSO | DIPIRIDAMOLO | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 5158 | 6249 | |
| D | 6365 | 6795 | |
| E | 4830 | 6974 | |
| F | 5988 | 6408 | |
| sol | 5574 | 6532 | |
| H | 5939 | 6411 | |
| io | 5612 | 6387 | |
| J | 4862 | 5759 | |
| Percentuale di PDX-1 + Ki-67 + Cells | |||
| DMSO | DIPIRIDAMOLO | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3.04 | 9.99 | |
| D | 3.91 | 10.57 | |
| E | 2.51 | 8.58 | |
| F | <td> 3.7710.14 | ||
| sol | 3.44 | 10.1 | |
| H | 3.06 | 10.69 | |
| io | 3.58 | 9.07 | |
| J | 3.52 | 11.74 | |
Tabella 1: Piano sperimentale rappresentante e PDX-1 + -cell di replica dei dati. (A) Un profilo del piano di trattamento è indicato. Wells sono stati trattati con DMSO (colonna 4) o dipiridamolo (colonna 5). La colorazione è stata eseguita con DAPI, anti-PDX-1, anti-insulina (lettering normale) o anti-glucagone (lettering in corsivo) e Ki-67 (B) numero totale di cellule PDX-1 + (in alto, DAPI +PDX-1 +) per pozzetto e la percentuale di replicare cellule PDX-1 (in basso, DAPI + PDX-1 + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + x 100) a bene sono mostrati.
| Evento 1: | |||
| DMSO | DIPIRIDAMOLO | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3557 | 4352 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) |
| D | 4387 | 4542 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) |
| E | 3462 | 4879 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) |
| F | 4315 | 4585 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) | |
| sol | 1594 | 1567 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagone (+) |
| H | 1477 | 1439 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagone (+) |
| io | 1491 | 1390 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagone (+) |
| J | 1298 | 1474 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagone (+) |
| Evento 2: | |||
| DMSO | DIPIRIDAMOLO | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 113 | 425 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) Ki-67 (+) |
| D | 152 | 511 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) Ki-67 (+) |
| E | 97 | 466 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) Ki-67 (+) |
| F | 163 | 504 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) Ki-67 (+) |
| sol | 13 | 9 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagone (+) Ki-67 (+) |
| H | 10 | 9 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagone (+) Ki-67 (+) |
| io | 6 | 11 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagone (+) Ki-67 (+) |
| J | 12 </ Em> | 7 | # DAPI (+) PDX-1 (+) glucagone (+) Ki-67 (+) |
| % Di replica: | |||
| DMSO | DIPIRIDAMOLO | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3.18 | 9.77 | |
| D | 3.47 | 11.25 | |
| E | 2.8 | 9.55 | |
| F | 3.78 | 10.99 | |
| sol | 0.82 | 0.57 | |
| H | 0.68 | 0.63 | |
| io | 0.4 | 0,79 | |
| J | 0.92 | 0.48 | |
Tabella 2: Rappresentante β-cellulare e α-cellule replica dei dati Il numero totale delle cellule beta (Evento 1: DAPI + PDX-1 + insulina +; top righe della tabella CF, scritte normale).), Α-cellule (evento 1 : DAPI + PDX-1 + glucagone +; top righe della tabella GH, scritte in corsivo), replicando le cellule beta (evento 2: DAPI + PDX-1 + insulina + Ki-67 +; righe della tabella centrale CF, scritte normale) e α -cellule (evento 2: DAPI + PDX-1 + glucagone + Ki-67 +; righe della tabella mezzo GH, scritte in corsivo)per pozzetto sono mostrati. Inoltre, la percentuale di replicare cellule beta (DAPI + PDX-1 + insulina + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + insulina + x 100; in basso le righe della tabella CF, scritte normale) e alfa-cellule (DAPI + PDX -1 + glucagone + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + glucagone + x 100; sono mostrati righe della tabella in basso GJ, lettering in corsivo) per bene.
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Discussion
metodi sperimentali per studiare i meccanismi molecolari che controllano la crescita delle cellule β-e rigenerazione sono strumenti importanti per i ricercatori del diabete. Qui, una piattaforma di screening basata rat-isolotto di identificare e caratterizzare stimolatori piccole molecole di replicazione β-cellule è presentato.
Mentre la maggior parte degli aspetti di questo protocollo sono facilmente eseguiti da ricercatori esperti, a pochi passi richiedono particolare tecnica. In primo luogo, durante l'isolamento delle isole, l'incannulamento della bile-dotto senza interrompere la sua integrità richiede pratica. Una strategia utile è per gonfiare minimamente il dotto biliare per garantire il corretto posizionamento dell'ago prima dell'erogazione completamente la soluzione di digestione pancreatica. In secondo luogo, efficiente isolamento delle isole dal tessuto esocrino richiede una stretta attenzione alla durata digestione e appropriata agitazione. Si deve prestare attenzione al fine di garantire anche il riscaldamento in tutto il digest attraverso vorticoso intermittente. In terzo luogo, il successo dipende sperimentales su di discriminazione abile tra isolotti e detriti esocrina durante isolotto raccolta manuale; questa abilità migliora con la pratica. In quarto luogo, la dispersione isolotto e placcatura avviene tale che tutte le isolette sono dispersi in una miscela di singole cellule e piccoli gruppi di due o tre celle. Sovra e sotto-digestione di isolotti prima di placcatura interferire con le prestazioni sperimentale. Appena placcati isolotto cellule devono essere all'incirca del 50% confluenti prima diffusione e permesso di allegare il 48 hr senza essere disturbato. Figura 1 mostra l'aspetto di colture cellulari isolotto successo in vari momenti dopo la placcatura. In quinto luogo, i cambiamenti dei media per colture isolotto-cellulari sono fatti con cura per evitare l'interruzione delle cellule debolmente aderenti. Sesto, recupero dell'antigene deve essere fatto con cautela per evitare deformazioni della piastra multi-perfetto ma sufficientemente per consentire successo Ki-67 colorazione che è sensibile sia sovra e esposizione a innalzamento della temperatura; piastre deformato non possono essere utilizzati peracquisizione delle immagini automatizzata. Nota, eccessiva del pancreas la digestione, l'esposizione di frammenti di tessuto esocrina e / o tripsinizzazione sono le cause più comuni per la mancata cultura isolotto cellule.
Una limitazione di questo protocollo è l'affidamento su marcatori di espressione specifici per l'identità β-cellulare e eventi di replica. L'utilizzo di singoli marcatori ha il potenziale per essere fuorviante. Per esempio, PDX-1 è espresso da cellule beta, un sottoinsieme di δ-cellule somatostatina esprimono e progenitori β-cellule 29,30; di conseguenza, composti che aumentano la replica PDX-1-cellule potrebbero essere specificamente agisce su una popolazione non-β-cellule. Di conseguenza, studi di conferma che utilizzano marcatori β-cellule alternativi sono necessari. Allo stesso modo, Ki-67 espressione non è un indicatore perfetto per la replica e indicatori aggiuntivi come BrdU e fosfo-istone 3 deve essere utilizzato 31. Una seconda limitazione di questo saggio è che i composti che inducono la replicazione β-cellule possono simultanéneamente aumentare l'apoptosi β-cellulare o de-differenziazione. Quindi, è importante valutare se un composto induce un aumento assoluto del numero β-cellula e / o induce apoptosi β-cellulare e se cellule beta composti trattate mantengono la funzione normale (glucosio-stimolata la secrezione di insulina) 32. Una terza limitazione di questo saggio è il throughput modesta associata all'uso di isolotto cellule primarie; isolotti di sei ratti genera 228 pozzi sperimentali che permettono ~ 55 composti per essere sottoposti a screening in quadruplice copia (più controlli positivi e negativi). Un'ulteriore limitazione della piattaforma di screening replica β-cellule descritto è l'uso di isole di ratto piuttosto che isole umane. Differenze tra isole umane e di ratto sono sufficienti per richiedere che tutti i composti di replica di promozione identificati utilizzando culture di ratto delle isole sono confermati utilizzando colture isolotto umane. Tuttavia, data la disponibilità limitata, e il costo elevato di isole umane, screening primario con i umanaslets è impraticabile per la maggior parte dei ricercatori.
I vantaggi principali di questo protocollo sono: 1) l'uso di isolotti primarie appena isolate per mantenere i normali vincoli di crescita nella maggior misura possibile, 2) l'uso di un formato di 384 pozzetti per consentire throughput screening moderata (in genere isole isolate da sei ratti sono sufficienti per 228 pozzetti) e 3) l'uso di acquisizione automatica delle immagini e di analisi per accelerare il ritmo di sperimentazione e limitare bias. Al contrario, gli approcci alternativi comunemente usati si basano su l'acquisizione delle immagini manuale e la valutazione personale di eventi di replica β-cellule o intero isolotto incorporazione di timidina radioattivo che non discriminano tra cellule-linages, esempio fibroblasti contro la replicazione β-cellule 15,17. Quindi, il protocollo presentato rappresenta uno strumento importante e migliorato per indagare la crescita-regolazione delle cellule beta.
Prevediamo una varietà di adattatautilizza per questa piattaforma di screening. In primo luogo, un aumento assoluto del numero β-cellula può essere misurata contando il numero di PDX-1 + - o insulina + -cellule. Per tenere conto della variabilità del numero di cellule piastrate per pozzetto un maggior numero di repliche per condizione può essere incluso (tipicamente n = 8). In secondo luogo, la piattaforma può essere adattato per la sovraespressione lentivirus-based o esperimenti di knock-out / giù per individuare percorsi coinvolti nella replicazione β-cellule. In sintesi, la tecnica sperimentale descritto è ampiamente utile per identificare i composti e le vie molecolari che regolano la replicazione β-cellule.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 g male Male Sprague Dawly Rat | Charles River | Stain # 400 | |
| 12 cm teeth tisuue forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 11.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| 14.5 cm surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | |
| 16 cm curved forceps | Fine Science Tools | 11003-16 | |
| 12 cm curved hepostat | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| 12 cm scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Tissue sieve-30 mesh | Bellco Glass | 1985-85000 | |
| Cizyme RI, 375,000 CDA units | VitaCyte | 005-1030 | |
| Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) | Gibco | 24020-117 | |
| Ketamine HCl (200 mg/20 ml) | JHP Pharmaceuticals | NDC# 42023-113-10 | to make anesthetic cocktail |
| Xylazine (5 g/50 ml) | LLOYD | NADA# 139-236 | to make anesthetic cocktail |
| Histopaque 1077 | Sigma | H-1077 | to make histopaque 1100 |
| Histopaque 1119 | Sigma | H-1119 | to make histopaque 1100 |
| Newborn Calf Serum 500 ml | Hyclone | SH30118.03 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Hyclone | SH30268.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose | Hyclone | SH30021.01 | |
| Functionality/Viability Solution | Mediatech | 99-768-CV | |
| RPMI1640 media | Hyclone | SH30096.01 | to make conditioned medium |
| 804G rat bladder carcinoma cell-line | Available upon request | to make conditioned medium | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 26160 | |
| GlutaMax-I | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml) | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Formamide 500 ml | Fisher BioReagents | BP227-500 | |
| Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0) | Vector Laboratories | H-3300 | to make 0.15 M Sodium Sitrate solution |
| Dextrose, Anhydrous | EMD Chemicals | DX0145-1 | to make 1 M glucose solution |
| Nomal Donkey Serum (Powder) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Mouse anti-human Ki67 antibody | BD Biosciences | 556003 | |
| Goat anti-human PDX-1 antibody | R&D Systems | AF2419 | |
| Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody | Dako | 2016-08 | |
| Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody | Dako | 2014-06 | |
| Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody | Dako | 2011-08 | |
| Polyclonal chicken anti-vimentin antibody | abcam | ab24525 | |
| Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | |
| StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated | Invitrogen | S32354 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-025-147 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-025-148 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-025-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-175-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG | Jackson ImmunoResearch | 703-175-155 | |
| DAPI | Millipore | S7113 | |
| Disposable Reagent Reservoir 25 ml | Sorenson BioScience | 39900 | |
| 384 well, black/clear, tissue culture treated plate | BD Falcon | 353962 | |
| 96 well, black/clear, tissue culture treated plate | Costar | 3603 | |
| Multi-channel pipettor | Costar | 4880 | |
| 12-channel vaccume aspirator | Drummond | 3-000-096 | |
| Cell Scraper | Falcon | 353085 | |
| Isotemp Water Bath Model 2223 | Fisher Scientific | ||
| High-content screening instrument: ArrayScan VTI | Thermo Scientific |
References
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