本文介绍了一种利用1.94 µm连续波激光辐射加热培养皿中细胞的原创实验装置。利用该方法，可研究视网膜色素上皮（RPE）细胞在不同热暴露条件下的生物学反应。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种使用1.94 µm连续波铥激光对培养细胞进行加热以用于生物学评估的原创方法。铥激光辐射被水强烈吸收，通过热扩散使培养皿底部的细胞受热。一根直径为365 µm的激光光纤被放置在培养皿上方约12 cm处，不使用任何光学元件，使激光光束直径几乎等于培养皿的内径（30 mm）。通过在每次实验中保持培养基体积一致，可实现对细胞施加高度可重复的温度升高。
为校准每个功率设置下单个细胞培养皿内的温度升高及其分布情况，在不同位置及细胞水平上测量了激光照射10秒期间的温度变化。使用数学图形软件对温度分布进行可视化表征，结果显示培养皿中的温度分布呈高斯形式。激光照射后，可开展不同的生物学实验以评估温度依赖性的细胞反应。本文中采用的是活/死染色（即， 引入区分活细胞、凋亡细胞和死细胞的方法，以帮助确定在不同时间点后细胞发生凋亡和死亡的阈值温度。
该方法的优点在于加热温度和时间的精确性，以及其在整块细胞培养皿中对细胞进行加热的高效率。此外，该方法允许在广泛的温度和时间范围内开展研究，并可通过计算机操作系统实现良好的控制。
引言
理解温度依赖性的细胞生物学反应对于成功实施热疗至关重要。在眼科中使用的可见光热激光视网膜光凝治疗是医学领域最成熟的激光治疗手段之一。视网膜激光治疗主要采用绿光至黄光波段的可见光。该光被视网膜色素上皮（RPE）细胞中的黑色素强烈吸收，而RPE细胞构成视网膜最外层的单细胞层。近年来，临床医生和研究人员对极轻微热辐射（即亚可见光凝）作为多种视网膜疾病新型治疗策略的兴趣日益增加1,2。顺应这一趋势，我们的研究关注在精确温度控制下对RPE细胞进行亚致死性加热，该技术称为温度控制光热疗法（TC-PTT）。
我们研究所近期开发的光声技术，可实现对视网膜照射部位温度升高的实时测量，从而在照射过程中对温度升高进行有效控制3然而，由于此前无法测量和控制温度，由RPE细胞亚致死性加热引起的视网膜亚致死性热损伤一直未被重视，因此热激光照射后RPE细胞的温度依赖性细胞反应至今研究甚少。此外，不仅不同温度条件下的差异尚未被深入讨论，亚致死性与致死性照射后存活细胞行为的差异也未得到充分阐明。因此，为了积累基于TC-PTT治疗的科学证据，本研究旨在阐明RPE细胞温度依赖性的生物学反应及其作用机制 体外 实验装置。
为此，有必要建立一种满足以下条件的细胞加热装置：1）能够实....
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方案
1. 视网膜色素上皮细胞培养
- 从猪眼分离视网膜色素上皮细胞
- 从当地屠宰场获取新鲜摘除的猪眼，保持低温（4 °C）并在避光环境中。
- 用剪刀去除眼组织的外部组织，并将眼球置于消毒液中浸泡5分钟。
- 将眼球置于无钙、无镁的灭菌磷酸盐缓冲液（PBS (-)）中，待用。
- 使用手术刀在角膜缘后约5 mm处刺穿巩膜。用剪刀沿与角膜缘平行的方向完全剪切，切除眼球的整个前部。
- 移除眼部的前部结构（即， 角膜和晶状体）以及玻璃体。加入1 mL PBS (-)，轻轻去除神经视网膜。
注意：此“眼杯”（由巩膜、脉络膜和视网膜色素上皮组成）现已准备就绪。 - 加入预热的（37 °C向眼杯中加入 PBS (-) 配制的 0.25% 胰蛋白酶，调整体积使胰蛋白酶溶液约占眼杯容积的 80%。
- 将眼杯与胰蛋白酶溶液在5% CO₂条件下孵育2 孵育箱在 37 °C 10 分钟
- 将眼杯从培养箱中取出，弃去0.25%胰蛋白酶溶液，加入含0.05%胰蛋白酶和0.2%乙二胺四乙酸四钠盐（EDTA·4N）的PBS（-）溶液。将眼杯置于培养箱中孵育45分钟。
注意：45 分钟后，RPE 细胞将仅松散地附着于布鲁赫膜，或已完全脱离并漂浮于胰蛋白酶-EDTA 溶液中。 - 通....
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结果
不同功率设置后的温度分布
在温度校准过程中，监测了每次单独辐照的所有温度变化。根据这些数据，获得测量点的最高温度，并将其定义为 Tmax (°C)。如图3A所示，当培养皿放置在加热板上时，程序即开始运行。在需要达到培养基温度稳定于37 °C的140秒“预热时间1”之后，进入持续8秒的“预热时间2”，在此期间移除培养皿盖。在“预热时间2”结束时，激光发射自动开始。该曲线代表了持续10秒辐照的典型温度变化过程。在辐照期间，温度上升；激光关闭后，温度立即开始下降。本研究中将培养皿中心点的最高温度定义为 Tmax (°C)。Tmax 与激光功率成正比（图3B）。图3C展示了不同激光功率下培养皿内最高温度的分布情况。如
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讨论
在讨论与温度相关的生物细胞反应时，不仅温度本身，而且温度升高的持续时间也十分重要，因为大多数生化过程都具有时间依赖性。尤其在眼科领域的激光诱导热疗中，由于作用时间极短——从毫秒到秒量级——在精确控温条件下研究细胞的热效应十分困难。因此，亟需一种适用于细胞培养模型、并配备能够严格控制温度和时间的操作系统的激光照射装置。对热刺激后细胞反应（如蛋白质表达或分泌）进行生物学评估时，需要对足够数量的受影响细胞进行重复的定量分析。而临床治疗中常用的直径达数百微米的激光光斑，给此类研究带来了障碍，因为在单个激光照射区域进行定量分析工作量极大。本研究尽可能地尝试满足上述需求。通过使用波长为1.94 µm的连续波铥激光器，并结合照射控制程序，可在短时间内对整个细胞培养体系实现可控的温度上升。由于通过调节光路可调整温度分布，因此该装置可用于开展多种类型的与热疗相关的实验。
本技术的局限性在于无法在激光照射细胞的同时进行温度测量。由于热电偶不适用于无菌的细胞培养环境，温度校准必须在细胞照射之外单独进行。考虑到激光输出功率可能存在波动，若能在每次激光照射过程中实时测量温度，将有助于直接评估与热剂量相对应的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了德国联邦教育与研究部（BMBF）（资助号 #13GW0043C）以及欧洲航空航天研究与发展办公室（EOARD，资助号 # FA9550-15-1-0443）的研究资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂 | |||
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 中等-高葡萄糖培养基 | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | 使用前添加（2）-（4），37℃温育 °使用前将水浴箱预热至 C。 |
| 抗生素-抗真菌溶液（100 ×) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | 含有10,000单位青霉素、10 mg链霉素和25 μg 两性霉素B溶于1 mL。使用前，在500 mL培养基瓶（1）中加入5.5 mL。 |
| 丙酮酸钠（100 mM） | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | 使用前向500 mL培养基瓶（1）中加入5.5 mL（终浓度：1 mM） |
| 猪血清 | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | 使用前在500 mL培养基瓶中加入50 mL（1）（终浓度：10%） |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| 猪胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| 人VEGF Quantikine ELISA试剂盒 | R&D 系统 | DVE00 | |
| Oxiselect 总谷胱甘肽检测试剂盒 | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| 凋亡/坏死/健康细胞检测试剂盒 | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>设备 | |||
| 铥激光 | Starmedtec GmbH | 原型 | 0-20 W |
| 365 mm 芯径光纤 | LASER COMPONENTS 德国 | CF01493-52 | |
| 热电偶 | Omega Engineering Inc | HYP-0-33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| 加热板 | MEDAX | ||
| 酶标仪（荧光分光光度计） | 分子装置 | Spectramax M4 | |
| 细胞匀浆器 | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| 荧光显微镜 | 尼康 | ECLIPSE Ti | |
| 数学软件程序 | The Mathworks. Inc | MATLAB R2015b 版本 | |
| 系统设计平台 | 国家仪器公司 | Labview | 实验室虚拟仪器工程工作台 |
参考文献
- Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
- Roider, J., et al.
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重印与许可
