Introduction
La metilazione delle basi citosina nel DNA (5MC) rappresenta un segno importante epigenetica trovato nei vertebrati genoma associate a trascrizionale silenziamento 1. 5MC viene introdotto e mantenuto da DNA metiltransferasi 2-5, e ha dimostrato di giocare un ruolo importante in molti processi biologici tra cui imprinting genomico, inattivazione del cromosoma X, differenziazione cellulare, e sviluppo 3, 6. Di conseguenza, l'interruzione della 5MC modelli genomici è associato con un certo numero di malattie 7, 8-11. Nonostante i progressi nella comprensione del ruolo 5MC nello sviluppo e nella malattia, è ancora rimangono in gran parte sconosciuto come questo marchio è stato rimosso in via di sviluppo e tessuti adulti. Diversi meccanismi potenziali di demetilazione DNA sono stati recentemente proposti compresi meccanismi attivi e passivi demetilazione 12, 13, 14, 15. Scoperta dei prodotti di ossidazione 5MC sequenziale mediate da TEN-eleven traslocazione enzymES (tet1 / 2/3) come il 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC), e 5-carboxylcytosine (5caC) in eucarioti DNA 16, 17, 18, 19 ha spinto le speculazioni se essi possono servire come intermedi di processi demetilazione del DNA o segni epigenetici agire come stabili nel loro diritto 13. Mentre la dimostrazione che la componente di base di riparazione per escissione, glicosilasi timina-DNA (TDG) può legare e rimuovere sia 5FC e 5caC dal DNA 19, 20 suggerisce un ruolo per i derivati 5MC modificati in una demetilazione del DNA attiva. Recenti evidenze che dimostrano che 5FC / 5caC in grado di modulare il tasso di punti processività RNA II al potenziale coinvolgimento di questi marchi nella regolazione trascrizionale 29. A causa di questo potenziale importanza biologica delle forme ossidate di 5MC, una serie di tecniche biochimiche e anticorpi base sono stati impiegati per studiare la loro distribuzione genomica e contenuti globali 16, 19-24.
Dato che la maggior parte di tha vertebrato organi sono costituiti da diversi tipi di cellule e che la distribuzione delle basi citosina modificati è tessuto e cellula-specifico tipo 16-18, 20, 23, 25-27, determinare la distribuzione spaziale dei derivati 5MC ossidati in diversi tessuti diventa un importante sperimentale compito necessario per svelare le loro funzioni biologiche. La maggior parte degli approcci biochimici e anticorpi base non forniscono alcuna informazione territoriale sulla distribuzione delle forme modificate di 5MC nel tessuto diverso e tipi di cellule. Al contrario, le tecniche di immunochimica possono fornire uno strumento rapida per valutare la distribuzione spaziale e localizzazione nucleare di 5MC 28 e suoi derivati ossidato 20. Che si dice, l'riportate molto bassa abbondanza di 5FC (20 in ogni 10 6 citosina) e 5caC (3 in ogni 10 6 citosina) nel genoma del topo 18 rappresenta una sfida significativa per immunochimica standard.
Qui,si descrive un metodo immunochimico altamente sensibile che fornisce robustezza ed una rapida individuazione della forma ossidata di citosina nel tessuto cerebrale dei mammiferi. Incorporando anticorpi secondari coniugati con perossidasi accoppiato con un passo di amplificazione del segnale, questo metodo aggira le sfide di rilevare le quantità molto basse di 5FC e 5caC. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per co-rilevare le forme modificate di citosina con marcatori specifici lignaggio, integrando efficacemente altri approcci a chiarire le funzioni biologiche di questi segni epigenetici.
Protocol
Tutte le procedure di origine animale coinvolti sono stati eseguiti in accordo con l'Università di Nottingham di bordo esame etico.
1. Selezione Preparazione del tessuto adatto per Immunocolorazione
- Genera sezione di paraffina-embedded di wild-type embrioni CD1 del mouse e tessuti adulti cerebrali come descritto in precedenza 25. Utilizzare sezioni di tessuto cerebrale fisse sia con il 4% di formaldeide (FA) o 4% paraformaldeide (PFA) per il metodo di 25 immunocolorazione.
NOTA: L'uso di sezioni di tessuto paraffina richiede de-ceretta prima di etichettatura degli anticorpi. Dal momento che il trattamento con 2-4 M di acido cloridrico (HCl) impiegato nel protocollo per la denaturazione del DNA non è compatibile con la maggior parte delle strategie di recupero dell'antigene, si consiglia l'uso di una sezione cryo- o microtomo per co-rilevazione dei derivati di ossidazione 5MC con proteine marcatori.
2. deparaffinazione paraffina del tessuto integrato Sezioni < / P>
- In una cabina di sicurezza classe in esecuzione II, lavare la paraffina sezioni di tessuto incorporati in una vaschetta Coplin piena di xilene, 2 volte per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
NOTA: E 'importante utilizzare xilene fresco come la rimozione della paraffina incompleta può portare a pattern di colorazione incoerenti. - Dopo deceratura, rapidamente reidratare le sezioni di tessuto di lavaggio consecutivamente in 95, 75, e 50% di etanolo per 10 min ciascuno a RT.
3. Fissazione e permeabilizzazione di Cryo- e Sezioni microtomo
- Fissare le sezioni di tessuto reidratati mettendoli in entrambi ghiacciata 4% PFA o 4% FA per 15 minuti a RT.
- Rimuovere l'eccesso fissativo lavando sezioni in PBS (Phosphate Buffer saline) per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Permeabilize le sezioni di tessuto posizionando in una vaschetta Coplin riempita con PBX (0,5% Triton X-100 in PBS) per 30 minuti a RT. Rimuovere l'eccesso PBX lavando sezioni a breve in PBT (0,01% di Tween 20 in PBS).
- Posizionare le sezioni permeabilizzate in 2 N HCl per 60 minuti a temperatura ambiente per depurinazione del DNA.
NOTA: Anche se alte concentrazioni di HCl (ad esempio, 4 N) portare ad una più efficiente denaturazione del DNA, che non sono compatibili per la co-rilevamento di ossi-mC con DAPI. - Posizionare le sezioni in 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) per 30 minuti a RT per neutralizzare il HCl. Alternativamente, lavare sezioni tre volte per 5 minuti ciascuno in PBS. Incubare le sezioni in PBT per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere con attenzione il liquido dalla zona circostante la sezione di tessuto senza lasciare che la sezione di tessuto per asciugare completamente in qualsiasi fase agitando delicatamente il vetrino. Utilizzare una penna barriera idrofobica a circondare la sezione senza toccare la sezione.
NOTA: La penna barriera idrofobica riduce il volume di anticorpo necessaria per macchiare il tessuto e può consentire più sezioni da colorate con different anticorpi sullo stesso vetrino. - Incubare sezioni in 100 ml di soluzione bloccante (10% di albumina di siero bovino in PBS) per 1 ora a RT in una camera umida.
NOTA: Saltare questo passaggio non inciderebbe l'efficienza di macchiare le basi citosina modificati. - Incubare le sezioni di tessuto in 100 ml di una diluizione 1: 5.000 del topo monoclonale anti-5hmC e una diluizione 1: 1.000 del policlonale di coniglio anti-5caC anticorpi primari nel bloccare soluzione per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umida. In alternativa, eseguire la notte di incubazione a 4 ° C, se necessario.
NOTA: Le sezioni processati senza anticorpi primari possono servire come idonei controlli negativi per la procedura di colorazione. I 12,5 giorni dopo coitum murine sezioni del cervello embrionali arricchito in 5caC, 5FC e 5hmC 20 può essere utilizzato come controllo positivo. - Rimuovere gli anticorpi in eccesso lavando sezioni in una vaschetta Coplin piena di PBT tre volte per 5 minuti ciascuno in una Copbarattolo lin a temperatura ambiente.
NOTA: L'aumento del volume di soluzioni di lavaggio può ridurre la colorazione di fondo. - Rimuovere l'eccesso PBT e, se necessario, circondare sezioni di nuovo con la penna barriera idrofobica come PBT contiene detergenti che possono indebolire la barriera idrofobica.
- Effettuare una diluizione 1: 400 di capra anti-coniglio anticorpo HRP-coniugato e una diluizione 1: 400 di asino anti-topo anticorpi 555 coniugato nel bloccare soluzione.
- Incubare le sezioni di tessuto in 100 ml di miscela anticorpo secondario dal punto 4.9 per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umida.
- Lavare le sezioni di tessuto in una vaschetta Coplin piena di PBT tre volte per 5 minuti ciascuno a RT.
- Posizionare le sezioni di tessuto in 100 ml di una diluizione 1: 200 di tiramide nel buffer amplificazione del segnale tiramide per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Immediatamente, rimuovere la soluzione in eccesso tiramide lavando i vetrini tre volte per 5 minuti ciascuno in PBT.
- carefully rimuovere l'eccesso di PBT e coprire immediatamente le sezioni con una goccia di un supporto di montaggio (vedi elenco dei materiali).
- Delicatamente mettere un vetrino sulle sezioni di tessuto e sigillare immediatamente il coprioggetto con smalto.
- Conservare le sezioni di tessuto a 4 ° C per diverse ore prima dell'esame microscopico. Esaminare al microscopio a fluorescenza a 405, 488 e / o 555 nm (10 - 40X di ingrandimento).
Representative Results
Per determinare la distribuzione delle 5hmC in sezioni di tessuto cerebrale, abbiamo eseguito co-rivelazione di questa modifica epigenetica con un marcatore per i neuroni post-mitotici, NeuN, impiegando l'anticorpo commerciale anti-5hmC che interagisce specificamente con questo marchio, ma non con altre forme di modifica citosina 20, 25. l'analisi immunoistochimica di 5hmC e 5caC distribuzioni nel cervello adulto ha rivelato che, mentre il primo piano colorazione 5hmC co-localizza con cellule positive NeuN, cellule gliali NeuN-negativi possiedono bassi livelli di genomica 5hmC (Figura 1) 20.
Abbiamo recentemente dimostrato che Tet-dipendente ossidazione 5MC è operativo durante la specifica stirpe di cellule staminali neurali (NSC) 20. Pur essendo immunochimicamente rilevabile nel NSC, 5FC e 5caC esibiscono immunostaining di primo piano nelle fasi iniziali della differenziazione neuronale NSC verso un nd lignaggi gliali. Entrambi questi segni transitoriamente si accumulano in concomitanza con aspetto degli indicatori di neuronale precoce e la differenziazione gliale 20. Per determinare la distribuzione delle 5caC nel differenziare NSC abbiamo effettuato co-marcatura di questo segno con un pennarello GFAP gliale sulle culture fissi di NSC a 3 giorni di induzione della differenziazione gliale. A differenza di NSC o astrociti maturi (dati non riportati), abbiamo osservato segnale forte 5caC in percentuale relativamente alta delle cellule che esprimono GFAP in queste culture (Figura 2) 20.
Figura 1. La co-immunocolorazione di 5hmC (verde) con NeuN (rosso) nel tessuto del cervello adulto di contrasto con DAPI (blu). I singoli canali e la vista dalla fusione sono mostrati. Barre di scala sono 25 micron.blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Co-immunocolorazione di 5caC con GFAP nella cultura di NSC al Day 3 del Glial Differenziazione. I singoli canali e la vista dalla fusione sono mostrati. Barre di scala sono 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Sebbene la bassa abbondanza riferito derivati ossidazione 5MC, 5FC e 5caC in alcuni tessuti potrebbe presentare limitazioni significative per un protocollo immunochimica standard, l'incorporazione di anticorpi secondari coniugati con perossidasi ha permesso la rilevazione di tali modifiche citosina in tessuti e cellule fissate (Figura 2) . Tuttavia, il tempo ottimale di incubazione con la soluzione tiramide deve essere ottimizzata sperimentalmente per ciascun lotto di tiramide kit di amplificazione del segnale in cui viene osservata una relazione lineare tra l'intensità del segnale e la durata di amplificazione del segnale basato tiramide, per i dettagli si riferiscono a Almeida et al. 2012 26 . Inoltre, il rapporto segnale / sfondo può essere notevolmente migliorata portando i lavaggi in una vaschetta Coplin per consentire la rimozione efficiente di anticorpi in eccesso. Dopo l'incubazione con la soluzione tiramide, è importante interrompere immediatamente la reazione mediante lavaggio in soluzione PBT a dsfondo ecrease colorazione. È fondamentale non permettere alle sezioni asciugare in qualsiasi momento durante la procedura.
L'efficienza di depurinazione DNA può essere migliorata effettuando la reazione depurinazione a 37 ° C. Durante l'utilizzo di 4 N HCl invece di 2 N migliora la colorazione delle forme modificate di 5MC utilizzando 4 N HCl per depurinazione DNA non avrebbe permesso di co-colorazione con DAPI, come interagisce esclusivamente con DNA a doppio filamento.
Sebbene questa tecnica può fornire solide analisi semi-quantitativa delle forme modificate di basi citosina dove rilevabile, non può essere utilizzato per valutare i livelli assoluti di 5MC o suoi derivati di ossidazione. Pertanto, si consiglia l'uso di altri complementari ma quantitativa approcci 16, 19 -24. Dalla scoperta del 5MC derivati di ossidazione nei genomi dei mammiferi, diversi approcci sono stati sviluppati per studiare i loro ruoli biologici 16, 19-24. Anche se questi avvicinamenches possono essere utili nel determinare i livelli assoluti di derivati di ossidazione 5MC, non forniscono informazioni sulle loro distribuzione spaziale 20, 26. Abbiamo usato con successo il metodo descritto qui per mappare la distribuzione spaziale e la localizzazione dei derivati di ossidazione 5MC in diversi tipi di cellule di sviluppo e cervello adulto 20
Rivelando la loro distribuzione spaziale 20, questa tecnica può essere fondamentale per comprendere le implicazioni biologiche e il destino dei derivati ossidati di 5MC in vari contesti biologici in cui questi derivati modificati di 5MC possono essere rilevati tra cui cellulari differenziazione, lo sviluppo e la malattia. Inoltre, il metodo che descriviamo qui può dare valutazioni semi-quantitativa dei derivati ossidati di 5MC in diversi tessuti valutando la cinetica di reazione perossidasi (che è proporzionale alla intensità di colorazione) a differenti tempi di incubazione con tyramide 26.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
| Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
| Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pH 7.5, filtered before use |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| 4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50% in PBS |
| 0.01% Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
| 0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
| 2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
| 100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | pH adjusted to 8.5 |
| hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
| Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
| anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
| Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
| 555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
| 10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
| 22 x 32 mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
| Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Colourless nail polish | |||
| chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
| anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |
References
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