Induzierung einer Site Specific Replikation Verstopfungen in E. coli Ein fluoreszierendes Repressor Operator System verwenden

Summary

Wir beschreiben hier ein System, das einen ortsspezifischen, reversiblen in vivo Proteinblock verwendet, um Replikationsgabeln in Escherichia coli zu blockieren und zu kollabieren. Die Etablierung des Replikationsblocks wird durch Fluoreszenzmikroskopie evaluiert und die neutral-neutrale 2-dimensionale Agarose-Gelelektrophorese wird zur Visualisierung von Replikationszwischenprodukten verwendet.

Abstract

Hindernisse, die auf DNA, einschließlich fest gebundene Proteine ​​und verschiedene Läsionen, kann das Fortschreiten der Zelle Replikationsmaschinerie stark hemmen. Das Abwürgen eines replisome kann aus dem Chromosom zu seiner Dissoziation führen, entweder teilweise oder vollständig, um den Zusammenbruch der Replikationsgabel führt. Die Erholung von diesem Zusammenbruch ist eine Notwendigkeit für die Zelle genau vollständige Chromosomen Vervielfältigung und anschließend unterteilen. Daher wird, wenn der Zusammenbruch auftritt, hat die Zelle verschiedene Mechanismen entwickelt, die stattfinden, um die DNA Gabel und erlauben die Replikation wiederherzustellen mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden. Zuvor wurden diese Replikationsreparaturwege in Bakterien unter Verwendung von UV-Schäden untersucht, was den Nachteil hat, nicht auf einen bekannten Ort lokalisiert ist. Dieses Manuskript beschreibt ein System mit einem Fluoreszenz-Repressor Operator System (FROS) unter Verwendung eines ortsspezifischen Protein Block zu erstellen, die ein Abwürgen und Zusammenbruch der Replikation induzieren kann foRKS in Escherichia coli. Protokolle Detail, wie der Status der Replikation kann in einzelnen lebenden Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und DNA-Replikationszwischenprodukte dargestellt werden kann durch 2-dimensionale Agarose-Gelelektrophorese analysiert werden. Temperaturempfindlichen Mutanten von replisome Komponenten (zB DnaBts) können in das System eingebaut werden , um einen synchronen Kollabieren der Replikationsgabeln zu induzieren. Ferner sind die Rollen der Rekombinationsproteine ​​und Helikasen, die an diesen Prozessen beteiligt sind, können unter Verwendung von genetischen Vorprägungen in diesem System untersucht werden.

Introduction

Während der DNA-Replikation, steht die replisome Hindernisse auf der DNA, die ihr Fortschreiten beeinträchtigen. DNA - Schäden , einschließlich Läsionen und Lücken sowie anomale Strukturen können die replisome , fortzusetzen ¹ zu verhindern. Vor kurzem wurde gefunden , dass an die DNA gebundenen Proteine ​​die häufigste Quelle für Hindernis sind ² fork Progression Replikation. Das Wissen über die Ereignisse im Anschluss an die Begegnung der replisome mit einem Nukleoprotein Block an einem bekannten Ort durch die Unfähigkeit beschränkt zu induzieren einen solchen Block in das Chromosom einer lebenden Zelle vorher. In - vitro - A....

Protocol

1. Sperrung Replikation mit FROS

1. Induzierung der Replikation Verstopfungs
   1. Verdünnen Sie eine frische über Nacht Kultur eines E. coli Stamm , der ein tetO - Array und PKM1 ¹⁸ bis OD _{600 nm} = 0,01 in einer verdünnten komplexen Medium (0,1% Trypton, 0,05% Hefeextrakt, 0,1% NaCl, 0,17 M KH ₂ PO _4, 0,72 MK ₂ HPO ₄₎ mit Antibiotika Durchführung nach Bedarf zur Auswahl.
      Hinweis: Fügen Sie nicht Tetracyclin zur Auswahl, da es nicht mit diesem System kompatibel ist. Machen das Volumen der Kultur entsprechend 10 ml pro Probe erforderlich. Zum Beispiel ist das Kulturvolu....

Results

Die FROS ein induzierbarer, ortsspezifische Nukleoprotein Block, der Replikationszwischenprodukte ermöglicht ^12,18 in lebenden Zellen visualisiert werden. Eine allgemeine experimentelle Design für Zellen Abtasten ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Zeitpunkt der Probenahme und Variationen in der genetischen Hintergrund dieses machen ein vielseitiges System für die Reparatur eines solchen Blocks zu studieren. Die schematische veranschaulicht , wie temperaturemp.......

Discussion

Während der Chromosomenduplikation stößt die Replikationsmaschinerie auf verschiedene Hindernisse, die ihren Fortschritt verhindern. Um sicherzustellen, dass das gesamte Single-Origin-Chromosom repliziert wird, haben Bakterien zahlreiche Wege zur Reparatur der DNA, die es dann ermöglicht, das Replisom neu zu laden^20,21. Läsionen, einzelsträngige Brüche, doppelsträngige Brüche und Proteine, die eng an die DNA gebunden sind, können jeweils über einen speziellen Weg behandelt werden, obwohl es wahrscheinlich zu e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypton	Sigma-Aldrich	16922	Komponente von Wachstumsmedien
Natriumchlorid	VWR	27810.364	Komponente von Wachstumsmedien
Hefeextrakt	Sigma-Aldrich	92144	Komponente von Wachstumsmedien
Kaliumphosphat monobasisch	Sigma-Aldrich	P9791	Komponente von Wachstumsmedien; Kaliumpufferkomponente
Kaliumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	P3786	Komponente des Wachstumsmediums; Kaliumpufferkomponente
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	Zur Induktion der TetR-YFP-Produktion
Anhydrotetracyclinhydrochlorid	Sigma-Aldrich	37919	Freisetzung des Replikationsblocks
Axioskop 2 Fluoreszenzmikroskop	Zeiss	452310	Visualisierung von Zellen
eYFP Filterset	Chroma Technology	41028	Visualisierung der YFP
CCD-Kamera	Hamamatsu	Orca-AG	Visualisierung der Zellen
MetaMorph  Software (Molekulare Bauelemente)	SDR Scientific	31282	Version 7.8.0.0, die bei der Erstellung dieses Manuskripts verwendet wurde
Agarose	Bioline	BIO-41025	Für Agarose-Plugs und Gelelektrophorese
Original Glass Water Repellent (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	Für die Herstellung von Agarose-Plugs
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, TBE-Pufferkomponente
Ethylendiamintetraessigsäure	Ajax Finechem	AJA180	0,5 M EDTA Dinatriumsalzlösung, eingestellt auf pH 8,0 mit NaOH.
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002	Bakteriostatikum
Salzsäure	Sigma-Aldrich	258148	TE-Pufferkomponente
Natriumdesoxycholat	Sigma-Aldrich	D6750	Zelllysepufferkomponente
N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz (Sarkosyl)	Sigma-Aldrich	L5125	Zelllyse- und ESP-Pufferkomponente
Rnase A	Sigma-Aldrich	R6513	Zelllyse-Pufferkomponente
Lysozym	Amresco	6300	Zelllyse-Pufferkomponente
Proteinase K	Amresco	AM0706	ESP-Pufferkomponente
Sub-Cell Model 192 Cell	BioRad	1704507	Elektrophorese-System
UV-Transilluminator 2000	BioRad	1708110	Visualisierung der DNA
Ethidiumbromid	BioRad	1610433	Visualisierung von DNA
Borsäure	VWR	PROL20185.360	FSME-Komponente
Hybond-XL Nylon Memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) kann auch verwendet werden
3MM Whatman Chromatographiepapier	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern Blotting
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Vernetzung von DNA und Hybridisierung
Desoxyribonukleinsäure aus Lachsspermien	Sigma-Aldrich	31149	Hybridisierungspufferkomponente
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S5881	Denaturierungspufferkomponente
Trinatriumcitratdihydrat	VWR	PROL27833.363	Transferpuffer
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Amresco	227	Waschpufferkomponente
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A7906	Hybridisierungspufferkomponente
Random Hexamer Primer	Bioline	BIO-38028
Klenow-Fragment	New England BioLabs	M0212L
dNTP Set	Bioline	BIO-39025
Adenosin 5'-triphosphat-< sup>32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
Storage Phosphor Screen	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E Mehrzweck-Standard 35 cm x 43 cm Screen
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Visualisierung der Blot-Hybridisierungsflasche
	UVP	07-0194-02	35 mm x 300 mm