Este manuscrito apresenta um método de moldagem por injeção para engenheiro microvasos que recapitulam propriedades fisiológicas de endotélio. O processo baseado em microfluídico cria redes vasculares 3D patente com condições tailorable, tais como fluxo, composição celular, geometria e gradientes bioquímicos. O processo de fabricação e exemplos de aplicações potenciais são descritos.
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Artigo de método
Micropatterning e Montagem de microvasos 3D
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Em plataformas in vitro para estudar as células endoteliais e biologia vascular são largamente limitadas à cultura de células endoteliais 2D, câmaras de fluxo com o polímero ou com base substratos de vidro, e ensaios de formação de tubos à base de hidrogel. Estes ensaios, enquanto informativo, não recapitular geometria luz, matriz extracelular adequada, e proximidade multi-celular, que desempenham um papel-chave na modulação da função vascular. Este manuscrito descreve um método de moldagem por injeção para gerar vasos artificiais, com diâmetros da ordem de 100 mm. Microvasos são fabricados semeando células endoteliais em um canal microfluídico incorporado dentro de um tipo nativo I colágeno hidrogel. Ao incorporar nas células do parênquima dentro da matriz de colagénio antes da formação de canal, microambientes específicos de tecido podem ser modelados e estudados. modulações adicionais de propriedades e meios de comunicação hidrodinâmico composição permitir o controlo da função vascular complexa dentro do microambiente desejado.Essa plataforma permite o estudo de recrutamento perivascular de células, as interacções do sangue do endotélio, a resposta de fluxo, e as interacções de tecidos-microvascular. microvasos Engineered oferecer a capacidade de isolar a influência de componentes individuais de um nicho vascular e controlar com precisão as suas químicas, mecânicas e propriedades biológicas para estudar a biologia vascular na saúde e na doença.
Introdução
A microvasculatura em cada órgão ajuda a definir o microambiente tecido, manter a homeostase do tecido e regular a inflamação, a permeabilidade, a trombose, e fibrinólise 1,2. Endotélio microvascular, em particular, é a interface entre o fluxo de sangue e o tecido circundante e, por conseguinte, desempenha um papel crítico na modulação da função do órgão e vascular em resposta a estímulos, tais como as forças hidrodinâmicas e citoquinas e hormonas circulantes 3 - 5. Compreendendo as interacções específicas entre o endotélio, o sangue, e o microambiente circundante do tecido é importante para o estudo da biologia vascular ....
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Protocolo
1. Microfabricação de Patterned polidimetilsiloxano (PDMS) com Network Design
- De fabricação de wafer criar um modelo negativo do Projeto de Rede
- Criar um padrão de rede usando qualquer software assistida por computador (CAD). Certifique-se de que a dimensão diagonal entre a entrada e saída de acordo com a distância entre a entrada e saída reservatórios nos dispositivos da habitação em etapas futuras (ver 2.1.1).
Nota: O desenho do padrão em si é personalizado de acordo com os objetivos da pesquisa específicas do usuário (veja a Figura 1, por exemplo, padrões). - Gerar uma máscara do padrão de rede u....
- Criar um padrão de rede usando qualquer software assistida por computador (CAD). Certifique-se de que a dimensão diagonal entre a entrada e saída de acordo com a distância entre a entrada e saída reservatórios nos dispositivos da habitação em etapas futuras (ver 2.1.1).
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Resultados
O navio-plataforma projetada cria microvasculatura funcional incorporado dentro de um tipo natural de colágeno I matriz e permite um controlo apertado do ambiente celular, biofísicos e bioquímicos in vitro. Para fabricar microvasos modificadas, as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) são perfundidos através da rede microfluídicos embebidos em colágeno onde se fixam para formar um lúmen de patentes e endotélio confluentes. Como ilustrado na Figura 1A-C,
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Discussão
Engineered microvasos são um modelo in vitro onde as características fisiológicas, tais como a geometria do lúmen, as forças hidrodinâmicas, e interacções multi-celulares estão presentes e sintonizável. Este tipo de plataforma é poderosa na medida em que oferece a capacidade para modelar e estudar o comportamento endotelial numa variedade de contextos em que as condições de cultura in vitro podem ser combinados com a do microambiente em questão. Por exemplo, os mecanismos de condução processos endoteli.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de reconhecer a Lynn e Mike Garvey imagem Laboratório do Instituto de Células Estaminais e Medicina Regenerativa, bem como o Mecanismo de Washington Nanofabricação da Universidade de Washington. Eles também agradecem o apoio financeiro do Instituto Nacional de Saúde concede DP2DK102258 (para YZ) e formação concede T32EB001650 (a SSK e MAR) e T32HL007312 (MAR).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fabricação de Wafer | |||
| Sistema de Plasma AutoGlow | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Revestidor de Rotação | |
| Alinhador de contato ABM | AB-M | ||
| Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 Desenvolvedor | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8" wafer | de silício Wafer World Inc. | ||
| Gerador de Micro Padrão de Mesa | Heidelberg Instruments | μ PG 101 | Para geração de fotomáscara |
| Placa quente | VWR | 97042-646 | |
| Álcool ispropílico | Avantor Performance Materials | 9088 | |
| Placas de Petri (120 x 120 mm, quadradas) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
| Tricloro(3,3,3-trifluoropropil)silano | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
| Polidimetilsiloxano (PDMS) e agente de cura | Dow Corning | Sylgard 184 | Misturado a 10:1 (p/p) |
| Dessecador a vácuo | Forno Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| VWR | 9120976 | ||
| Fabricação e cultura de dispositivos | |||
| poli(metacrilato de metila) (PMMA) | Plexiglas | ||
| Corona Treater | Produtos Electro-Technic, Inc. | BD-20 | Dispositivo portátil para tratamento de plasma de dispositivos PMMA e moldes PDMS |
| Ferro de Solda | Weller | Parafuso de | |
| McMaster-Carr | 91785A096 | ||
| Pinos de aço inoxidável | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| Pinças | Miltex | 24-572 | Qualquer pinça semelhante pode ser usada |
| Espátula (Micro Colher) | Serviços de Microscopia Eletrônica | 62410-01 | |
| Chave | Qualquer chave de fenda de cabeça chata pode ser usada, autoclavada | ||
| Lamínulas de vidro (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Alvejante | Clorox | 4460030966 placas de | |
| Petri (150 x 25 mm) | Corning | 430599 | |
| placas de Petri (100 x 20 mm) | Corning | 2909 | |
| Algodão, cortado em pedaços | autoclavada | ||
| (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Diluir a 1% em água de grau de cultura de células |
| Glutaraldeído | Sigma-Aldrich | G6257 | Diluir a 0,1% em água |
| de grau de cultura de célulasEsterilizado H2O | DI autoclavado H2O | ||
| Colágeno tipo I, dissolvido em ácido | Isolado de caudas de rato conforme descrito em Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
| Seringa de 1 ml | BD | 309659 | |
| seringa de 10 ml | BD | 309604 | |
| tubos cônicos de 15 ml | Corning | 352097 | |
| Tubos cônicos de 30 ml | Corning | 352098 | |
| M199 10x Media | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1 N NaOH (estéril) | Sigma-Aldrich | 415413 | Diluir para 1 N em água de grau de cultura de células |
| HUVECs | Lonza | ||
| Meios de crescimento endotelial | Lonza | CC-3124 | |
| Tripsina | Corning | 25-052-CI | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| Dextrano de Leuconostoc spp. (70 kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| Hemocitômetro | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| Pontas de carregamento de gel | VWR | 37001-152 | |
| 18 G Agulha de enchimento sem corte | BD | 305180 | |
| 20 G Agulha de Dispensação de Aço Inoxidável | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| Tygon 1/32" ID, Tubulação de Silício OD 3/32" | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| Acoplamento Tubo-a-tubo de 1/16" | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° Conectores de Cotovelo, Tubo-a-Tubo | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| Luer Lock Coupling (Fêmea, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| Fórceps de Plástico, com Garras de Mandíbula Serviços de | Microscopia Eletrônica | 72971 | |
| Bomba de Seringa Dupla | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| 5 ml Poliestireno Tubo de fundo redondo | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Device Analysis | |||
| Formaldeído | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | diluição |
| de trabalho 1:25Anticorpo conjugado FITC anti-von Willebrand Factor | Abcam | ab8822 | 1:100 anticorpo |
| secundário anti-coelho 568 de cabra | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 diluição de trabalho |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Ressuspenso em DMSO |
| Cacodilato de sódio | Sigma-Aldrich | C0250 | Para fazer tampão de cacodilato de 0,2 M |
| Etanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40 kDa Dextran conjugado com FITC | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| adicionais < / strong > | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Inibidor de GSK-3 de molécula pequena |
| VEGF recombinante humano | Peprotech | 100-20 | |
| bFGF recombinante humano | Peprotech | AF-100-18B |
Referências
- Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
- van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol.
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Reimpressões e permissões
