Introduction
RNA-bindande proteiner (RBP-anordningama) utgör cirka 10% av S. cerevisiae proteiner 1,2 och ca 15% av däggdjursproteiner 3-5. De är inblandade i många cellulära processer såsom mRNA posttranskriptions bearbetning och reglering, översättning, ribosomen biogenes, tRNA aminoacylering och modifiering, kromatinremodellering och mer. En viktig undergrupp av RBP-anordningama är mRNA-bindande proteiner (mRNPs) 6,7. Under mRNA mognad, olika RBP-anordningama binder avskriften och förmedla sitt nukleära bearbetning, export av kärnan, cellulär lokalisering, översättning och nedbrytning 6-8. Således, den distinkta uppsättning av RBP-anordningama bundna till en viss utskrift vid någon tidpunkt bestämmer dess behandling och i slutändan dess öde.
Identifieringen av RBP-anordningama i samband med ett mRNA kan avsevärt förbättra vår förståelse av processer som ligger bakom deras post-transkriptionell reglering. skiftande genetisk, Mikroskopiska, biokemiska och bioinformatiska metoder har använts för att identifiera proteiner som är inblandade i mRNA-reglering (översikt i 11/09). Men endast ett fåtal av dessa metoder gör det möjligt att identifiera proteiner associerade med ett särskilt mål mRNA. Att notera är jäst tre hybridsystem (Y3H), som utnyttjar mRNA av intresse som bete för att screena ett uttrycksbibliotek i jästceller. Positiva kloner observeras vanligtvis genom en tillväxt val eller reporter uttryck 12-14. Den viktigaste fördelen med denna metod är den stora antal proteiner som kan skannas i en cellmiljö och förmågan att mäta styrkan av interaktion det RNA-proteinet. Nackdelar inkluderar det relativt stora antalet falska positiva resultat på grund av icke-specifik bindning och hög potential för falskt negativa resultat beror delvis på felveckning av fusionsproteinet byte eller betet RNA.
Ett alternativ till den genetiska tillvägagångssätt är affinitets purifiningen av RNA med sina associerade proteiner. Poly A-innehållande mRNA kan isoleras genom användning av oligo-dT kolonner, och deras associerade proteiner detekteras genom masspektrometri. interaktion RNA-proteinet är konserverad i dess cellulära sammanhang genom tvärbindning, vilket gör kortdistans kovalenta bindningar. Användningen av oligo dT kolumnen ger en överblick över hela proteomet som är associerad med någon poly A-innehållande mRNA 3,5,15. Men detta inte ger en lista av proteiner som är associerade med en viss mRNA. Mycket få metoder är tillgängliga för att fullgöra en sådan identifiering. Paret Metoden innebär transfektion av nukleinsyra med komplementaritet till mål-mRNA 16,17. Nukleinsyran är också kopplad till en peptid, som medger tvärbindning till RBP-anordningama i omedelbar närhet till den interaktionsställe. Efter tvärbindning, kan RBP-peptid-nukleinsyra isoleras och utsättas för proteomik analys. Nyligen var en aptamer baserad metodframgång tillämpas på extrakt från däggdjurscellinjer 18. En RNA-aptamer med förbättrad affinitet till streptavidin utvecklades och fuserad till en sekvens av intresse (AU-rika element (ARE) i detta fall). Den aptamer-ARE-RNA fästes till streptavidinpärloma och blandas med cellysatet. Proteiner som är associerade med ARE-sekvensen renades och identifierades genom masspektrometri (MS). Även om denna metod upptäckt föreningar som sker utanför de cellulära inställningar (dvs in vitro), är det sannolikt att ändras i framtiden, så att införa aptamers i genomet och därigenom möjliggöra isolering av proteiner i samband med mRNA medan i cellulära miljön (dvs in vivo). I jäst, där genetiska manipulationer är väl etablerade, den snabba metoden (utvecklad i Prof. Jeff Gerst labb) ger en bild av in vivo föreningar 19. RAPiD kombinerar den specifika och starka bindningen av MS2-höljeproteinet (MS2-CP) till MS2 RNA-sekvensen, och streptavidin-bindande domänen (SBP) till streptavidin konjugerade pärlor. Detta möjliggör effektiv rening av MS2-märkta mRNA genom streptavidinpärloma. Dessutom tillåter uttryck av 12 kopior av MS2 slingor upp till sex MS2-CPs att binda samtidigt till RNA och öka effektiviteten i sin isolering. Detta protokoll föreslogs därför att möjliggöra identifiering av nya mRNA-associerade proteiner när de eluerade proverna utsätts för proteomik analys med masspektrometri.
Vi nyligen utnyttjas Rapid för att identifiera nya proteiner som är associerade med jäst PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA har tidigare visat sig vara associerade med ER-membranet och dess 3 'otranslaterade region (UTR) befanns vara en avgörande faktor i denna förening 21. Således, RBP-anordningama som binder PMP1 3 'UTR kommer sannolikt att spela en viktig roll i dess lokalisering. RAPiD följt av vätskekromatografy-masspektrometri / masspektrometri (LC-MS / MS) resulterade i identifiering av många nya proteiner som interagerar med PMP1 20. Häri ger vi ett detaljerat protokoll av den snabba metoden, viktiga kontroller som behöver göras, och tekniska tips som kan förbättra avkastningen och specificitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Sätt i en sekvens som består av 12 MS2-bindningsställen (MS2 loopar, MS2L) till den önskade genomiska locus, vanligtvis mellan den öppna läsramen (ORF) och 3 'UTR. En detaljerad protokoll för denna integration föreskrivs någon annanstans 22. Verifiera korrekt insättning och uttryck av PCR, Northern analys eller RT-PCR 20,23. Det är viktigt att kontrollera att integrationen inte ingripa med syntesen av 3'UTR. Dessutom bör en plasmid uttryckande MS2-CP fuserad till SBP under expression av en inducerbar promotor (metioninutarmning) också införas i cellerna 24. En identisk stam, med undantag för de införda MS12 loopar, bör användas som en kontroll för detektion av icke-specifika signaler.
1. snabb rening
- Växa 500 ml jästceller (använd 250-1,000 ml jästceller beroende på uttrycksnivån av genen av intresse) som uttrycker MS2-märkta mRNA 20 ochMS2-CP-GFP-SBP-fusionsprotein 24 till OD 600 0,8-1,0 vid 30 ° C i ett lämpligt odlingsmedium (t ex syntetisk dextros (SD) selektivt medium).
- Centrifugera cellerna vid 3000 xg under 4 min vid RT och kassera supernatanten.
- Tvätta cellerna i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), centrifug som tidigare (steg 1,2), återsuspendera i en lika stor volym (steg 1,1) hos SD utan metionin, och inkubera under 45-60 min vid 30 ° C för att inducera expression av MS2 -CP-GFP-SBP-fusionsproteinet.
Obs: Längre induktionstiden kan orsaka aggregering av GFP. - Avsatt 10 ml celler och extrahera RNA från detta prov med hjälp av enkla "heta fenol" metod 25. Varning: Fenol är mycket giftigt och bör hanteras i enlighet med dess säkerhetsinstruktioner.
Obs: Detta RNA är en bra referens för kvaliteten på isolerade RNA (Figur 1A). - För 500 ml celler, tillsätt 1,35 ml 37% formaldehyd till en slutlig concentration av 0,1% för att tvärbinda de RNA-proteinkomplex. Fortsätta inkubation vid 30 ° C under 10 min. Varning: Formaldehyd är mycket giftigt och bör hanteras i enlighet med dess säkerhetsinstruktioner.
- Lägga 26,5 ml av 2,5 M glycin till en slutkoncentration av 0,125 M och inkubera under 3 minuter för att stoppa tvärbindning. Från detta steg på, sätta allt på is för att minimera RNA nedbrytning.
- Centrifugera cellerna vid 3000 xg under 4 min vid 4 ° C och tvätta med 45 ml kall 1 x PBS.
- Resuspendera cellerna i 1 ml snabb lys-buffert per 100 ml initial cellkultur.
- Uppdelad i alikvoter av 500 pl i skruvkork mikrofugrör och tillsätt ~ 400 mg av kylda glaspärlor till varje portion (ungefär en fullständig 0,2 ml PCR-rör).
- Lyserar celler i en vulst visp för 3 min. Omedelbart sätta lysatet på is.
Obs: cellys frigör cellulära RNaser, som är den största orsaken till RNA nedbrytning. Snabb lys buffert innehåller en hög koncentration av RNas inhibitors, såsom den icke-specifika RNas-inhibitor heparin och specifika inhibitorer. Arbeta snabbt och hålla allt kallt rekommenderas också. - Överför lysatet till nya rör. Pierce ett litet hål i botten av varje mikrofugrör med en varm nål (0,8 mm x 40 mm) och placera mikrofugrör på toppen av 15 ml rör. Använd huvudet av en 5 ml spruta som en adapter mellan mikrofugrör och 15 ml rör. Centrifugera rören aggregatet vid 3000 xg under 1 min vid 4 ° C
- Överföra genomströmning från 15 ml rör i ett annat 1,5 ml rör och centrifugera vid 10.000 xg under 10 min vid 4 ° C för att rensa cellrester.
- Pool supernatanter från alla 1,5 ml rör i en enda 15 ml rör, och avsätta 1/50 och 1/100 volym av lysatet för RNA och protein isolering, respektive.
Obs: Dessa kommer att fungera som "Input" prover för senare analys (Figur 1). - Tillsätt 300 mikrogram av avidin per 500 ml initial jästkultur och inkubera under 30 min (denna kan reduceras till 10 min) vid 4 ° C under konstant valsning (10 rpm).
Notera: Avidin block biotin och biotinylerade proteiner från att binda till streptavidinpärloma. - Pre-tvätta streptavidinpärloma före inkubering med cellysatet.
- Överför ca 300 | il av streptavidin pärlor uppslamningen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och avlägsna den övre supernatant. Detta kommer att resultera i 250 | il pärlor. Tvätta pärlor två gånger med 1 ml av snabb lyseringsbuffert. Centrifugera streptavidinpärloma vid 660 xg under 2 minuter vid 4 ° C mellan varje steg.
- Blockera pärlorna genom inkubering under 1 h med 0,5 ml av snabb lys-buffert, 0,5 ml 10 mg / ml BSA och 10 | il av 10 mg / ml jäst-tRNA. Pärlor kan lämnas O / N i blockerande lösning vid 4 ° C med rotation vid behov.
- Tvätta två gånger med 1 ml av snabb lys-buffert.
Obs: kan Magnetiska pärlor också användas för att minska tid och background. Dessa har dock lägre kapacitet än Sepharose pärlor.
- Tillsätt 250 | il av de förtvättade streptavidinpärloma till avidin-innehållande lysatrea (från steg 1,14) och inkubera 1 timme vid 4 ° C med konstant rotation (10 varv per minut).
OBS: Denna inkubationstid är en kompromiss mellan att ge tillräcklig bindning tid och minimera chanserna för RNA nedbrytning. - Centrifugera vid 660 xg under 2 minuter vid 4 ° C för att rensa streptavidinpärloma och överföra supernatanten till ett nytt 15 ml rör. Avsätt 1/50 och 1/100 volym av lysatet för RNA och protein isolering, respektive.
Obs: Dessa kommer att vara "Unbound" prover. - Tvätta pärlor med 1 ml snabb lys buffert, skaka försiktigt, förflyttas till en ny 1,5-ml mikrocentrifugrör och centrifugera som i steg 1,17. Upprepa detta steg tre gånger.
- Tvätta pärlor med 1 ml RAPID Tvättbuffert, och denna gång rotate (10 rpm) under 5 min vid 4 ° C. Upprepa detta steg två gånger. Tvätta pärlor med 1 ml 1 x PBS och centrifugera som ovan.
- Tvätta pärlor igen med 120 | il av 1 x PBS. Centrifug enligt ovan, och ta hela supernatanten för RNA och protein extraktion som "Wash" prov.
Not: Denna sista tvättn prov kommer att indikera stringensen av tvättarna och bör vara av samma volym som den Eluering provet. Detta kommer att förenkla bearbetning och lastning i efterföljande analyser. - Att eluera RNA och RNA-associerade proteiner från kolonnen, tillsätt 120 | il av 6 mM biotin i 1 x PBS och inkubera i 45 min vid 4 ° C med konstant rotation (10 varv per minut).
- Centrifugera pärlorna enligt ovan och överföra det eluerade materialet i ett annat 1,5 ml rör. Snurra det eluerade provet igen och överföra den övre fasen till ett nytt 1,5 ml rör för att säkerställa att ingen överföring av pärlor.
- Ta prover för RNA eller protein extraktion.
Obs! Volymen taken bör bero på följande analys och expressionsnivån av RNA eller protein av intresse. Som en riktlinje för Northern-analys 26, ta 80% av provet, för Western blot 23,27 eller RT-PCR 28, ta 20%, och för masspektrometri 29 för att upptäcka nya proteiner, ta hela provet.
2. RNA-extraktion
- Lägga till en lika stor volym av 2x Tvärbindning Återföring buffert och inkubera under 45 minuter vid 65 ° C. Fortsätt direkt för RNA-extraktion.
Obs: Tvärbindning Återföring Buffer innehåller etylendiamintetraättiksyra (EDTA), som avsevärt förbättrar RNA-extraktion 20. - Använd standard fenol: kloroform metod 26 för att extrahera RNA från "input" och "obundna" prov (steg 1,13 och 1,17).
Obs: Dessa prover innehåller en stor mängd av RNas inhibitor heparin, som kan hämma efterföljande Reverse Transcriptase- (RT) använder analyser (t.ex. RT-PCR), därför, LiCl utfällning 30 rekommenderas att ta bort den. Den "wash "och" eluerings "prov (steg 1,21 och 1,24) innehåller små mängder av RNA och fälls genom följande steg. - Tillsätt en lika volym av 8 M Guanidinium-HCl (GuHCl) och två volymer av 100% etanol till den "tvätt" och "elueringsbetingelser" prover. Inkubera vid -80 ° C under minst 2 h.
Obs: Guanidinium kommer effektivt denaturera proteiner och därigenom hämma RNaser och proteaser i provet. - Centrifugera vid 20000 xg, 4 ° C under 30 min och kasta bort supernatanten. Tvätta pelleten med kall 80% etanol och centrifugera igen vid 20000 xg, 4 ° C under 15 min.
- Upplösa RNA-pelleten i 400 | il RNas-fritt vatten och fälla ut igen för att avlägsna eventuell överbliven GuHCl eller andra föroreningar. Tillsätt 40 | il 3 M natriumacetat, pH 5,2 och 800 ul av 100% etanol, inkubera vid -20 ° C under minst en timme.
- Centrifugera och tvätta som i steg 2,4 och ta bort all etanol med en 10 l spets. Resuspendera RNA hulleret i 10 ul RNas-fritt vatten. Var extra försiktig när RNA-pelleten är vanligtvis inte syns.
Notera: Prov kan användas för Northern-analys, såsom beskrivs i 23 (figur 1).
3. Protein Förberedelser för Western Blot eller masspektrometri Analys
- Lägg 1/3 volym av 4x Laemmli provbuffert (LSB) till proteinprover och inkubera 45 minuter vid 65 ° C för att vända den tvärbindning av RNA och proteiner.
Notera: Prov kan förvaras vid -20 ° C. - Körs proteiner på en SDS-polyakrylamidgel (SDS-PAGE) 31. Justera procentandelen av gelén i enlighet med storleken av proteiner som skall analyseras.
Obs: 10% akrylamidgel ger ett brett spektrum av separation och är bra som en första approximation. - Överför proteiner till membran som i standard immunoblotanalys 27 för kontroll av isolering effektivitet (Figur 1C). Fläcka med antingen Coomassie Blue R250 eller silverfärgning före masspektrometrianalys.
Obs: Silver fläcken är det självklara valet eftersom det är mer känslig och ger bättre upptäckt (Figur 1B). Färgning kan göras med antingen manuellt framställda lösningar eller kommersiella kit. Inkubationstiden för gelén i den slutliga färglösningen bör bestämmas experimentellt. Lång inkubationstid kan avslöja mycket små mängder proteiner, men kan orsaka mycket uttryckta proteiner såsom MS2-CP-SBP-GFP vara över färgade och kan maskera omgivande proteiner i deras närhet. Dessutom kan en hög bakgrund uppträda. Följ reaktionen noggrant, och tillsätt stopplösningen vid en lämplig tidpunkt. - Skära ut banden från gelén och överföra dem till 1,5 ml rör. Förvara proverna vid -20 ° C, eller skicka efter proteinextraktion och trypsin digestion följt av LC-MS / MS-analys 32.
- Som ett alternativ proteomik metod för att utesluta gel separationssteget, smälta eluerade materialet från steg 1,24 i sålution användning av trypsin och föremål för LC-MS / MS-analys 33.
Obs: utelämnar SDS-PAGE separation förenklar protokollet och ökar avkastningen. Dock kan prover innehålla spår av detergenten NP-40, som hämmar masspektrometrianalys. För att lösa detta problem genom att utföra följande steg:- Köra protein på SDS-PAGE 31 under 10 - 15 min.
- Skära ut hela delen av banan (dvs. där proteinerna är belägna).
Obs: proteinprovet kan innehålla en betydande del av MS2-CP-SBP protein som kan skymma signalerna med låg förekomst proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RAPiD möjliggör isoleringen av en specifik mål-RNA med sina associerade proteiner. Kritisk för dess framgång är att hålla det RNA intakt så mycket som möjligt, varigenom man erhåller en tillräcklig mängd proteiner. För att bestämma isolerings effektivitet och kvalitet av RNA, är northern analys (Figur 1A). Northern-analys har fördelen att direkt rapportera effektivitet och kvalitet Rapid. Sålunda kan de relativa mängderna av full längd och nedbrytningsprodukter bestämmas i en enda körning. Ribosomala RNA (rRNA) detekteras lätt i etidiumbromidfärgning, och bristen på rRNA i elueringen provet indikerar stringens rening. Den stringens och specificitet reningen ytterligare framgår av avsaknaden av en signal av en omärkt mRNA i eluerings prover (ÄRV1 nedre panelen). Den skenbara signalen i FPR1 lane, som inte är av den storleken av ÄRV1, är en kvarleva från pregående hybridisering med MS2L sonden. Den Northern-analys visar också att den ingående RNA är något mer nedbruten jämfört med RNA, som renades genom den varma fenol-protokollet (c / o ÄRV1 sond panelen). Detta tillskrivs den längre och mer komplicerade RAPID protokoll. Icke desto mindre en betydande mängd av fullängds, taggade RNA isoleras specifikt, såsom avslöjas genom den starka signalen i elueringsfraktionen (MS2L prob).
Proteinprover kan köras på SDS-PAGE och färgades med silverfärg före proteomik-analys (Figur 1B). Ett prov som isolerats från kontroll, omärkta celler (-MS2L) är till hjälp i särskiljande ospecifika associationer från RNA-beroende sådana. Därför är endast band som är starkare i den märkta provet (+ MS2L) skars ut ur gelén och togs för LC-MS / MS. Western-analys med allmänna RBP-anordningama rekommenderas också för att indikera effektiviteten av protein co-rening (Figur1C). Häri använde vi Yef3, som är känd för att interagera med PMP1 20 eller GFP, vilket indikerar den totala effektiviteten och specificiteten av isoleringen. Intressant nog verkar effektivitet Yef3 isolering för att skilja mellan PMP1 och FPR1, och är mycket lägre jämfört med GFP.
Figur 1. Särskilt Isolering av MS2L-märkta RNA och Identifiering av associerade proteiner. Resultat från två olika RNA som utsattes för snabb (PMP1 och FPR1) presenteras. (A) Northern blot-analys av RNA-prov som renats från en snabb experiment. RNA kördes på en agarosgel och färgades med etidiumbromid (övre panelen). Gelén blottades till nylonmembran och utsattes för hybridisering med de indikerade sonder (lägre paneler). Proverna analyseras är: snabb cellslys (varm fenol [steg 1,4]), RaPID cellslys (input [steg 1,13]) och efter eluering med biotin (eluering [steg 1,24]). (B) Silver fläck av proteiner från Rapid med MS2-märkta och omärkta celler. Proteinprover från elueringsfraktioner av MS2-märkt PMP1 (+ MS2L) eller omärkt (-MS2L) kontroll kördes i SDS-PAGE och silverfärgades. Band med differentiell intensitet (indikerade med asterisker) skars ut från gelén och bestäms genom masspektrometrianalys. Pilen indikerar det MS2-CP-GFP-SBP-fusionsproteinet, vilket visar lika proteinladdning. Irrelevanta körfält var beskurna för tydlighetens skull. (C) Western-analys av positiva kontroller. Western blot med antikroppar som känner igen Yef3 eller GFP-delen av MS2-CP-fusionsprotein genomfördes. Irrelevanta körfält var beskurna för tydlighetens skull. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olika metoder använder isolering av specifika mRNA för att identifiera sina associerade proteiner 11,34 35. Dessa metoder tillämpas in vitro och in vivo strategier för att sondera RNA-proteininteraktioner. In vitro-metoder Inkubera exogent transkriberat RNA med cellysatet för att fånga RBP-anordningama och isolera RNP-komplex 36,37. En effektiv metod av detta slag lades fram nyligen, som gjorde det möjligt att identifiera nya proteiner som binder en reglerande RNA-motiv 18. En nackdel med dessa metoder är bindningen av icke-specifika RBP-anordningama eftersom kopplingen sker utanför den cellulära miljön. In vivo-metoder, i vilka proteiner är tvärbunden medan deras naturliga inställningar, kan ge en bättre bild av RNA-protein förening. Dessutom tillåter tvärbindning högre stringens under isolering och därmed högre specificitet. Paret tillvägagångssätt 17 utnyttjar transfektion av antisenssekvens till mål-RNA för att rikta en peptiddel till i närheten av RBP-anordningama. Peptid-RBP-anordningama kan sedan tvärbindas och isoleras genom kulor som är länkade till en sekvens som är komplementär till antisenssekvensen. PAIR metodik är mycket fördelaktigt på grund av sin enkla tillämpning på många celltyper utan behov av komplexa genomiska manipulationer. Det är emellertid beroende på effektiviteten av transfektion, och de fall där en låg procentandel av cellerna att acceptera antisens kommer att ha låg effektivitet. Vidare är isoleringen av RBP-peptid-antisens-sekvens som erhållits genom magnetiska streptavidinpärloma som är kopplade med biotinylerad oligonukleotid komplementär till antisense-nukleinsyran. Mångfalden av interaktioner (magnetiska pärlor, streptavidin-biotin och basparning) kan begränsa stringens och effektivitet isolering. Den snabba metoden 24 som beskrivs här är ett alternativ till dessa begränsningar i flera aspekter. Först, than integrering av MS2 loopar i den genomiska loci säkerställer att alla celler uttrycker det, vilket ökar dess avkastning. För det andra använder det hög affinitet interaktion av MS2-CP-GFP-SBP till tolv MS2 loop-sekvenser och tillåter dem att binda in vivo. För det tredje, fixeringen av interaktion RNA-proteinet möjliggör strängare tvättar och reducerar identifiering av ospecifikt bundna proteiner. Slutligen binder SBP domän streptavidinpärloma med hög affinitet och är lätt elueras med fritt biotin.
Insättning av MS2 slingan in i RNA är tillrådligt mellan ORF och 3 'UTR att minimera translation perturbation och för att säkerställa uttryck av alla slingor. Sex till 24 MS2 slingupprepningar användes tidigare för visualisering av mRNA lokalisering 38-40. Men införandet av en lång sekvens av MS2 slingor kan orsaka förändringar i behandlingen och struktur av RNA; det kan destabilisera utskrift eller ändra repertoar av RBP-anordningama bundnatill den. Enligt vår erfarenhet, 12 slingor är tillräckliga för att få en effektiv eluering av MS2-taggade RNA 20. I detta avseende kan vi konstatera att vi vanligtvis observerade ytterligare kortare transkript i våra nordliga hybridisering. Northern-analyser med olika sönder avslöjade att dessa kortare former inkluderade MS2L och en del av 3 'UTR 20, som indikerar för tidig transkriptionsterminering. Sådana fall kommer sannolikt att minska effektiviteten i isoleringen av proteiner associerade med den 3 'UTR. Därför bör antalet insatta slingor och deras placering inom RNA balanseras mellan högeffektiv rullgardins och avskrift stabilitet.
RNA har att förbli intakt under hela protokollet för att möjliggöra effektiv isolering och detektion av den maximala matris av bundna proteiner. Chansen för extern kontaminering RNas kan minskas genom att bära handskar, vilket garanterar en ren arbetsplats, förbereda lösning med RNas-fritt vatten, och arbetar koncistoch effektivt för att reducera protokolltiden. Ändå fann vi att den största bidragsgivaren till RNA nedbrytning är frisättningen av cellulära RNas till lysatet vid cellys. Det föreslogs att kryogenisk målning av jästceller med en mekanisk kvarn resulterar i förbättrad RNA rening 41. Detta kan ställas inför rätta i de fall där betydande nedbrytning observeras med detta protokoll.
En vanlig nackdel med pull-down-analyser är isoleringen av ett stort antal proteiner som binder icke-specifikt till kolonnen. Därför är användningen av en jäststam med omärkt RNA en viktig kontroll. Denna stam uttrycker MS2-CP-GFP-SBP-fusionsprotein för att ytterligare utesluta proteiner som binder till fusionsproteinet och inte mål-RNA. Vi noterar att detta inte utesluter proteiner som kan binda MS2 slingan själv, och dessa behöver ytterligare validering med proteinrullgardins analys. Figur 1B visar att vi kunde identifiera flera proteiner som binderspecifikt till PMP1 mRNA, och en del därefter validerats av en co-IP-analys 20.
Den snabba metoden är för närvarande begränsad till jästsystem, utnyttja sina väletablerade platsspecifika integrationsmetoder. Platsspecifika protokoll integrations närvarande utvecklas för gener i andra system som använder crispr-Cas-systemet 42,43. Dessa kommer att vara av stor betydelse för att utvidga utnyttjandet av snabb för att ytterligare system. En annan framtida tillämpningen av Rapid för isolering av RNA som är förknippade med en mRNA av intresse. Detta kan lätt uppnås, genom att utsätta det isolerade materialet till RNA-seq snarare än LC-MS / MS. Med tanke på de viktiga rollerna för små RNA-molekyler i regleringen mRNA-expression, kommer sannolikt att vara av stor betydelse denna ansökan. Slutligen förbättringar i masspektrometri (MS) analys och användning av kvantitativa MS-metoder såsom SILAC kommer att resultera i kvantitativt mått på mRNA-bunden proteins under olika förhållanden. Rapid kan användas med jäst odlas i medier berikade med tunga isotoper och jämfördes med celler som odlats under olika tillstånd (t ex stress) med omärkta medier 44,45. Tillämpning av snabb metod tillsammans med kvantitativ MS-analys kommer att ge exakta mått på förändringar i RBP repertoar som är förknippade med en viss mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Prof. Jeff Gerst och Boris Slobodin för deras råd att inrätta den snabba protokollet och tillhandahålla de nödvändiga plasmiderna. Vi vill också tacka Dr Avigail Atir-Lande för hennes hjälp i detta protokoll upprättas och Dr Tamar Ziv från Smoler Proteomics Center för hennes hjälp med LC-MS / MS-analys. Vi tackar Prof. TG Kinzy (Rutgers) för YEF3 antikroppen. Detta arbete stöddes av bidrag 2011013 från den binationella Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
References
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
- Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
- Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
- Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
- Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
- Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
- Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
- Loya, A., et al. The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
- Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
- Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
- Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
- Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
- Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
- Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
- Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
- Oeffinger, M. Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
- Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
- Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
- Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
- Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
- de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).
