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Medicine

Ferric Chloride-induzierte Murine Thrombosis Models

Published: September 5, 2016 doi: 10.3791/54479
Automatic Translation
1,2, 3, 4
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine of Case Western Reserve University, 3Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Summary

Wir berichten über ein raffiniertes Verfahren des Eisenchlorid (FeCl 3) induzierte Thrombose - Modelle auf carotis und A. mesenterica sowie Vene, dadurch effizient Intravitalmikroskopie unter Verwendung von Zeit zu überwachen Thrombenbildung zu okklusiv.

Introduction

Arterielle Thrombose (Blutgerinnsel) ist eine häufige Komplikation vieler systemischen mit chronischer Entzündung assoziierte Erkrankungen, einschließlich Atherosklerose, Diabetes, Fettleibigkeit, Krebs und chronische Autoimmun rheumatologischen Erkrankungen. Thromben, die in den arteriellen Kreislauf stammen aus unangemessenen Thrombozytenaktivierung, Aggregation und anschließende gerinnungsMechanismen auftreten, und sind in Herzinfarkt, Schlaganfall und Extremitätenverlust verwickelt. Die Behälterwand ist ein komplexes System , das mehrere Zelltypen einschließt und durch eine Vielzahl von äußeren Faktoren ab, einschließlich Scherspannung, zirkulierenden Blutzellen, Hormonen und Cytokinen, sowie die Expression von Antioxidationsmittel - Proteine ​​in der Gefäßwand. In vitro Experimente replizieren kann nicht beeinflusst dieser komplexen Umgebung und deshalb in - vivo - Studien an Tiermodellen sind entscheidend besseres Verständnis der Mechanismen bei thrombotischer Erkrankungen beteiligt zu ermöglichen.

Die Mäuse wurden sim gezeigt zu haben,Ilar Mechanismen für den Menschen im Hinblick auf die Thrombose, Arteriosklerose, Entzündungen und Diabetes 1,2. Weiterhin transgenen und Knockout-Mäuse können die Funktion von spezifischen Genprodukten in einer komplexen physiologischen oder pathologischen Umgebung zu testen erstellt werden. Solche Studien der menschlichen Pathologie nachahmen und bei der Charakterisierung von Arzneimittelwirkungen auf Thrombose wichtige Details bereitstellt, als auch, um Entdeckung neuer Wege und Therapien in Verbindung stehen wichtige mechanistische Informationen zur Verfügung stellen kann.

Pathologische arterielle Thromben entstehen durch Schicht Verletzung oder Dysfunktion und Exposition des Blutstroms in die subendothelialen Matrix 3,4 an Endothelzellen. Verschiedene Thrombose Modelle wurden diese Endotheleinrisses zu induzieren entwickelt, wie mechanische Verletzungen, photo Verbindung Rose Bengal-basierte oxidative Schädigung und Laser-Verletzung 5. In diesem Spektrum, Eisenchlorid (FeCl 3) -induzierten Gefäßverletzung ein weit verbreitetes Modell der Thrombose ist. Dieses Reagenz, wennaufgetragen auf die äußere Aspekt der Gefäße induziert , auf vaskulären Zellen oxidativer Schädigung 6-8, mit dem Verlust der endothelialen Zellschutz von Thrombozyten und Komponenten der Gerinnungskaskade zirkuliert. Die FeCl 3 Modell ist einfach und empfindlich auf beiden Antikoagulans und Anti-Thrombozyten Drogen, und hat auf carotis und Oberschenkelarterien, Jugularvenen und mesenterialen und cremasterica Arteriolen und Venolen bei Mäusen, Ratten, Meerschweinchen und Kaninchen 6-15 durchgeführt worden ist .

Ein messbarer Parameter in diesem Modell ist die verstrichene Zeit von der Verletzung Gefäßverschluss zu vervollständigen, gemessen als Blutfluss Aufhören mit einem Doppler - Durchflussmesser oder unter direkter Beobachtung mit Intravitalmikroskopie 6,7,9. Eine Reihe von Zeiten zwischen 5 bis 30 min wurde in verschiedenen Studien in C57Bl6 Mäusen 7-10,16, berichtet darauf hindeutet , dass FeCl 3 Konzentrationen, die Art der Anästhesie, OP - Techniken, Maus Alter, genomischen Hintergrund, Verfahren b Messunglood Fluss und andere Umgebungsvariablen haben erhebliche Auswirkungen in diesem Modell. Diese große Variabilität macht es schwierig, Studien von verschiedenen Forschungsgruppen zu vergleichen und kann Erkennung von subtilen Unterschiede erschweren.

Mit einer Vision solche Variabilitäten zu minimieren und eine gleichmäßig reproduzierbare in vivo Modellsystem etablieren, haben wir die FeCl 3 -induzierten Arteria carotis Modell verfeinert, die die Daten in hohem Maße reproduzierbar mit minimaler Variation macht 6-10,16-19. In diesem Papier beschreiben wir, und die Fähigkeiten teilen und mehrere repräsentative experimentelle Beispiele berichten, die von diesem Modell profitieren können.

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Protocol

Alle Verfahren und Manipulationen der Tiere wurden von Institutional Animal Care und Verwenden Komitees (IACUC) von der Cleveland Clinic in Übereinstimmung mit den Vereinigten Staaten Public Health Service - Politik auf der Humane Pflege und Verwendung von Tieren, und der NIH Leitfaden für die Pflege genehmigt und Verwendung von Labortieren.

1. Vorbereitungen:

  1. Fluoreszenzfarbstoff für Labeling Platelets
    1. Bereiten Rhodamin 6G-Lösung, 0,5 mg / ml, in Kochsalzlösung und sterilisiert die Lösung mit 0,22 um-Filter.
  2. FeCl 3 Lösung
    1. Machen Sie eine frische Stammlösung von 30% FeCl 3 (wasserfrei, ist gleich 1,85 M) in reinem Wasser, und Filter mit 0,45 & mgr; m - Filter. Bereiten 5 ml frisch FeCl 3 -Lösung in der gewünschten Konzentration [zB 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) und 12,5% (0,771 M)] von Verdünnen der 30% FeCl 3 -Lösung mit Wasser ina 6 cm Gewebekulturschale und halten den Deckel geschlossen.
      HINWEIS: Mit der Kulturschale erleichtert es , das Filterpapier zu holen , gesättigt mit FeCl 3 -Lösung , als es aus einem engen Behälter, wie ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu holen. FeCl3 ist extrem gefährlich und dass Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen und Laborkittel usw., Persönliche Schutzausrüstung sollte immer genommen werden.
  3. Filterpapiere
    1. Schneiden Sie das Filterpapier zu 1 mm x 2 mm Größe. Einweichen genug Stücke des geschnittenen Filterpapier in der FeCl 3 -Lösung in der gleichen Schale.
  4. Papaverinhydrochlorid Lösung
    1. Bereiten Papaverinhydrochlorid-Lösung (25 mg / ml) in Wasser und Sterilisieren der Lösung mit 0,22 um-Filter.
  5. Agarose Gel
    1. Bereiten 2% Agarosegel in PBS oder Kochsalzlösung in 6-Well-Gewebekulturplatte, ~ 1 cm Dicke und cut es zu Halbkreis mit ~ 3 cm Durchmesser.

2. FeCl 3 Induced Arteria carotis Injury Thrombosis Modell

  1. Chirurgische Verfahren zur Thrombosemodell
    1. Verwenden Sie 8 bis 12 Wochen alt C57Bl6 Mäuse (oder andere Stämme wie erforderlich). Anästhesieren Mäuse mit dem Gemisch aus Ketamin (100 mg / kg) / Xylazin (10 mg / kg) über intraperitoneale Injektion. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Zehe Kneifen.
      ANMERKUNG: Diese Menge an Ketamin / Xylazin ausreicht , um das Tier in stabiler Anästhesie zu halten und keine Schmerzen ( als Reaktion auf toe Kneifen) für mindestens 1 Std.
    2. Entfernen Sie Fell am Hals und oberen Brustbereich mit einem kleinen Tier elektrische Klipper. Enthaarungscreme ist nicht erforderlich. Tragen Sie neutral Erdöl Augensalbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
    3. Sichern Sie die Maus in Rückenlage auf dem Deckel 15 cm Gewebekulturplatte. Verwenden Sie ein langes Band (~ 10 cm) hin zu sichernd Gliedmaßen und Unterkörper und zwei Stücke von kleinen Band (2 cm x 0,5 cm) Vorderbeine zu sichern. Verwenden Sie einen 4-0 Naht um die Schneidezähne zu wickeln, kleben Sie die beiden Enden des Fadens an dem Deckel gerade Maus Hals zu halten (Abbildung 2).
    4. Legen Sie die Platte mit der Maus den Kopf in Richtung des Bedieners unter einem chirurgischen Lichtquelle.
    5. Sterilisieren Sie die Operationsstelle mit Alkohol-Pad. Verwenden Sie die Micro-Adson Pinzette die Haut zu halten und eine chirurgische Schere verwenden, um einen kleinen Schnitt machen (2 - 3 mm).
    6. Halten Sie die Haut des Einschnitts mit der Zange und chirurgische Schere Einsatz mit Backen in den Einschnitt geschlossen. Schieben Sie die Schere subkutan in Richtung des Manubrium oder Kinn, und dann die Schere öffnen Sie die Haut von der subkutanen Schicht zu befreien.
    7. Schneiden Sie die Haut mit den chirurgischen Schere einen Mittelschnitt vom manubrium auf das Niveau des Zungenbeins (3A und 3B) zu machen. Unverblümt sezieren die dünne Faszie (gestrichelte Linie, in (3B und 3C, blaue Pfeile).
      HINWEIS: Die manubrium (schwarzer Pfeil in 3C) und die Trachea (T in 3C) wird nach diesem Schritt zu sehen.
    8. Halten Sie das Weichgewebe und die Haut an der rechten Seite des Manubrium mit den Graefe Zange gesehen, legen Sie die hemostat unter der Faszie in Richtung der 2 - Uhr - Position (gelb gestrichelte Linie in 3C), öffnen Sie die Backen der hemostat die frei Halsvene aus dem umgebenden Gewebe.
    9. Schneiden Sie die Faszien, Weichgewebe und die Haut in Richtung der 2 - Uhr - Position (3C) mit den chirurgischen Schere , um die rechte Halsvene (3D, Pfeil) zu belichten.
    10. Zeichnen Sie etwa 200 bis 300 & mgr; l Rhodamin 6G-Lösung mit einer 1-ml-Spritze mit 22 G-Nadel, und dann ändernes bis zu 30 G Nadel.
      HINWEIS: Dies schützt die 30 G - Nadel vor Beschädigung seiner feinen Spitze. Direkt Zeichnen der Rhodamin 6G-Lösung mit der 30 G-Nadel wird nicht die Spitze beschädigen; jedoch berühren die Behälterwand versehentlich Schaden verursachen, die Injektion schwierig machen kann.
    11. Spülen Sie die 30 G-Nadel durch langsames Herausdrücken des Rhodamin-6G-Lösung, stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen bleiben in der Spritze oder die Nadel. Halten Sie 100 ul Rhodamin 6G Injektionslösung.
    12. Bend 2 - 3 mm Spitze der Nadel in einen 90 ° Winkel mit dem Nadelhalter, der die Nadel zu tief in die Jugularvene Einführen verhindert und macht die Injektion leichter gesteuert (Figur 3D).
    13. Injizieren Sie die Rhodamin 6G-Lösung in die rechte Halsvene zu Etikett Blutplättchen. Um die Spritze zu stabilisieren und die Nadel in Position zu halten, halten Sie die Spritze mit einer Hand und die Nadel mit den Graefe Zange mit der anderen Hand während der injection.After Injektion, klemmen die Injektionsstelle mit den Graefe Zange Blutungen zu vermeiden.
    14. Öffnen Sie die Backen der hemostat und legen Sie sie unter den Graefe Zange die Gefäßwand der Injektionsstelle zu klemmen, und dann ligieren die Injektionsstelle mit einer 6-0 Naht.
      HINWEIS: Als Alternative von Schritt 2.1.15, mit dem Finger 2 min Druck auf die Injektionsstelle der Anwendung wird die Blutung zu stoppen; jedoch hat dieses Verfahren ein Risiko besteht, dass weitere Blutungen, wenn das Gerinnsel an der Injektionsstelle wird accidently entfernt.
    15. Unverblümt sezieren das weiche Gewebe und Faszien um den linken Submaxillardrüse mit dem hemostat und Graefe Zange und ziehen Sie die Drüse in Richtung der 7 - Uhr - Position (3E) die Kopfnickermuskel (blauer Pfeil in Abbildung 3E) zu belichten.
    16. Unverblümt sezieren die Faszie (Abbildung 3E, gestrichelte Linie) zwischen dem linken Kopfnickers und der M. omohyoideus oder sternohyoid Muskel (3E, grüner Pfeil) auf der linken Seite der Luftröhre mit dem Hämostatikum entfernt.
    17. Führen Sie eine Nadel mit 6-0 Seidennaht (ca. 15 cm lang) unter der Mitte des Kopfnickers (blauer Pfeil in Abbildung 3E), legen Sie die beiden Enden des Fadens zusammen und ziehen Sie den Faden seitlich in Richtung der 10 - Uhr - Position .
      Hinweis: Dieses Verfahren sollte sorgfältig durchgeführt werden , um Verletzungen der linken Halsschlagader zu vermeiden, die außerhalb des Kopfnickers befindet.
    18. Unverblümt trennen den dünnen M. sternohyoideus und / oder M. omohyoideus der A. carotis (CA) (Abbildung 3F Pfeil) freizulegen , nachdem die Kopfnickers Wegziehen. Schneiden Sie den M. sternohyoideus und / oder M. omohyoideus wie nötig. Verwenden Sie die hemostat das weiche Gewebe von CA zu trennen, ohne die CA berühren
      HINWEIS: CA durch den Vagusnerv begleitet wird, gesehen die weiße Struktur in Abbildung 3F) ist.
    19. Verwenden Sie eine feine Spitze Pinzette die seitliche Blende um die CA zu holen, während die Vagusnerv zu vermeiden und CA. Verwenden Sie eine andere feine Spitze Pinzette ein Loch auf der Faszie zwischen dem CA zu stanzen und Vagusnerv.
    20. Führen Sie den Haken durch das Loch und sanft die CA heben, und legen Sie dann die feine Spitze Pinzette unter der CA. Bewegen Sie den Haken und Zangen in entgegengesetzte Richtungen entlang der CA adventitiellen Weichgewebe zu entfernen. Freie mindestens ~ 5 mm Länge von CA (3H, blauer Pfeil) aus dem umgebenden Gewebe.
    21. Um die Hintergrundfluoreszenz blockieren, drücken Sie die Ende eines schwarzen Kunststoff Kaffee Rührer flach, crosscut den Kaffee Rührer in einem 3 mm Stück, und dann in Längsrichtung entlang der Faltenkanten geschnitten zu bekommen zwei Stücke von "U" -Form Kunststoff (3H, grün Pfeil).
      22. (3H, grüner Pfeil) anheben. Unmittelbar 2-3 Tropfen Kochsalzlösung gelten die CA zu vermeiden Trocknen
  2. Echtzeit - Aufzeichnung Video
    1. Übertragen Sie die Maus und die Platte Deckel zusammen mit dem Mikroskoptisch und in einer geeigneten Position unter dem 10X Wasserlinse. Füllen Sie den Raum zwischen dem 10X-Objektiv und dem CA mit Kochsalzlösung.
    2. Starten Sie die digitale Videoaufzeichnung Software-Anwendung, und starten Sie eine neue Datei und benennen Sie es entsprechend. Nehmen normale Gefäßbilder und notieren Sie sich die Rahmennummer, wenn die Videoaufzeichnung gestoppt wird.
      HINWEIS: Verweisen Sie auf das Video - Recording - Software auf dem Computer für die Aufzeichnung. Wir verwenden die digitale Videoaufzeichnung Software und die folgenden Beschreibungen zu dieser Anwendung basieren.
      HINWEIS: Da mechanische traUMA das Endothel verletzen kann und zur Thrombusbildung 20 führen , ist es notwendig , zu bestätigen , dass es vor der Gefäßwand an den FeCl 3 Verletzungen keine chirurgische Verletzung ist. Es ist auch notwendig , um zu bestätigen , dass es keine verbleibenden Gewebe um die CA ist, die eine Barriere bilden kann , und die Wirkung von FeCl 3 -induzierten Verletzung dämpfen. Schreiben Sie die Rahmennummer der Datensätze nach unten wird es einfach, die Videos zu analysieren später verstrichenen Zeiten nach.
    3. Bewegen Sie die Maus mit Plattendeckel aus dem 10fach-Objektiv. Falten Sie eine Ecke von einem Papiertuch eine dünne und feine Spitze zu machen und verwenden Sie es sorgfältig die Saline auslöschen um die CA (CA vermeiden berühren) sowie in anderen Orten im Operationsfeld. Dies ist wichtig , Verdünnung der verwendeten FeCl 3 -Lösung zu vermeiden.
    4. Verwenden Sie eine feine Spitze Pinzette und ein Stück Filterpapier holen , gesättigt mit FeCl 3 -Lösung und legen Sie sie direkt auf dem CA und halten Sie es vor Ort für 1 min.
      HINWEIS: To Hilfe Visualisierung der Blutkreislauf und Ernte genaue Daten, legen Sie das Filterpapier nahe dem distalen Ende des freiliegenden CA (Abbildung 3I) und ein kurzes Segment am proximalen Seite (grüner Pfeil in Abbildung 3I) lassen für die Beobachtung der Blutfluss zu spät Phase (siehe unten).
    5. Entfernen Sie das Filterpapier (dieser Zeitpunkt wird als Beginn der "nach der Verletzung" definiert) und spülen Sie die CA mit Kochsalzlösung (mindestens 2 ml).
    6. Setzen Sie die Maus mit Platten Deckel zurück auf die 10X-Objektiv; das Schiff beobachten und aufzeichnen Videobilder zu starten. Schreiben Sie die Video-Frame-Nummer am Ende der ersten Minute der Aufnahme nach unten.
      HINWEIS: Die Thrombusbildung wird durch Akkumulation der fluoreszierenden Thrombozyten identifiziert, die in Echtzeit von Videobildern auf dem Bildschirm oder unter dem Mikroskop beobachtet wird. Nehmen Sie Videobilder direkt nach der Maus wieder unter die Lupe zu nehmen. Halten der Aufnahme zu dem Ende der ersten Minute nach dem Entfernen filter Papier. Beobachten Sie das gesamte Gefäß von dem distalen zu den proximalen Websites Informationen über die Verletzung zu erhalten, und dann konzentrieren sich auf den Bereich von Interesse (in der Regel ist das Zentrum des verletzten Bereich) für weitere Bildgebung.
    7. Record Videobilder für 10 sec pro Minute für die ersten 10 min (beispielsweise von 2.55 Uhr bis 03.05 Uhr) und dann 10 sec jede Minute bis zum Ende des Experiments. Notieren Sie sich die Rahmennummern nach unten, wenn jeder Aufnahme beendet wird.
      HINWEIS: Die Endpunkte des Modells sind: 1) wenn der Blutfluss wurde für> 30 Sekunden aufgehört; oder 2) wenn Okklusion nicht in 30 Minuten nach der Verletzung gesehen. In diesem Fall verwenden 30 min für die statistische Analyse. Stellen Sie Belichtungszeit der Videoaufzeichnung als 10 ms am Anfang, so wird es leicht sein, den Blutfluss über die Thromben zu beobachten. Wenn die Thromben groß werden und die Fluoreszenz sättigt dem Sensor der Kamera wird es schwierig, den Blutfluss über Thromben zu identifizieren. Um dieses Problem zu lösen, bewegen Sie den Imaging-center zum proximalen heil Website (Abbildung 3I, grüner Pfeil) , wo der Blutfluss noch deutlich beobachtet werden kann. Wir erhöhen auch die Expose Zeit auf 15 oder 20 ms, wenn am proximalen un-verletzten Stelle konzentriert, so kann der Blutfluss deutlicher beobachtet werden. Wenn der Blutfluss aufhört, zahlreiche größere Zellen (Leukozyten) beginnen an der Gefäßwand an dem proximalen Stelle des Thrombus zu rollen. Fluss stoppt der Regel innerhalb von 2 bis 3 Minuten nach dem Auftreten der großen Zellen. Notieren Sie sich die Expose Zeit auf dem Aufzeichnungsblatt, wenn es geändert wird. Es dauert in der Regel ca. 30 min von der Anästhesie bis zum Ende des Experiments, wenn die normale Wildtyp C57Bl6 Mäuse verwendet wurden.
      VORSICHT HINWEIS: Verwenden Sie die weiße aggregierten Blutplättchen Gerinnsel nicht als Zeichen des Blutflusses Einstellung, die keine genaue Daten geben , und es wird durch die Belichtungszeit beeinflusst. Der weiße Gerinnsel bedeckt das Gefäßlumen bedeutet nicht, den Blutfluss nicht mehr (siehe die repräsentative Video 1).

3. FeCl 3 Induced Mesenterialarterie / Vein Thrombosis Modell

  1. Anesthetize 8 bis 12 Wochen alten C57Bl6 Mäuse als 2.1.1 in Abschnitt erwähnt. Bewerben Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
  2. Injizieren Papaverine Lösung (insgesamt 0,4 mg / Maus) intraperitoneal Darmperistaltik zu hemmen.
  3. Entfernen Sie Fell am Hals und Bauch mit einem Tier elektrische Klipper. Enthaarungscreme ist nicht erforderlich.
  4. Sichern Sie die Maus in Rückenlage auf dem Deckel 15 cm Gewebekulturplatte. Verwenden Sie vier Stücke von kleinen Band (2 cm x 0,5 cm), um alle Beine zu sichern. Verwenden Sie ein 4 -0 Naht um die Schneidezähne zu wickeln, kleben Sie die beiden Enden des Fadens an dem Deckel den Hals gerade zu halten (Abbildung 2).
  5. Befolgen Sie die Anweisungen 2.1.4 -2.1.15 die Halsvene zur Injektion von Rhodamin 6G Etikett Blutplättchen zu belichten.
  6. Führen Sie einen Mittelschnitt durch die Haut von xiphoid zu Unterbauch der chirurgischen Schere (4A). Pick - up die Mitte Peritoneum (auch genannt linea alba, 4A, Pfeil) mit Graefe Zange, die klar ist und keine Blutgefäße, heben Sie etwa 2 - 3 mm hoch, bestätigen keine Darm unter der Schnittlinie, und schneiden Sie das Peritoneum geöffnet in längs~~POS=TRUNC mit den feinen Schere (4B).
  7. Wieder sichern die Mäuse nach rechts Seitenlage. Setzen Sie den Halbkreis Agarose - Gel nahe dem Bauch, und exteriorisieren sanft den Darm und breitete sie auf der Oberseite des Gels mit den Graefe Zange (4C). Verwenden Sie die zweite Zweige für die Thrombose - Experiment (4C, Pfeil).
    HINWEIS: Verwenden Sie die hemostat oder Micro-Adson Pinzette den Darm zu exteriorisieren zu helfen. Vermeiden Sie die verletzenDarm und das Gefäß.
  8. Platz 5 - 6 Tropfen Kochsalzlösung, die Feuchtigkeit des Darmes und der Behälter zu halten. Übertragen Sie die Maus mit dem Plattendeckel zusammen mit dem Mikroskoptisch und in geeignete Position unter dem 10X trockenen Linse.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein trockenes Objektiv , weil die jejunoileal Membran nicht Salzlösung aufnehmen kann. Stellen Sie sicher, Salzlösung auf den freiliegenden Gewebe fallen sie feucht zu halten.
  9. Blot, der die Salzlösung rund um die mesenterischen Arterie und Vene vor der Behandlung.
  10. Verwenden Sie eine feine Spitze Pinzette , um ein Stück Filterpapier holen , gesättigt mit 12,5% FeCl 3 -Lösung und legen Sie sie direkt auf die mesenteriale Arterie und Vene für 1 min (4D). Entfernen Sie das Filterpapier (dieser Zeitpunkt wird als Beginn der "nach der Verletzung" definiert) und spülen Sie die verletzte mesenteric Arterie und Vene mit Kochsalzlösung (mindestens 2 ml).
  11. Setzen Sie die Maus mit Plattendeckel wieder unter dem 10X trockenen Linse; Beachten Sie die Gefäße und beginnen zu record Videobilder wie in 2.2 erwähnt).
    HINWEIS: Die Endpunkte dieses Experiments sind: 1) wenn der Blutfluss wurde für> 30 Sekunden aufgehört; oder 2) wenn Okklusion nicht in 30 min nach der Verletzung gesehen, und in diesem Fall 30 min für die statistische Analyse verwendet werden.
  12. Am Ende des Experiments einschläfern die Mäuse mit Überdosis Ketamin / Xylazin (200/20 mg / kg), gefolgt von Genickbruch nach kein Atem und Herzschlag bestätigt werden.

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Representative Results

Arteria carotis Thrombosis Modell
Bei Mäusen mit C57BL6 Hintergrund empfehlen wir die Verwendung von 7,5% FeCl 3 Behälter für 1 min als Ausgangspunkt zu behandeln. Unter der Behandlung von 7,5% FeCl 3, Grenzen des verletzten Bereich und normalen Gefäßwand werden unter dem Mikroskop (siehe Online - Video - 1) leicht identifiziert, was darauf hindeutet , dass die endotheliale Schicht erheblich beschädigt wurde. Die Thromben gebildet sofort nach FeCl 3 Behandlung und sind in allen WT C57BL6 Mäusen 1 min nach der Verletzung beobachtet. Die anfänglich gebildeten Thromben sind instabil und Teile von ihnen sind in der Regel weg vom Blutstrom gewaschen, so werden die gebildeten Thromben kleiner bei 2 - 3 Minuten nach der Verletzung. Thromben ab zu vergrößern 3 - 4 Minuten nach dem Filterpapier entfernen und diese später gebildeten Thromben sind stabil und sind in der Regel nicht abgewaschen. Die durchschnittliche okklusiven Zeit beträgt 11,3 ± 3,16 min in den C57BL6-Mäusen (n = 14), wenn 7,5% FeCl 3 6,7,19 (5A und Online - Video - 1) verwendet wurden . In den früheren Studien konnten wir zeigen , dass sowohl Abnahme und Zunahme von FeCl 3 -Konzentrationen den Unterschied zwischen einem anti-thrombotischen Mausstamm und WT - Mäuse 6 verringern; Aus unserer Erfahrung Behandlung der Arteria carotis mit 7,5% FeCl 3 für 1 min ist ausreichend , um alle unsere Zwecke zu erfüllen. Zusätzlich Funktion bestimmter Gene zu testen Knockout - Mäuse mit 7,8,16,19,21, folgende sind vier repräsentative Experimente dieses Modell mit:

Intravenöser Perfusion von Gewebe-Plasminogenaktivator Mediated Thrombolyse
Tissue-type - Plasminogen - Aktivator (tPA) ist eine der FDA zugelassene Arzneimittel zur Thrombolyse Behandlung in den Vereinigten Staaten 22. Wir haben beobachtet, damit die tPA-vermittelte Thrombolyse in der Thrombosemodell A. carotis. Thrombosis warinitiiert mit 7,5% FeCl 3 und man ließ 5 min vor tPA (1 mg / kg Körpergewicht) wurde über eine Jugularvene Katheter (22GA) perfundiert zu bilden. Wie in Abbildung 2 5B und Online - Video gezeigt, vergrößert der Thrombus kontinuierlich und etwa 50% des Lumens 5 min nach der Verletzung besetzt. Die Thromben weiter zu vergrößern nach tPA Perfusion darauf hindeutet, dass tPA nicht Thrombozytenaktivierung und Aggregation nicht beeinträchtigt. Die Thrombolyse begann etwa 4 Minuten nach dem tPA-Injektion. Die gebildete Thromben wurden gefunden, um Größenänderungen wiederholt während der 30-minütigen Beobachtungsperiode und kein Gefäßverschluss in diesem Fall geschehen zu unterziehen. Diese Daten zeigten deutlich, dass tPA nicht vollständig blutplättchenvermittelte Thrombusbildung hemmen, auch wenn es zu einer Thrombolyse führt. Deshalb stellen wir uns vor, dass zukünftige Experimente , die die FeCl 3 -induzierten arterielle Thrombose - Modell verwendet , kann thrombolytische und andere Begleittherapien zu bewerten verwendet werden , die eine prominente zurück haben kannentative Wirkung auf die Thrombusbildung.

Perfusion von PAR4 Antikörper gegen Mäuse Hemmt Thrombosis
Protease-aktivierter Rezeptor 4 (PAR4) ist ein G - Protein - gekoppelten Rezeptor (GPCR) auf Plättchen , die durch proteolytische Spaltung der N-terminalen Exodomäne 23 und anschließend führt zu den Schritten in Plättchenaktivierung aktiviert wird. Das Nieman Labor hat eine Ziege polyklonalen PAR4 Antikörper (CAN12) erzeugt, die das anionische Cluster von PAR4 zielt, und verzögert PAR4 Spaltung, wodurch ein entscheidender Schritt zu beeinflussen für PAR4 vermittelte Thrombozytenaktivierung 24. Durch Perfusion von 1 mg / kg dieses Antikörpers an die C57BL6 Mäusen fanden wir , dass die Hemmung der PAR4 Spaltung signifikant verlängert mal Thrombusbildung in der 7,5% FeCl 3 induzierte Arteria carotis Thrombose - Modell (5C und Online - Video 3) zu okklusiv. Dies zeigt , dass die FeCl 3 Thrombosemodell c -induzierteneine verwendet werden, um die Wirkungen von anti-Thrombozyten-Mittel zu bewerten und potentielle therapeutische Strategien zu charakterisieren.

Nanopartikel-vermittelte Thromben spezifische Targeting
Schnelle Gerinnsel-Entfernung Blutfluss wieder herzustellen ist von entscheidender Bedeutung bei der Behandlung von vaskulären Verschlusskrankheiten, einschließlich ischämischer Schlaganfall und Myokardinfarkt. Systemische Verabreichung von Thrombolytika, wie tPA zeigte oben kann das gebildete Thromben lysieren, kann aber Thrombozytenaktivierung und Reaggregation / Okklusion nicht vollständig verhindern. Darüber hinaus kann eine systemische direkte Abgabe solcher Serin-Protease-Agenten führen zu wahllos Off-Target-Aktion, zu den wichtigsten Nebenwirkungen wie Blutungen führen. Die Sen Gupta Labor hat plättchen inspiriert Nanopartikel-basierte synthetische Lieferfahrzeuge entwickelt, die Gerinnsel-assoziierten aktivierte Blutplättchen und Proteine ​​unter hämodynamischen Scherströmung 25-27 binden kann. Wir untersuchten daher, ob diese Nanopartikelbinden an die aktive bilden Thromben in einer Arterie.

Wie in Experiment für tPA Perfusion erwähnt, wurde ein Katheter in die Jugularvene eingeführt und zur Injektion von Nanopartikel in gleichmäßigen Strömungsrate zu einer Einspritzpumpe verbunden ist. In diesem Experiment wurde kein Fluoreszenzfarbstoff in die Maus injiziert Blutplättchen zu etikettieren. Stattdessen wurden die Nanopartikel mit Rohdamine B markiert ist; daher konnten sie unter intravital Mikroskop beobachtet werden. Die Thrombose wurde für 1 min mit 7,5% FeCl 3 Behandlung eingeleitet , wie zuvor erwähnt. Da in WT-Mäusen wurde eine signifikante Menge von Thromben zu bilden 5 min nach der Verletzung gefunden, wählten wir diesem Zeitpunkt für die Injektion von Nanopartikeln zu erkennen, ob die Nanoteilchen effizient auf die aktive bilden Thromben binden. Wie in 5D und Online - Video - 4 gezeigt , nach der Injektion von fluoreszierenden Nanopartikeln, konnten wir einen bergförmigen zu identifizierenThrombus, die durch die fluoreszierenden Partikel progressiv bedeckt wurde. Diese Studien zeigen die Nützlichkeit des FeCl 3 -induzierten Thrombosemodell die Targeting - Fähigkeit (und nachfolgende therapeutische Wirksamkeit) der Gerinnsel gezielte partikulären Drug - Delivery - Systeme zu bewerten.

Die Rolle der roten Blutkörperchen andere als Thrombozyten bei der Thrombusbildung.
Jüngste Studien haben vorgeschlagen , dass rote Blutkörperchen (Erythrozyten) wichtige Rolle bei der FeCl 3 induzierte Thrombose - Modell 28 , und sie sind die erste anhaftende Blutkomponente an die geschädigte Gefäßwand 29,30 spielen. Um dieses Phänomen zu untersuchen wir gekennzeichnet RBCs mit 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanin Perchlorat (Dil, 10 uM Endkonzentration). Die Dil-markierten roten Blutkörperchen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in Kochsalzlösung mit 35% Hämatokrit suspendiert. Die Dil-markierten RBC-Suspension (100 & mgr; l pro Maus) war Injected in die thrombozytopenische Mäuse , die 19 5 Tage vor dem Experiment letal bestrahlt wurden. Diese thrombozytopenische Mäuse haben signifikante Blutplättchen verringert, was die Wahrscheinlichkeit von RBC an der Gefäßwand biding zunehmen wird, wenn sie es tun. Im Gegensatz zu den Experimenten unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Blutplättchen (Abbildung 5), wurde keine offensichtliche Anhäufung von fluoreszierenden Zellen an der Gefäßwand nach Gefäßverletzung (6A, online v ideo 5) gefunden. Jedoch, zusammen mit der Bildung des plättchenreichen Thromben RBCs begann in den Thrombus zu akkumulieren , die die Form des Gerinnsels (6A) veranschaulicht. Immunfluoreszenzfärbung der verletzten Carotis gezeigt , dass die wichtigsten an der Gefäßwand haften Zellen Plättchen (CD41 positiv, grün), während die Dil-markierten roten Blutkörperchen vor allem innerhalb der Thromben (6B & C) gefangen sind. Diese Studien zeigen, dass dieFeCl 3 -induzierten Thrombose - Modell kann gewinnen Einblick in den Mechanismus auf zellulärer und molekularer Komponenten und räumlich-zeitliche Ereignisse bei der Thrombusbildung verwendet werden.

Mesenteriale Thrombosis Modell
Für die mesenterialen Thrombose - Modell, eine hohe Konzentration von FeCl 3 (10 bis 12,5%) wird empfohlen, da die Behälter in der Regel durch Fettgewebe umgeben sind, die die FeCl 3 Diffusion in Richtung der Behälterwand verhindern kann und verhindert somit , daß Behälter von FeCl 3 -induzierten Verletzung 7. Dieses Modell eignet sich eher für venöse Thrombose-Studie. Wie in Online - Video - 6 gezeigt, wurde Thrombus um nach topischer Anwendung des Filterpapiers gesättigt mit 12,5% FeCl 3 -Lösung ~ 15 sec in der mesenterica gesehen, aber die Thrombusbildung dramatisch in der A. mesenterica verzögert. Die durchschnittliche Zeit, die Thrombusbildung zu okklusiv ist ~ 17 ± 7,2 min (n = 11) in m esenteric Vene und etwa 23 ± 9,9 min (n = 10) in der A. mesenterica bei 12,5% FeCl 3 7 verwendet wird.

Abbildung 1
Abbildung 1. Chirurgie Werkzeuge. Die minimal notwendigen Werkzeuge für die Maus Operation gezeigt. Siehe Materialliste für weitere Informationen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Maus Fixierung für Chirurgie. Sichern Sie die Maus auf die 15 cm Kulturschale Deckel für das Modell A. carotis Thrombose oder für die Injektion von Rhodamin 6G Farbstoff für die mesenterialen Thrombose - Modell.erhalten = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. A. carotis Thrombosis Modell. Die Verfahren der Halsvene zu belichten, Injektion von Rhodamin 6G Floureszierendes Farbstoff in das Blutsystem und die Exposition von links A. carotis dargestellt sind. In (A) zeigt die Linie , die den Schnitt von manubrium auf das Niveau des Zungenbeins; in (B), zeigen blaue Pfeile Submaxillardrüsen und gelb gepunkteten Linien die Faszie zwischen den Submaxillardrüsen darstellen; in (C), blaue Pfeile Submaxillardrüsen zeigen, zeigt schwarzer Pfeil manubrium und gepunktete gelbe Linie zeigt die Position zu schneiden die Halsvene zu exponieren; in (D), blauer Pfeil zeigt Halsvene; in (E) zeigt gelber Pfeil links Submaxillardrüse, blauer Pfeil indicates Kopfnickermuskel, punktiert gelbe Linie zeigt Faszien, und grüne Pfeil zeigt die M. omohyoideus oder M. sternohyoideus; in (F), zeigt blaue Pfeil A. carotis, die gelben gepunkteten Linien zeigen die dünnen M. sternohyoideus und / oder des M. omohyoideus; in (G), zeigt der blaue Pfeil A. carotis und grüne Pfeil zeigt Vagusnerv; in (H), zeigt der blaue Pfeil A. carotis und der grüne Pfeil zeigt die Plastik "U-Form" Kaffee Rührer; und in (I), der blaue Pfeil zeigt die Filterpapier befindet mit FeCl 3 -Lösung und grüne Pfeil zeigt die Arteria carotis. T zeigt Trachea. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. A. mesenterica und Venenthrombosen Modell. Die Exposition von Mesenterialgefäße sowie FeCl 3 Behandlung gezeigt. In (A) zeigt der blaue Pfeil linea alba, die weiße Fasergewebe ohne Gefäß; In (B), schneiden Sie ein Einschnitt allein wurde die linea alba gezeigt; in (C) zeigen die blauen Pfeile , um den zweiten Bogen der mesenterialen Arterien und Venen; in (D), der blaue Pfeil zeigt das Filterpapier mit FeCl 3 -Lösung entfernt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Repräsentative Experimente unter Verwendung der Arteria carotis Thrombosis Modell. (A). Die Thrombusbildung in theC57Bl / 6 - Maus behandelt mit 70,5% FeCl 3. (B). TPA thrombolytische Wirkung vermittelt. (C). Die Injektion von Antikörper Maus Thrombin - Rezeptor PAR4 Targeting auf Thrombose gezeigt wurde. (D). Thrombus-Ort-bezogene nanovehicles spezifisch an aktiv Bildung von Thromben binden , wurde gezeigt , . Inj. P zeigt die Injektion von Teilchen; und Peak-B zeigt Spitzen Banding von Partikeln auf die Thromben. Alle Bilder wurden unter gleichen Vergrößerung. Maßstabsbalken = 300 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Rolle von RBC auf Thrombusbildung. (A) thrombozytopenische Mäuse , die Perfusion von Dil-markierten RBCs empfangen wurden auf die Arterie Thrombose Modell Carotis unterworfen und Bilder nach 7,5% FeCl (B & C) Die verletzten Carotis - Arterien wurden geerntet, und Gefrierschnitte wurden hergestellt. Die Blutplättchen wurden gefärbt mit CD41 (grün) und RBCs wurden als rot (Dil) gezeigt. Die Kerne wurden mit DAPI gefärbt. Schiffe , die in (B und C) wurden aus zwei unterschiedlichen Mäusen. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Video 1
Video 1: Repräsentative Video von der Arteria carotis Thrombosemodell in Wildtyp (WT) Mäusen. (Rechtsklick zum Download bereit .) Dieses Video zeigt die repräsentative Thrombusbildung in der Arteria carotis von WT - Mäusen induziert durch topische Anwendung von Filterpapier entferntmit 7,5% FeCl 3 -Lösung. Blutplättchen wurden durch intravenöse Injektion von Rhodamin-6G markiertem und Video wurde in Monochrom-Modus gemacht. Die weiße Masse ist geronnen Blutplättchen.

Video 2
Video 2: Gewebe - Plasminogen - Aktivator (tPA) vermittelter thrombolytischer Wirkung durch die Arteria carotis Thrombosemodell nachgewiesen. (Rechtsklick zum Download bereit .) Platelet Kennzeichnung und Thrombusbildung wurden wie in Video 1 erwähnt initiiert und tPA wurde intravenös 5 min nach 7,5% injiziert FeCl 3 Verletzungen.

Video 3
Video 3: Anti - Thrombozyten - Medikament, na mely anti-Protease-aktivierten Rezeptor 4 (PAR4) Antikörper vermittelte antithrombotische Wirkung durch die Arterie Thrombose Modell Carotis nachgewiesen. (Rechtsklick zum Download bereit .) In diesem Experiment wurden Mäuse erhielten PAR4 Antikörper und Rhodamin 6G Injektion 10 Minuten vor der Thrombusbildung durch topische Auftragen Filterpapier liegt mit 7,5% FeCl 3 initiiert wurde.

Video 4
Video 4: Nanopartikel-vermittelte Thromben-spezifisches Targeting. (Rechtsklick zum Download bereit .) In diesem Experiment wurde die Thrombusbildung Arteria carotis wurde mit 7,5% FeCl 3 ohne Kennzeichnung Thrombozyten eingeleitet. Nanopartikel wurde mit Rhodamin B markiert und intravenös in die Maus 5 min nach der Verletzung injiziert.

Video 5 "src =" / files / ftp_upload / 54479 / 54479video5.jpg "/>
Video 5: Die Bindung der roten Blutkörperchen durch die Carotis - Thrombosemodell nachgewiesen. (Rechtsklick zum Download bereit .) Die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) wurden mit 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 'bezeichnet, 3'-tetramethylindocarbocyanin Perchlorat (Dil, 10 & mgr; M Endkonzentration) und 100 & mgr; l der Dil-markierten RBCs (35% Hämatokrit) in die thrombozytopenische Mäuse injiziert. Kein plättchen Markierung wurde in diesem Experiment durchgeführt. Thrombus initiiert wurde , wie oben with7.5% FeCl 3 erwähnt.

Video 6
Video 6: Repräsentative Video von der A. mesenterica und Venenthrombose - Modell auf WT - Mäusen. (Rechts-click herunterzuladen.) Blutplättchen wurden durch intravenöse Injektion von Rhodamin - 6G markiert und Thrombus wurde nach dem Auftragen ein Stück Filterpapier mit 12,5% FeCl & sub3 ; -Lösung für 1 min topisch eingeleitet. Das Gefäß wurde unter 10X trockenen Linse beobachtet.

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Discussion

Das FeCl 3 -induzierten Modell ist eines der am häufigsten verwendeten Thrombosemodelle, die nicht nur wertvolle Informationen über genetische Veränderungen auf die Thrombozytenfunktion und Thrombose 7,8,16,19,31-33 liefern kann, kann aber auch ein wertvolles Werkzeug, zur Bewertung der therapeutischen Verbindungen und Strategien zur Behandlung und Prävention von Krankheiten atherothrombotic 11,17,34-37. Hier haben wir unsere Modifikationen und Verfeinerungen dieses Modells gezeigt und zeigte zusätzliche Beweise für die Nützlichkeit dieser Technik, die empfindlich genug ist, um die Wirkungen von Antikoagulans (tPA) und Anti-Thrombozyten-Arzneimittel (PAR4 Antikörper) zu bestimmen. Neben dem mechanistische Studie der Thrombose kann das Modell auch zu studieren Nanotechnologie-basierte, Thromben zielgerichtete Arzneimittelabgabe verwendet werden. Es kann auch zur Erkennung von Gefäßwand reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) -Bildung durch Injektion von fluoreszierenden Indikator ROS 21 verwendet werden.

akribischTechniken sind notwendig, um diese Modelle durchzuführen. Der Betreiber sollte eine ausreichende chirurgische Fähigkeiten sowie ein tiefes Verständnis für Gefäß- und Blut Zellbiologie. Mehrere Eckpunkte des FeCl 3 induzierten Modell A. carotis Thrombose sind 6: (1) genug Länge von A. carotis (~ 5 mm) aussetzen Anwendung des Filterpapiers zu ermöglichen und einen Raum verlassen Blutfluss unter Intravitalmikroskopie bei Spätphase zu beobachten ; (2) Streifen deutlich die adventitiellen Weichgewebe um die Arteria carotis das Filterpapier zu ermöglichen, die Gefäßwand direkt zu kontaktieren und eine noch Verletzungen erzeugen; (3) Bestätigen keine mechanische Schädigung der Gefäßwand und keine Thrombusbildung vor der Anwendung von FeCl 3 -gesättigtes Filterpapier; (4) liegen der Arteria carotis mit einem Stück "U" schwarzem Kunststoff geformt , um die Arterie zu trennen von umgebendem Gewebe, Hintergrundfluoreszenz zu blockieren und FeCl 3 Diffusion zu verhindern. Durch diese Strategien haben wir erzeugt hochreproduzierbarer Daten mit dem Wildtyp C57BL / 6 - Mäuse, und in diesem Mausstamm 7,5% FeCl 3 induzierte Thrombose Zeit beträgt 11,3 ± 3,16 min (n = 14) 6,7,19. Die Jugularvene Injektion von Rhodamin 6G zu beschriften Zellen zirkulierende herausfordernd sein kann. Als Alternative kann eine Schwanzveneninjektion durchgeführt werden, bevor mit der Maus auf die 15-cm-Platte Deckel zu sichern. Im Vergleich zu der Arteria carotis Modell ist die mesenteriale Arterie und Vene Modell einfacher und weniger chirurgisch intensiv. Wie jedoch im Ergebnis Abschnitt, aufgrund der Berichterstattung über die Schiffe, die von Fettgewebe ist die mesenterialen Thrombose-Modell besser für Venenthrombose zu studieren, sondern erfordert eine größere Probengröße den Fehler zwischen verschiedenen Mäusen zu minimieren.

Die Begrenzung dieses Modells ist, dass der Mechanismus nicht klar, und nach wie vor umstritten. Zunächst wurde der Mechanismus dieses Modell angenommen , dass FeCl 3 erzeugten ROS induzierten Denudation von Endothelzellen zu sein, und subsequently führte zur Exposition von Blutkomponenten zur prothrombotic Subendothel, 6,11 Thrombozytenadhäsion, Aggregation und Thrombusbildung zu machen. Durch Rekonstitution von Blutplättchen vorbehandelten mit GPVI Antikörper an die thrombozytopenische Mäuse haben wir gezeigt , dass das FeCl 3 Modell auf plättchen GPVI abhängt, und Blockierungsplättchen GPVI dramatisch FeCl 3 induzierte Thrombenbildung 19 gehemmt. Dieser Befund steht im Einklang mit früheren Berichten 38 und schlägt vor , dass die FeCl 3 Modell wahrscheinlicher sein kann , die Pathophysiologie der menschlichen arteriosklerotischen Plaque - Bruch Thrombose vermittelten 6 zu imitieren. Allerdings haben einige neuere Studien neue Mechanismen , einschließlich Adhäsion der roten Blutkörperchen an der Gefäßwand sowie physikochemische Wirkung von FeCl 3 induzierte Aggregation von Plasmaproteinen und Blutzellen 29,30 vorgeschlagen. Diese neuen Erkenntnisse deuten darauf hin, die möglichen Mechanismen dieses Modells sein kann komplexer.

Durch Perfusion von Dil-markierten RBCs in die thrombozytopenische Mäuse und Induzieren dann FeCl 3 -triggered Schädigung der Arteria carotis mit 7,5% FeCl 3, haben wir festgestellt , dass die großen anhaftenden Zellen an die geschädigte Gefäßwände sind Plättchen (Abbildung 6 und Online - Video - 5 ). Wir fanden nicht offensichtlich RBCs Haftung und die Anhäufung von roten Blutkörperchen in der Thromben schien wahrscheinlich ein Ergebnis des Einfangens zu sein. Unsere Ergebnisse stimmen mit den Konzepten von primären und sekundären Hämostase 39. Die Differenz von unserer Beobachtung aus den vorherigen Berichte können von Hypoxie und hämodynamischen Veränderungen als in der Studie von Barr und Mitarbeitern 30, sein , wo die FeCl 3 verletzten Carotis - Arterien für die rasterelektronenmikroskopische Untersuchung wurden in Mäuse vorbereitet, der linke Ventrikel zuvor ausgesetzt waren , ohne Unterstützung einer mechanischen Lüftung sorgen. Blutsauerstoffkonzentration und die Hämodynamik wird dramatisch, da beide Lungen verringert werden undHerzfunktion betroffen sein werden, unmittelbar nachdem die Brust ohne mechanische Belüftung geöffnet wird. Sauerstoffmangel ist seit langem mit Auslösung der prokoagulierenden Stoffwechselweg und Thrombose 40 und auch verbessern kann RBC Adhäsion verbunden. Eine weitere aktuelle Veröffentlichung ist für 5 oder 10 min führt zu einer stationären Konzentration von FeCl 3 bei ~ 50 mM in das Lumen des verletzten Gefäß 29 mit einer sehr hohen Konzentration von FeCl 3 (20%) , dass die Behandlung der A. carotis gezeigt . Sie somit direkt infundiert 50 mM FeCl 3 in verschiedene Blutkomponenten und untersuchte die Wirkung von FeCl 3 auf die Aggregation ex vivo, das sie führten einen neuartigen vorzuschlagen, 2-Phasen - Mechanismus für die Wirkung von FeCl 3 in 29 Thrombusbildung. Obwohl recht interessant, die Ergebnisse aus dieser Studie müssen mit Vorsicht interpretiert werden , da es nicht die FeCl 3 Modell häufig verwendete darstellen wird. Im Gegensatz zu der hohen Konzentration an FeCl 3 (20%, 1 M , wie in dem Papier angedeutet) und lange Behandlungs (5 oder 10 min), unsere früheren Studien sowie Barr et al. haben gezeigt , dass 10% FeCl 3 Behandlung für 1 min genug ist innerhalb von 7 min 6,30 schnelle okklusive Thrombusbildung in der Karotisarterie zu induzieren. Außerdem in den meisten Experimenten die FeCl 3 Modell eine weitere geringe Konzentration an FeCl 3 verwendet - verwendet wird (5 7,5%).

Eine weitere Einschränkung dieses Modells ist , dass aufgrund der starken oxidativen Schädigung des Endothels sowie endotheliale Denudation post-FeCl 3 Behandlung dieses Modell kein geeignetes Werkzeug sein kann endothelialen Entzündung Thrombose zu untersuchen. Jedoch durch diese Techniken unter Verwendung der Karotisarterie in Verbindung mit Perfusion von fluoreszierend markierten Leukozyten vorzubereiten, können wir die Adhäsion und das Rollen der Leukozyten auf dem Endothel Entzündungs ​​41 testen.

in summary haben wir verfeinert und standardisiert die FeCl 3 -induzierten Gefäßverletzung Modell eine hoch reproduzierbare Verletzung an der Arteria carotis zu erzeugen und den Blutfluss Aufhören Zeit genau durch Intravitalmikroskopie zu quantifizieren. Dieses Modell ist ausreichend und sensibel die gerinnungshemmende und gerinnungshemmende Medikamente zu testen, und eignet sich auch für Studien von Thromben-bezogenen Bereich Nanomedizin. In Kombination mit Knochenmarkstransplantation, aus Blutplättchen Infusion in die thrombozytopenische Mäuse oder direkten intravaskuläre Injektion von Arzneimittelkandidaten, haben wir gezeigt , dass dies eine bequeme, einfache und empfindliche Werkzeug Thrombose in vivo zu studieren 7-10,16,19,42,43 .

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools  14502-14 cut and hold skin
Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm Fine Science Tools  11018-12 cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm Fine Science Tools  14519-14   to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm Fine Science Tools  13021-12 to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm Fine Science Tools  11050-10 to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm Fine Science Tools  11254-20  Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm Fine Science Tools  11253-10 Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter Fine Science Tools  10062-12 Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools  12061-02 Needle holders
Suture Thread 4-0 Fine Science Tools  18020-40 For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0 Fine Science Tools  18020-60 For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles Fine Science Tools  12050-03
rhodamine 6G  Sigma 83697-1G To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous) Sigma 12321 To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride Sigma P3510 To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes Medline 111625 To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm Fisher 09-720-004 For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm Fisher 09-719D To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad Fisher 06-669-62 To sterilize the surgical site
Agarose  BioExpress E-3120-500 To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope Leica Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. npi electronic GmbH http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software NorPix https://www.norpix.com/

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Medizin Ausgabe 115 Thrombosis A. carotis A. mesenterica / Vene Eisenchlorid Nanopartikel-vermittelte Arzneimittelabgabe Thrombolyse Thrombus Mechanismus intravital Mikroskop
Ferric Chloride-induzierte Murine Thrombosis Models
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Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).

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