Summary
Vi beskriver en robust generstatning strategi til genetisk manipulere smut svampen Ustilago maydis. Denne protokol forklarer, hvordan at generere deletionsmutanter at undersøge infektion fænotyper. Det kan udvides til at modificere gener i enhver ønsket måde, fx ved tilsætning af en sekvens, der koder et fluorescerende protein-tag.
Abstract
Gendeletion spiller en vigtig rolle i analysen af genfunktion. En af de mest effektive metoder til at forstyrre gener i målrettet er udskiftningen af hele genet med en selekterbar markør via homolog rekombination. Under homolog rekombination, udveksling af DNA finder sted mellem sekvenser med høj lighed. Derfor kan lineære genomiske sekvenser, der flankerer et target-gen anvendes til specifikt dirigere en selekterbar markør til den ønskede integration site. Stumpe ender af deletionskonstruktion aktivere cellens DNA reparationssystemer og dermed fremme integration af konstruktionen enten via homolog rekombination eller ved ikke-homolog-endesammenbinding. I organismer med effektiv homolog rekombination, kan hastigheden af succesfulde gendeletion nå mere end 50% at gøre denne strategi et værdifuldt gen afbrydelse system. Den smut svamp Ustilago maydis er en eukaryot model mikroorganisme viser sådan effektiv homolog recombination. Ud af de omkring 6900 gener, har mange været funktionelt karakteriseret ved hjælp af deletionsmutanter, og gentagne overtrædelser af gen udskiftning forsøg peger på væsentlige funktion af genet. Efterfølgende karakterisering af genet funktion ved tagging med fluorescerende markører eller mutationer af forudsagte domæner også afhængig DNA udveksling via homolog rekombination. Her præsenterer vi U. maydis stamme generation strategi i detaljer ved hjælp af simpleste eksempel genet deletion.
Introduction
Ustilago maydis er en fytopatogene model svamp, der er blevet omfattende undersøgt i årtier 1,2. Den findes i to morfologier, en gær-lignende, ikke-patogene fase og en filamentøs, smitsom formular 3. Universelle gennembrud opdagelser såsom homolog rekombination og DNA-reparationsmekanismer blev foretaget i gær-lignende vækst fase af denne svamp 4. Endvidere den morfologiske kontakten til de infektiøse filament og virulensfaktorer vigtige for infektion velkarakteriseret 5,6. Den stigende molekylær viden om biologi og virulens af denne smut svamp bygger på en simpel gen udskiftning strategi 7-9 understøttet af en fremragende genom annotation 10 og lethed af revers genetik hjælp, f.eks den velorganiserede plasmid samling på vores institut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standardiserede, hurtige infektion analyser i majs seedlings tillader detaljerede undersøgelser af patogenicitet faktorer 11.
Genomet i U. maydis indeholder omkring 6900 gener 10. For at undersøge deres funktion, kan de slettes enkeltvis eller i kombination på grund af en effektiv homolog rekombination system. Flankerende regioner på ca. 1 kb indeholdende perfekt homologe ender er ideelle til satserne for homolog rekombination større end 50%, men allerede 250 bp med ikke-homologe ender tillader en vis grad af korrekt integration af konstruktionen 9. I øjeblikket er fem forskellige modstandsværdier kassetter, hygR, cbxR, J.Clin.Natr, G418R, og phleoR mediere resistens mod hygromycin, carboxin, nourseothricin, G418 og phleomycin, anvendes til at selektere for transformanter 7,9. Derudover har hygromycinresistens blevet udviklet til en genanvendelig kassette (FRT-hygR), der kan fjernes ved den transiente ekspression af et heterologt FLP rekombinase 12. Dette tillader fjernelse af resistente kassette og dermed i teorien ubegrænset genetiske modifikationer. Phleomycin er mutagent 13, således at de nye kassetter, navnlig genanvendeligt hygR kassette, brug af phleoR er faldende. Quadruple mutanter kan således dannes ved hjælp af de øvrige fire kassetter, men for femdobbelt mutanter er FRT-hygR systemet anbefales 14.
Denne generelle gendeletion strategi er blevet overført til andre smut svampe såsom Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, eller U. esculenta 17 og tilbyder derfor potentialet for yderligere ansøgninger i endnu genetisk umedgørlige organismer med et effektivt homolog rekombination system. Desuden kan organismer mangler homolog rekombination modificeres for at forbedre gensplejsning som eksemplificeret ved deletion af gener involveret i ikke-homolog-end-sammenføjning i Neurospora crassa 18,19.
Her beskriver vi den offentliggjorte gendeletion strategi for U. maydis 7,9 i eksperimentel detaljer med fokus på hurtig og præcis kontrol af kandidaterne. Som et eksempel, bruger vi de svampeangreb chitinaser og skildrer generation af enkelte mutanter samt flere sletning stammer 20,21. Chitinaser er interessante eksempler, fordi de handler om kitin i stiv cellevæg. Cellevæg remodeling er påkrævet for morfologiske forandringer under celledeling, skifte til filamentøs vækst, og sporedannelse. Derfor, i deletionsmutanter kan forventes fænotyper hele livscyklussen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering af deletionskonstruktioner
- Generere et plasmid indeholdende deletion konstrukt (figur 1), der omfatter en respektiv 1 kb opstrøms flanke (UF) og nedstrøms flanke (DF) hver og den passende resistent kassette flankeret af blunt skærende restriktionssteder.
BEMÆRK: kan bruges Enhver kloning strategi (til kloning se reference 22) anbefaler vi Golden Gate kloning for sådanne plasmider 9. - Udskære deletion konstruere fra plasmidet under anvendelse af en stump cutter til at opnå 1 ug DNA af deletionen konstruere 9. Oprens deletionskonstruktion at fjerne enzym og buffer 22 fx ved anvendelse af kommercielle reagenser og følge producentens anvisninger.
BEMÆRK: Vektoren rygraden kan forblive i transformationen blanding.
2. Fremstilling af protoplaster
BEMÆRK: Hold sterile forhold i alle tider af eXperiment. Cellevæggen er en stærk beskyttende barriere, der begrænser adgangen af molekyler til plasmamembranen. For at tillade optagelse af DNA indeholdende deletion konstrukt, skal fjernes ved cellevæggen enzymer i en protoplasting reaktion cellevæggen. Kritiske trin i protoplast forberedelse er 1) osmotisk stabilisering af mediet og 2) at undgå mekaniske belastning af protoplasterne.
- Mark 2 ml rør med en rundbundet at fryse protoplasterne og køle dem ned ved -20 ° C. Start en forkultur i 3 ml YEPS-Light fra en frisk plade af stammen med den ønskede genetiske baggrund. Inkuber på et roterende hjul i 24 timer ved 28 ° C.
BEMÆRK: Stammen kan være den solopathogenic stamme SG200 10, vildtype-stammer, teststammer såsom AB33 23, eller ethvert mutant baggrund til generering af dobbelte mutanter. Sørg stammen er fri for den ønskede modstand. - Fortynd kulturen i 50 ml YEPS-lys i en forbløffet flask og inkuberes på en orbitalryster ved 28 ° C med 200 rpm.
BEMÆRK: fordobling tid er omkring 2 timer for vildtype stammer. Tillad tre gentagelser minimum. - Vokse, indtil eksponentielle fase. Sørg for, at den optiske tæthed, målt ved en bølgelængde på 600 nm (OD 600), er omkring 0,8 (0,6-1,0 er acceptabelt). En OD600 på 1,0 svarer til ca. 1 til 2 x 10 7 U. maydis celler pr ml.
- Tjek cellerne for forurening under et mikroskop. Bruge 40x forstørrelse. Pelletere cellerne i komplette 50 ml kultur i 5 minutter, 1.500 xg og kassér supernatanten. Pellet resuspenderes i 25 ml natriumcitrat, sorbitol løsning (SCS), centrifuge 5 min, 1500 XG, og kassér supernatanten.
BEMÆRK: Bakterielle forureninger kan identificeres som små og ofte bevægelige celler. Fungal forureninger kan identificeres baseret på en anden celle form eller størrelse sammenlignet med cigar formet celler af U. maydis. - Under centrifugation forberede protoplasting løsning (12,5 mg / ml Trichoderma lyserende enzymer, i SCS, forberede 3 ml per celle pellet; filter sterilisere gennem et 22 um filter, løsning skal være frisk til optimal enzymatisk aktivitet). SCS er en osmotisk stabilisator for at forhindre brud af protoplast ved fjernelse af cellevæggen.
- Pellet resuspenderes i 2 ml protoplasting opløsning. Der inkuberes i 5 til 20 minutter ved stuetemperatur og kontroller under mikroskop indtil 30 og 40% af cellerne er runde eller lignende pinheads (figur 2).
BEMÆRK: Udfør alle trin på is fra nu af og håndtere protoplaster med omhu! - Wash 3x i 10 ml kold (4 ° C) SCS, centrifugeres ved 1.000 xg i 5 min.
- Pellet resuspenderes i 10 ml kold sorbitol, TrisHCI, CaCl2 opløsning (STC), spin-ved 1000 xg i 5 min, kassere supernatanten. Pellet resuspenderes i 1 ml kold STC, gøre 100 pi prøver i de afkølede rør. Frys alikvoter ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.
3. Transformation af U. maydis
BEMÆRK: Omdannelsen af U. maydis protoplaster afhængig af polyethylenglycol (PEG) -medieret transformation metode, som er teknisk enkel og imod elektroporering eller biolistisk transformation ikke kræver specialiseret udstyr.
- Forbered udvælgelseskriterierne pladerne to-lags (2 plader pr transformation reaktion). Bundlaget indeholder antibiotikummet i en fordoblet koncentration. Pipetter 12 ml RegLight indeholdende 400 ug / ml hygromycin (eller 300 ug / ml nourseothricin eller 4 ug / ml carboxin eller 1 mg / ml G418) i en petriskål. Undgå bobler.
BEMÆRK: bundlag plader kan opbevares et par dage ved 4 ° C, men forberede det øverste lag frisk under transformation (se nedenfor). - Tø protoplaster på is (1 tube / transformation). Tilsæt 1 pi heparin (15 mg / ml). Tilsæt 1 ug DNA (lineariseret konstrukt) eller 10 pi H 2
- I løbet af denne tid, for det øvre lag spredes 12 ml flydende RegLight (kog og afkøl til 60 ° C) på bundpladen RegLight.
BEMÆRK: Dette lag indeholder ikke antibiotika. - Tilføj 500 pi STC / PEG (polyethylenglycol) til transformation rør (3. 2) og blandes omhyggeligt ved at vende røret. Inkuber 15 minutter på is.
- Fordel hver transformation reaktion på to af de to-lags RegLight plader. Spred forsigtigt og langsomt med en glaspipette. Inkubér pladerne opretstående ved 28 ° C i 5 til 7 dage, indtil transformanter vokse som kolonier. At opnå ca. 100-200 kolonier per plade.
BEMÆRK: Lavere tal kan skyldes "dårlige" protoplaster, der enten indeholder for meget cellevæg og kan derfor ikke tage op DNA eller kan ikke regenererer. Førstnævnte kan testes ved transformation med en selvreplikerende plasmid, sidstnævnte ved at teste regenerering på plader uden antibiotika. <li> Forbered YEPS-Light plader indeholdende det passende antibiotikum ved 200 ug / ml hygromycin (eller 150 ug / ml nourseothricin eller 2 ug / ml carboxin eller 500 ug / ml G418; disse koncentrationer lig halvdelen af den, der anvendes til bundplader). Re-oprense mindst 24 formodede transformantkolonier på disse plader. skal indhentes enkeltkolonier. Samtidig streak den oprindelige stamme på ikke-selektive medier.
BEMÆRK: Plader kan lagres ved 4 ° C i 1-2 uger.
4. Verifikation af Korrekte Sletning Begivenheder
BEMÆRK: Mutationerne verificeres i tretrins procedure (figur 1). Først kandidater, der indeholder vildtype kopi af genet udelukket ved PCR. For det andet er integrationen af modstanden kassetten i locus verificeret ved PCR. For det tredje er integrationen af resistent kassette kun i den ønskede locus verificeret ved Southern blot-analyse. Omhyggelig stammen verifikationen er essential, så mutant fænotyper virkelig korrelere med sletningen.
- First Diagnostisk PCR 20
- Design primere parring i genet, der skal slettes, der resulterer i et produkt af 250-600 bp (figur 1). Sådanne små produkter er nemme at opformere i en koloni-PCR, og lang nok til påvisning i standard gelelektroforese.
- For hver kandidat, og den oprindelige stamme som en positiv kontrol, opblande en lille smule (mængde af et knappenålshoved) af celle materiale af en enkelt koloni med en tandstikker i 20 pi 0,02 M NaOH. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
BEMÆRK: Brug friske kolonier. Hvis pladerne er ældre end 1 uge re-streak til opnåelse af en frisk koloni. - Brug 1 pi af cellesuspensionen til PCR straks. Kør en standard PCR-reaktion og analysere dannede fragmenter.
BEMÆRK: Disse prøver kan ikke gemmes.
BEMÆRK: Denne PCR-test for tilstedeværelse af vildtype-genet og derved muliggør hurtig kortlægning af negativ candidates hvori genet af interesse ikke er blevet udskiftet. Kloner eftergivende bånd i denne PCR-reaktion vil blive kasseret. En sådan negativ klon bør alligevel ske sammen som en yderligere negativ kontrol. Kandidater uden et PCR-produkt analyseres yderligere. For gener uden skadelige virkninger omtrent halvdelen af kandidaterne bør indeholde vildtype-genet, mens den anden halvdel ikke bør resultere i et band. Dette ville svare til en homolog rekombination på 50%.
- Anden Diagnostisk PCR
- Fremstilling af genomisk DNA.
BEMÆRK: Genomisk DNA (gDNA) kan fremstilles under anvendelse af to forskellige protokoller. Den første omfatter giftige reagenser som phenol og chloroform og dermed skal håndteres kun af erfarne forskere (beskrevet i 4.2.1.1 til 4.2.1.5), mens den anden også kan håndteres af mindre erfarne studerende (beskrevet i 4.2.1.6 til 4,2. 1.11). Begge protokoller arbejder pålideligt. Trin 4.2.1.1 er identisk for både protocoler.- Podes 5 ml YEPS-Light med hver ansøger og inkuber på et roterende hjul i 24 timer ved 28 ° C. Drop 2 pi af kulturen på en CM plade. Hold kulturen steril.
BEMÆRK: Følgende er en standard-protokol (ADVARSEL: giftige trin). - Sæt 1 scoop (~ 200 pi) af HCI-vasket glasperler til 2 ml rør. Tilsæt 2 ml af U. maydis kultur. Spin 12.000 xg i 5 min. Kassér supernatant (pellet kan fryses på dette stadium). Tilføj 500 pi phenol / chloroform-/ isoamylalkohol (25: 24: 1) til pelleten. FORSIGTIGHED! Phenol GIFTIG!
- Tilføj 500 pi Usti-lysis-buffer 1. Ryst for 6 til 10 minutter på en Vibrax på 1000 rpm. Kontrollere, cellepelleten fuldstændigt resuspenderes, men undgå udvidet omrystning for at forhindre forskydning af gDNA. Spin ved 12.000 xg i 15 min. Overfør 400 pi den vandige fase i den nye reagensglas (rør ikke interfasen).
- Tilsæt 1 ml 100% (v / v) ethanol. Vend røret 3x at blande, observere chøjt af DNA, kort tid vises. Spin ved 12.000 xg i 5 min. Fjern supernatanten og vask med 200 pi 70% EtOH. Må ikke pellet resuspenderes i denne fase.
- Fjern supernatanten helt (lad ikke pillen tørre helt). Tilføj 50 pi TE / RNase. Opløs gDNA ved omrystning ved 400 rpm ved 50 ° C i 10 minutter. Analyser 2 pi af gDNA på en 0,8% agarosegel 20.
BEMÆRK: Nedenstående trin omfatter en alternativ ikke-giftige protokol.
- Podes 5 ml YEPS-Light med hver ansøger og inkuber på et roterende hjul i 24 timer ved 28 ° C. Drop 2 pi af kulturen på en CM plade. Hold kulturen steril.
- Alternativ fremstilling af genomisk DNA
- Sæt 1 scoop (~ 200 pi) af HCI vasket glasperler til 2 ml rør. Tilsæt 2 ml af U. maydis kultur og centrifugering ved 12.000 xg i 5 min. Kassér supernatanten (pellets kan fryses på dette stadium).
- Tilføj 500 pi Usti lysepuffer 2 til pelleten. Ryst i 5 til 15 minutter på en Vibrax ved 1.000 rpm. Kontroller, at cellepelleten er fuldstændig resuspenderes.
- Inkuber rørene ved 65 ° C i 15 til 20 min. Brug hensigtsegnede inkubatorer designet til at være vært for 2 ml rør er kritisk. Derefter placere den på is i 5 min.
- Tilføj 100 pi 8 M kaliumacetat, vortex eller invertsukker 8 til 10 gange. Spin 12.000 xg i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Overfør 500 pi af supernatanten til et frisk 1,5 ml rør og tilføje 400 ul isopropanol. Vortex eller invertsukker 8 til 10 gange. Spin 12.000 xg i 15 min. Fjern supernatanten og vask med 500 pi 70% EtOH. Spin 12.000 xg i 5 min.
- Soak off supernatant helt! Til sidst tilsættes en kort centrifugering (10 sek) for at fjerne resterende væske. Lad DNA pellet tørre i 3 til 5 min. Der tilsættes 50 pi TE / RNAase og inkuberes ved 50 ° C i 10 til 15 minutter ved 400 rpm.
- PCR
- Design to primerpar med en af dem bindende uden flankerne og den tilsvarende binding i resistent kassette (UF-f, RC-R; RC-f, DF-r, figur 1) 9.
- Brug 1 pi af en 1:10 fortynding af gDNA af hver candidate som en skabelon i 2 PCR reaktioner godtgør en korrekt indføring opstrøms og nedstrøms 9.
- Brug standard PCR-reaktioner for hver kandidat og analysere resulterende fragmenter 22.
BEMÆRK: Disse PCR teste for insertion af resistent kassette i den korrekte genomiske locus. Hvis der opnås produkter for begge parter, at kandidaten er sandsynligvis en korrekt isætning. Dog bør også kandidater, hvor kun den ene side (opstrøms eller nedstrøms) kunne bekræftes gennemføres sammen til yderligere analyse i tilfælde af, at PCR reaktioner simpelthen mislykkedes for en flanke.
- Fremstilling af genomisk DNA.
- Kontrol af korrekt Genomisk Indsættelse af Southern blot analyse 22
- Fordøje 15 pi gDNA (4.2.1) af de mutante kandidater og den tilsvarende vildtype / stamstamme med et passende enzym, der skærer uden locuset / konstruere og desuden skærer enten i genet eller i resistent kassette fører til klart distinguishable mønstre (figur 1) 8.
BEMÆRK: Ingen af de forventede bånd bør være større end 10 kb, så de klart adskiller sig fra ufordøjet DNA. - Brug opstrøms og nedstrøms flanke som prober. For at mærke dem for eksempel bruge PCR DIG mærkning Kit eller en lignende standard metode. Bland de mærkede prober i en 1: 1 molekylære forhold og udføre Southern blot. Hold mindst to uafhængige korrekte transformanter.
BEMÆRK: vildtype mønster bør være klart kan spores i den oprindelige stamme og de korrekte kloner bør kun indeholde de forventede bånd. Yderligere bånd kun til stede i kandidaterne angiver andre insertioner af konstruktionen i en forkert locus. Sådanne kloner skal kasseres. Den negative kandidat identificeret i den første diagnostiske PCR skal indeholde vildtype bands og bands (uforudsigelige i størrelse) af den uberettiget integrerede sletning konstruktion.
- Fordøje 15 pi gDNA (4.2.1) af de mutante kandidater og den tilsvarende vildtype / stamstamme med et passende enzym, der skærer uden locuset / konstruere og desuden skærer enten i genet eller i resistent kassette fører til klart distinguishable mønstre (figur 1) 8.
- glycerol Aktier
BEMÆRK: glycerolstammer tjene til at bevare klonerne i årevis i strain samlinger. Mindst to uafhængige transformanter bør holdes for hver mutant. Dette tillader sammenligning af fænotyper, der bør være identiske.- Grow 5 ml kulturer af de bekræftede mutantstammer i YEPS-Lys på et roterende hjul i 24 timer ved 28 ° C Mix 500 pi af hver kultur med 500 pi NSY-glycerol-medium. Invert rør, indtil kulturen og medium er godt blandet. Glycerol i mediet forhindrer dannelsen af iskrystaller.
- Fryse ved -80 ° C. Re-streak en del af den frosne kultur at teste, om bestanden er funktionel.
5. Mikroskopiske fænotyper
- Grow 5 ml kulturer af vildtype- og mutantstammer i YEPS-Lys på et roterende hjul i 12 timer ved 28 ° C.
- Næste dag, fortyndes kulturen til en OD600 på ca. 0,1 og vokse det indtil en OD600 mellem 0,5 og 0,7. En OD600 på 1,0 CORRESPSkanningen starter til ca. 1 til 2 x 10 7 U. maydis celler pr ml.
- Undersøg cellemorfologien mikroskopisk.
BEMÆRK: Sund celler vises cigar formet (figur 4, WT). Udtalte vakuoler eller filamentdannelse indikerer, at cellerne er stressede.
BEMÆRK: Afhængigt af den forventede mutant fænotype, kan analysen tilpasses, fx hvis der anvendes reporter stammer den passende analyse kan udføres på dette stadium. Hvis der skal udføres cellemorfologi ændret statistisk analyse, fx for at bestemme den gennemsnitlige celle længden.
6. Infektion Assay
BEMÆRK: sætteplante infektion analysen er tidligere blevet visualiseret i dette tidsskrift 11. Det kan enten udføres under anvendelse af en haploid, solopathogenic stamme baggrund såsom SG200 10 eller ved blanding kompatible samvirkende partnere, der både bærer mutationen.
- Grow mindst 40 majsfrøplanter prstamme i 7 dage ved en lys cyklus på 16 timer, 200 uE, 28 ° C / 22 ° C (dag / nat). De bør være i 3-bladsstadiet og 10-15 cm høj ved dag for infektion.
- To dage før infektion, starte en forkultur af stammerne i 5 ml YEPS-Light på en roterende hjul i 24 timer ved 28 ° C. Dyrk en vigtigste kultur i 50 ml YEPS-Light op til OD600 = 1,0 (celledeling rate = 2 timer, tillade 3 divisioner minimum, kan gøres O / N).
- Spin ned cellerne i 50 ml kultur ved 1.500 xg i 5 min og kassér supernatanten. Vask 3 x med sterilt H 2 O. Resuspender cellerne i sterilt H2O til en OD 600 på 3,0. Hvis det er nødvendigt, bland de samvirkende parter.
- Injicer 250 - 500 pi cellesuspensionerne i stammen af 7 dage gamle majskimplanter bruger lille sprøjte. Brug sterilt H 2 O som kontrol. Hold inficerede planter i yderligere 7-14 dage i det samme lys og temperaturforhold. Score fænotype hver plante etccording til sunde, chlorose, anthocyanin dannelse, små tumorer, store tumorer, døde planter 10.
BEMÆRK: Scoring kan gøres så tidligt som 7 dage og gentages med 14 dage for at følge infektion med tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sletningen konstruktioner for alle fire kitinolytisk gener kodet i U. maydis genom blev genereret af Golden Gate kloning ved hjælp af hygR kassette til sletning af cts1, den J.Clin.Natr til sletning af cts2, at G418R kassette til sletning af cts3 og cbxR til sletning af cts4 20. En generel oversigt over genudskiftningen strategi er eksemplificeret ved deletion af cts3 (figur 1). Enkelt og dobbelt mutanter af cts1 med en anden kitinolytisk gen blev genereret sekventielt med de samme konstruktioner i to forskellige genetiske baggrunde til analyse af den rolle, chitinaser i virulens. To forskellige stamme baggrunde var ansat: AB33 tillader induktion af filamentøs vækst, det første skridt mod patogenicitet 23, SG200 er en solo-patogen stamme, der muliggør hurtig sygdom lave 10 cts3 -deletion konstruere i den passende stammen baggrunden, blev enkelte kolonier af den anden udvælgelse plade testet for korrekt sletning af diagnostiske PCR'er (tabel 1) og Southern blot (figur 3). Interessant, for cts3 den homolog rekombination sats var meget højere i SG200 end i AB33, men denne forskel var ikke konsekvent observeret i sletninger af de andre chitinaser.
Den stringente stamme verifikation sikrer et indre indføring af deletionskonstruktion ved den ønskede position. yderligere modifikation såsom punktmutationer, kan dog fortsat uopdagede, hvilket kunne vildlede fortolkning af fænotyper. Derfor er mindst to uafhængige transformanter fænotypebestemt.
fig ure 1. Oversigt over deletionsstrategi eksemplificeret ved cts3. Denne skematiske oversigt indbefatter sletningen konstruere med opstrømsflankens (UF), nedstrøms flanke (DF), og geneticin-resistente kassette (G418R), det genomiske locus af vildtype (WT ) og cts3 deletionsmutant og alle primere samt restriktionsstederne anvendes i stammen verifikation. De første diagnostisk PCR resulterer i et produkt, hvis vildtype-genet kopi er til stede, de to andre diagnostiske PCR'er resulterer i produkter, hvis modstanden kassetten er integreret korrekt. For Southern blot det genomiske DNA fordøjes med Pstl, proberne spænder over UF og DF (røde søjler) fører til påvisning af et 6,7 kb bånd i vildtype og to bånd på 5,6 kb og 2,0 kb i mutanten. Derudover DF proben svagt genkender et 2,6 kb produkt. Zoomklik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Mikroskopisk verifikation af protoplasting reaktion. (A) Ubehandlede vildtype celler (FB2) vises cigar formet. (B) Ved behandling med cellevæggen nedbrydende enzymer (her i 30 min), udseendet af runde kugler i den ene ende (r) og bar-klokke lignende strukturer (b) viser, at cellevæggen nedbrydningen er startet. Endelig protoplasterne er helt runde (r), hvilket skyldes manglen på cellevæggen. Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fig ure 3. Southern blot for cts3 sletning. Genomisk DNA blev fordøjet med PstI. Begge flanker blev mærket, blandet i ækvimolære forhold og anvendt som en enkelt probe. I vildtype SG200 og deletioner af chitinaser cts1 og cts2, detekteres et enkelt bånd på 6,7 kb. I cts3 deletioner (g og k), to bånd på 5,6 kb og 2,0 kb er synlige tegn på den korrekte deletion af cts3. Et yderligere bånd på 2,6 kb kan visualiseres ved massiv overeksponering. Det svarer til et fragment, der er anerkendt af et overlap på kun 100 bp af downstream flanke sonde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Nogle mutationer fører til åbenlyse vækst mangler, der kan opdages mikroskopisk. I de chitinase deletioner, havde enkelte mutanter ikke viseenhver åbenlys defekt, mens cts1 / 2 dobbelt mutanter viste en udtalt celleseparation defekt 20. Farvning af septa viste, at cytokinese blev afsluttet men cellerne forblev tilsluttet sandsynligt via residual chitin (figur 4 fra Langner et al. 2015). En lignende mikroskopisk vækst fænotype er kendt for sletning af khd4 24, et gen, der koder en RNA-bindende protein medierer post-transkriptionel RNA omsætning på gener involveret i morfologi og patogenicitet 25.
Figur 4. Mikroskopisk analyse af deletionsmutanter. Cell morfologi og septum dannelsen af chitinase deletionsstammer. Cts1 / 2 A-stammer udviser en celleseparation defekt og danner store aggregater, som ikke skyldes mangel på septum formation. Primær og sekundærsepta (se 5x forstørrelse i mellemværker) blev farvet med Calcofluor White (CW) før mikroskopi. Scale barer = 10 um. Dette tal er genoptrykt med tilladelse fra Langner et al. 2015 Eukaryot Cell 20. Klik her for at se en større version af dette tal.
For at teste bidrag chitinaser til virulens, blev kimplante infektion assays udført ved anvendelse mutanterne i SG200 stamme baggrund. Mens mutanter i khd4 blev reduceret i virulens, har deletion af de chitinaser ikke påvirke infektion af majsfrøplanter (figur 5) 20,25.
Figur 5. Infektion assay af deletionsmutanter. Sygdom bedømmelse afmajsfrøplanter 9 dage efter infektion med den respektive U. maydis stammer. (A) Makroskopiske symptomer, der anvendes til sygdom scoring. (B) To uafhængige transformanter blev testet for hver stamme (N> 100). Alle chitinase-mangel mutanter (1/2 / 3Δ: triple mutant endochitinases, 4Δ: enkelt mutant N-acetylglucosaminidase, 1/2/3 / 4Δ: firedobbelt mutant) smittet værtsplanten, der fører til tunge tumordannelse som observeret i vildtype infektioner med den solopathogenic stammen SG200. Derimod blev en stamme, som bærer en deletion af genet, der koder for RNA-bindende protein Khd4 reduceret i virulens som tidligere 24 beskrevet. Fejlsøjler indikerer standardafvigelse for tre uafhængige forsøg. Dette tal er modificeret med tilladelse fra Langner et al. 2015 Eukaryot Cell 20. Klik her for at se et stortr version af dette tal.
| genetisk baggrund | 1. Diagn. PCR (undtaget / testet) | 2. Diagn. PCR (bekræftet / testet) | Syd (bekræftet / testet) | % Rekomb. |
| AB33 | 7/22 | - | 7/15 | 32 |
| AB33 cts1 Δ | 19/24 | - | 5/5 | 21 |
| SG200 | 0/10 | 8/10 | 7/8 | 70 |
| SG200 cts1 Δ | 0/20 | 19/20 | 14/19 | 70 |
Tabel 1:. Strain verifikation for cts3 sletninger Den chitinasegenet cts3 blev slettet i fire forskellige genetiske baggrunde for at tillade undersøgelser af filamentøs vækst (AB33) og infektion (SG200) i enkelte og multiple sletninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver, hvordan at generere deletionsmutanter for reverse genetiske undersøgelser i U. maydis. Udgangspunktet er en deletion konstrukt, der indeholder flankerende sekvenser af genet af interesse, der indeholder sekvenser på ca. 1 kb opstrøms for starten og nedstrøms stop-codon samt et passende resistent kassette, som det tidligere blev optimeret 7,9 . Konstruktionerne har at være individuelt genereret for hvert gen og omhyggeligt kontrolleres for sekvensfejl før sletning genet. Punktmutationer i flankerne kan forårsage uønskede ændringer i den genomiske sekvens, især hvis flankerne nå ind i tilstødende gen eller mutationen ændrer regulatoriske elementer. Dette ville påvirke alle transformanter og kan forårsage fænotyper og bivirkninger relateret til det ønskede gen sletningen.
Når man planlægger sletningen strategi, den forventede fænotype må anses for at vælge den genetiske baggrund. I det foreliggende tilfælde blev AB33 23 og SG200 10 valgt at give mulighed for at teste fænotyper i den morfologiske kontakt og anlæg infektion. På samme måde kan mange andre udlæsninger være af interesse, er f.eks fusioner med cts1 ansat i eksport af heterologe proteiner 14,26, og en stamme baggrund med fluorescens-mærkede rrm4 tillader analyse af RNA transport på endosomer 27,28.
Under stammen verifikation, high-throughput diagnostiske PCR'er tillade en hurtig reduktion af antallet af ansøgere, der skal testes i den temmelig besværlige Southern blot. Især den første diagnostisk PCR tillader udelukkelse af ansøgere stadig indeholder vildtype kopi af genet og derved forhindrer den massive anvendelse af giftige phenol i gDNA præparater. I en standard tilfældet med et ikke-essentielt gen, kan omtrent halvdelen af kolonierne indeholder vildtype-genet. Denne præ-screening kan være af stor interesse for gener med potentielt skadelige vækst fænotyper. Hundredvis af kandidater kan hurtigt screenes.
Hvis alle kandidater indeholder vildtype kopi, genet deletion er mest sandsynligt dødbringende. Dette kan bekræftes ved at slette en kopi i en diploid stamme baggrund (f.eks D132) og analyse af adskillelse efter teliospore spiring 29. Alternativt kan en betinget deletionsstrategi anvendelse af en inducerbar promotor vælges til at følge den mutante fænotype. Også forurening hidrørende fra rå NaOH-metode til gDNA forberedelse, kan dog forstyrre PCR og føre til falske-negativer dvs kandidater viser ikke et band, og derfor holdes, selv om de indeholder genet. Dette kan udelukkes ved at teste en kontrol-gen med en sammenlignelig størrelse produkt i en uafhængig PCR-reaktion eller ved multiplex-PCR med de to genspecifikke primere og primere til en kontrol-gen, der resulterer i en større fragment.
indhold "> Hvis en mutant allerede er tilgængelig, f.eks cts1 Δ 30 eller rrm4 Δ, stamme generation af mærkede versioner kan fremskyndes ved at erstatte gendeletion resistente kassette (f.eks hygR) i genomet med en hidtil ukendt konstruktion indeholdende fx den fluorescensmærket rrm4 og en anden modstand markør (f.eks J.Clin.Natr). i dette tilfælde transformanter kan screenes ved tab af den oprindelige resistensmarkør 9. Korrekte kandidater er resistente kun mod nyt antibiotikum (nourseothricin) og har mistet deres oprindelige modstand (hygromycin ). Derudover komplementering af mutantfænotypen i trans kan udføres for at verificere funktionaliteten af mærkede konstruktioner 30,31.Den her beskrevne gendeletion og modifikation strategi giver en pålidelig og præcis værktøj i genetisk analyse af U. maydis. For flere sletninger dog, stammen gesom betales kan få tidskrævende, eftersom de ændringer, der skal udføres sekventielt. Derfor, som et supplerende redskab, sidste år er der etableret CRISPR-Cas system til U. maydis 32. Det giver mulighed for at forstyrre adskillige gener samtidigt og er en fremragende tilføjelse til den genetiske værktøjskasse U. maydis.
Sammenfattende protokollen for genmanipulation og U. maydis stammen generation beskrevet her er en robust metode, der er blevet meget udbredt i samfundet i årevis. Sammen med den omfattende samling af respektive modstand kassette moduler det giver alle mulige genteknologi i denne svamp, som omhandler forskellige spørgsmål, der spænder fra grundforskning til anvendt forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Særlig tak til Dr. Benedikt Steuten for kritisk læsning af manuskriptet. Den oprindelige arbejde på chitinaser blev udført af Dr. Thorsten Langner. Laboratoriet for VG er støttet af Cluster of Excellence i Plant Sciences (CEPLAS, DFG EXC 1028) og BioSC er laboratorium KS støttet af BioSC. KB er støttet af BioSC. De videnskabelige aktiviteter Bioeconomy Science Center (BioSC) blev støttet af Ministeriet for Innovation, Videnskab og forskning inden for rammerne af NRW Strategieprojekt BioSC (nr 313 / 323-400-00213). LF er understøttet af en ph.d.-stipendium af DFG International Research Training Group 1525 iGRADplant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto yeast extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+) Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
- Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
- Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
- Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
- Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
- Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
- Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
- Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
- Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
- Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
- van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
- Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
- Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
- Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
- Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
- Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
- Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
- Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
- Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloining: a laboratry manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
- Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
- Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
- Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
- Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
- Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
- Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
- Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).
