Descriviamo una strategia di sostituzione genica robusta per manipolare geneticamente il fungo fuliggine Ustilago maydis. Questo protocollo spiega come generare mutanti di delezione di indagare fenotipi infezione. Può essere esteso per modificare geni in qualsiasi modo desiderato, per esempio, aggiungendo una sequenza codificante un tag proteina fluorescente.
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Articolo metodologico
La manipolazione genetica del patogeno per le piante
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gene delezione gioca un ruolo importante nell'analisi della funzione del gene. Uno dei metodi più efficaci per interrompere geni in modo mirato è la sostituzione dell'intero gene con un marcatore selezionabile tramite ricombinazione omologa. Durante la ricombinazione omologa, lo scambio di DNA avviene tra sequenze con alta affinità. Pertanto, le sequenze genomiche lineari fiancheggianti un gene bersaglio possono essere utilizzati per indirizzare specificamente un marcatore selezionabile al sito di integrazione desiderato. estremità smussata della delezione costrutto attivano sistemi di riparazione del DNA della cellula e, quindi, promuovere l'integrazione del costrutto sia tramite ricombinazione omologa o non omologa-end-adesione. Negli organismi con efficiente ricombinazione omologa, il tasso di successo delezione del gene può raggiungere più del 50% rendendo questa strategia un sistema gene distruzione di valore. Il fungo fuliggine Ustilago maydis è un modello microorganismo eucariote che mostra come ricombinante omologo efficienteionico. Fuori suoi circa 6.900 geni, molti sono stati funzionalmente caratterizzati con l'aiuto di mutanti di delezione, e ripetuta di pezzi gene tentativi punti in funzione essenziale del gene. caratterizzazione successiva della funzione del gene per codifica con marcatori fluorescenti o mutazioni di domini previsti si basa anche sullo scambio di DNA mediante ricombinazione omologa. Qui, vi presentiamo il U. maydis strategia di generazione ceppo in dettaglio utilizzando l'esempio più semplice, la delezione del gene.
Introduzione
Ustilago maydis è un fungo modello di fitopatogeni che è stato ampiamente studiato per decenni 1,2. Esiste in due morfologie, una fase non patogeno di lievito-simili e una filamentosa, forma infettiva 3. Scoperte rivoluzionarie universali come i meccanismi di ricombinazione e riparazione del DNA omologhe sono state fatte in fase di crescita del lievito-simile di questo fungo 4. Inoltre, l'interruttore morfologica al filamento e di virulenza fattori infettivi importanti per l'infezione sono ben caratterizzati 5,6. La conoscenza molecolare crescente sulla biologia e la virulenza di questo fungo fuliggine si b....
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Protocollo
1. Generazione di eliminazione costrutti
- Generare un plasmide contenente la delezione costrutto (Figura 1) comprendendo una rispettiva 1 kb fianco upstream (UF) e sul fianco valle (DF) ciascuno e la cassetta di resistenza appropriata fiancheggiata da siti di restrizione taglio smussato.
NOTA: Qualsiasi strategia clonazione può essere utilizzato (per la clonazione vedi riferimento 22) si consiglia di Golden Gate clonazione per tali plasmidi 9. - Excise la cancellazione costruire dal plasmide con un taglierino smussato per ottenere 1 mg DNA della cancellazione costruire 9. Purificare la cancell....
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Risultati
I costrutti di delezione per tutti i quattro geni chitinolytic codificati nel U. maydis genoma sono stati generati dal Golden Gate clonazione utilizzando la cassetta HYGR per l'eliminazione della CTS1, il NATR per l'eliminazione della CTS2, cassetta G418R per l'eliminazione della cts3 e il cbxR per l'eliminazione di cts4 20. Una panoramica generale della strategia di sostituzione g.......
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Discussione
Questo protocollo descrive come generare mutanti di delezione per studi di genetica inversa a U. maydis. Il punto di partenza è un costrutto delezione che contiene sequenze fiancheggianti del gene di interessi contenente sequenze di circa 1 kb a monte dell'inizio e valle del codone di stop, nonché una cassetta di resistenza appropriata come è stato precedentemente ottimizzato 7,9 . I costrutti devono essere generate singolarmente per ogni gene e controllate con cura per errori di sequenza prima d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Un ringraziamento particolare al Dr. Benedikt Steuten per la lettura critica del manoscritto. L'opera originale sulle chitinasi è stato effettuato dal Dr. Thorsten Langner. Il laboratorio di VG è supportato dal Cluster di Eccellenza in Plant Sciences (CEPLAS, DFG EXC 1028) e BioSC, il laboratorio di KS è supportato da BioSC. KB è supportato da BioSC. Le attività scientifiche del bioeconomia Science Center (BioSC) sono stati sostenuti finanziariamente dal Ministero per l'Innovazione, la Scienza e la ricerca nell'ambito del NRW Strategieprojekt BioSC (n ° 313 / 323-400-00213). LF è sostenuto da una borsa di studio di dottorato del 1525 iGRADplant DFG Intern....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido aminobenzoico (acido libero) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | utilizzare in alternativa il fornitore locale |
| Bacto peptone | BD | 211677 | in alternativa utilizzare il fornitore locale |
| Bacto estratto di lievito | BD | 212750 | utilizza in alternativa il fornitore locale |
| CaCl2*2H2O | Grü ssing GmbH | 10234 | utilizzare in alternativa il fornitore locale |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. sale) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acidi | BD | 223050 | |
| Colinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Acido citrico | ChemSolute | 24.321.000 | utilizzare in alternativa il fornitore locale |
| CuSO4*5H2O Fluka | 61240 | utilizzare in alternativa il fornitore locale | |
| D(+)Saccarosio | Roth | 4621.1 | utilizza in alternativa il fornitore locale |
| DNA degr. acido libero | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grü ssing GmbH | 10288 | utilizzare in alternativa il fornitore locale |
| Geneticin (G418) sale disolfato | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzimi | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D (+) Glucosio | Caelo | 2580 | utilizzare in alternativa il fornitore locale |
| Glicerina | Fisher Chemical | G065015 | in alternativa utilizzare il fornitore locale |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Sostanza pericolosa. Si prega di controllare le istruzioni di sicurezza del produttore. |
| Eparina sale sodico | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Igromicina B-soluzione | Roth | 1287.2 | Sostanza pericolosa. |
| KCl | VWR | 26764298 | in alternativa utilizzare il fornitore locale |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | utilizzare in alternativa il fornitore locale |
| MgSO4 senza acqua | Merck | 7487-88-9 | L'assenza di acqua è fondamentale. In alternativa, utilizzare il fornitore locale |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | in alternativa utilizzare il fornitore locale |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | in alternativa utilizzare il fornitore locale |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | utilizzare in alternativa il fornitore locale |
| Na2SO4 | Grü ssing GmbH | 12174 | utilizzare in alternativa il fornitore locale |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | in alternativa utilizzare il fornitore locale |
| NaOH | ChemSolute | 13.751.000 | in alternativa utilizzare il fornitore locale |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | utilizzare in alternativa il fornitore locale |
| Acido nicotinico (acido libero) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseotricina diidrogeno solfato | Werner BioAgents | 5.001.000 | |
| Brodo nutriente | Fenolo | ||
| :Cloroformio:Alcool isoamilico (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Sostanza pericolosa. Si prega di controllare le istruzioni di sicurezza del produttore. |
| polietilenglicole (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Acetato di potassio | AppliChem | 121479 | in alternativa utilizzare il fornitore locale |
| Piridossina (monocloridrico) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavina | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | in alternativa utilizzare |
| la piccola siringa del | BD | 300300 | in alternativa utilizzare il filtro sterile del fornitore locale |
| , 22 &; m | VWR | 28145-477 | in alternativa utilizzare il fornitore locale |
| Sorbitolo Roth | 6213.1 | alternativa utilizzare il fornitore locale | |
| Tiamin-cloridrato | Serva | 36020.02 | in alternativa utilizzare il fornitore locale |
| Tri-Na-Citrato | Fisher Chemical | S332060 | in alternativa utilizzare il fornitore locale |
| Tris- (idrossimetil) aminometano | VWR | 103156X | utilizzare in alternativa il fornitore locale |
| Tris cloridrato Roth | 9090.4 | in alternativa utilizzare il fornitore locale | |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | in alternativa utilizzare il fornitore locale |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | in alternativa utilizzare il fornitore locale |
| Composizione delle soluzioni/preparazione del materiale | Composizione delle soluzioni | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in metanolo, concentrazione finale: 2 &; micro; g/ml | ||
| di piastre | 0,25 % (p/v) di casamminoacidi, 0,1 % (p/v) di estratto di lievito, 1,0 % (v/v) di soluzione vitaminica di Holliday, 6,25 % (v/v); Soluzione di sale di Holliday, 0,05 % (p/v) DNA degr. acido libero, 0,15 % (p/v) NH4NO3, 2,0 % (p/v) Bacto Agar; regolare a pH 7,0 utilizzando 5 M NaOH; dopo la sterilizzazione in autoclave aggiungere l'1 | ||
| Geneticina (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, concentrazione finale: 500 µ g/ml | ||
| di perle di vetro lavate con HCl (0,35-0,45 mm) | Coprire le perle di vetro con HCl concentrato (25 %, 7,8 M) e incubare per 60 minuti. Agitare più volte. Decantare l'HCl (conservare il liquido decantato) e lavare le perle di vetro con 3 M di HCl (conservare il liquido decantato). Lavare più volte le perle di vetro con H2O distillato fino a quando il pH non è 7 (il liquido non deve più essere giallo-verde). Aliquotare le perle di vetro ed essiccarle a 180 °C. L'HCl decantato deve essere neutralizzato prima dello smaltimento. | ||
| Stock di eparina | : 15 mg/ml | ||
| di soluzione | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1,32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) oligoelementi, 2,0 ‰ (w/v) MgSO4; filtrato sterile | ||
| Soluzione vitaminica Holliday | 0,1‰ (w/v) Tiamina, 0,05‰ (w/v) Riboflavina, 0,05‰ (w/v) Piridossina, 0,2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0,05‰ (w/v) Acido amminobenzoico, 0,2‰ (w/v) Acido nicotinico, 0,2‰ (w/v) Colinclorido, 1,0 per cento; (w/v) mio-inositolo; può essere conservato a -20 gradi C | ||
| Igromicina | Stock: 50 mg/ml in PBS, concentrazione finale: 200 µ g/ml | ||
| di Nourseotricicina | Stock: 200 mg/ml in H2O, concentrazione finale: 150 µ g/ml | ||
| NSY-glicerolo-medio | 0,8 % (p/v) Brodo nutriente, 0,1 % (p/v) Estratto di lievito, 0,5 % (p/v) Saccarosio, 80,0 % (v/v) 87% Glicerina (f.c. 69,6%) | ||
| RegLight | 1,0% (p/v) Estratto di lievito 0,4 % (p/v) Bacto Peptone, 0,4 % (p/v) Saccarosio, 18,22 % (p/v) Sorbitolo, 1,5 % (p/v) Agar | ||
| SCS, pH 5,8 | Soluzione 1: 20 mM tri-Na-citrato, 1 M Sorbitolo; colutazione 2: 20 mM Acido citrico, 1 M Sorbitolo, aggiungere la soluzione 2 nella soluzione 1 fino a raggiungere il pH 5,8; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitolo, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM CaCl2; filtro sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in tampone STC | ||
| tampone TE, pH 8 | 1,31 mM Tris-Base, 8,69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNasi | 10 &; g/ml di RNaseA in tampone TE | ||
| Oligoelementi | 0,06‰ (w/v) H3BO3, 0,14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0,4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0,4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0,04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12,5 mg/ml SCS; filtro sterile; preparare poco prima dell'uso | ||
| Tris-HCl pH 7,5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; controllare il pH ed eventualmente regolare con HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis tampone 1, pH 8 | 10 mM di Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM di NaCl, 1% (p/v) di SDS, 2% (v/v) di TritonX-100, 1 mM di EDTA. Non misurare il pH con il pHmetro. | ||
| Miscela tampone Usti-lysis 2 | Usti lysis buffer 1 con 1x TE in rapporto 1:1 | ||
| YEPS-Light medium | 1,0% (p/v) Estratto di lievito, 0,4% (p/v) Bacto Peptone, 0,4% (p/v) Saccarosio, per piastre: 1,5% (p/v) Bacto Agar |
Riferimenti
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
- Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (201....
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Ristampe e permessi
