Summary
Descriviamo una strategia di sostituzione genica robusta per manipolare geneticamente il fungo fuliggine Ustilago maydis. Questo protocollo spiega come generare mutanti di delezione di indagare fenotipi infezione. Può essere esteso per modificare geni in qualsiasi modo desiderato, per esempio, aggiungendo una sequenza codificante un tag proteina fluorescente.
Abstract
Gene delezione gioca un ruolo importante nell'analisi della funzione del gene. Uno dei metodi più efficaci per interrompere geni in modo mirato è la sostituzione dell'intero gene con un marcatore selezionabile tramite ricombinazione omologa. Durante la ricombinazione omologa, lo scambio di DNA avviene tra sequenze con alta affinità. Pertanto, le sequenze genomiche lineari fiancheggianti un gene bersaglio possono essere utilizzati per indirizzare specificamente un marcatore selezionabile al sito di integrazione desiderato. estremità smussata della delezione costrutto attivano sistemi di riparazione del DNA della cellula e, quindi, promuovere l'integrazione del costrutto sia tramite ricombinazione omologa o non omologa-end-adesione. Negli organismi con efficiente ricombinazione omologa, il tasso di successo delezione del gene può raggiungere più del 50% rendendo questa strategia un sistema gene distruzione di valore. Il fungo fuliggine Ustilago maydis è un modello microorganismo eucariote che mostra come ricombinante omologo efficienteionico. Fuori suoi circa 6.900 geni, molti sono stati funzionalmente caratterizzati con l'aiuto di mutanti di delezione, e ripetuta di pezzi gene tentativi punti in funzione essenziale del gene. caratterizzazione successiva della funzione del gene per codifica con marcatori fluorescenti o mutazioni di domini previsti si basa anche sullo scambio di DNA mediante ricombinazione omologa. Qui, vi presentiamo il U. maydis strategia di generazione ceppo in dettaglio utilizzando l'esempio più semplice, la delezione del gene.
Introduction
Ustilago maydis è un fungo modello di fitopatogeni che è stato ampiamente studiato per decenni 1,2. Esiste in due morfologie, una fase non patogeno di lievito-simili e una filamentosa, forma infettiva 3. Scoperte rivoluzionarie universali come i meccanismi di ricombinazione e riparazione del DNA omologhe sono state fatte in fase di crescita del lievito-simile di questo fungo 4. Inoltre, l'interruttore morfologica al filamento e di virulenza fattori infettivi importanti per l'infezione sono ben caratterizzati 5,6. La conoscenza molecolare crescente sulla biologia e la virulenza di questo fungo fuliggine si basa su una strategia di sostituzione genica semplice 7-9 supportato da un ottimo annotazione del genoma 10 e la facilità di genetica inversa utilizzando, ad esempio, la raccolta plasmide ben organizzata presso il nostro Istituto (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standardizzati, saggi di infezione rapidi nel mais seedlings consentono studi dettagliati di patogenicità fattori 11.
Il genoma di U. maydis contiene circa 6.900 geni 10. Per studiare la loro funzione, possono essere eliminati singolarmente o in combinazione a causa di un sistema di ricombinazione omologa efficiente. Regioni fiancheggianti di circa 1 kb contenenti estremità perfettamente omologhe sono ideali per i tassi di ricombinazione omologa superiore al 50%, ma già 250 bp con estremità non omologhe consentono un certo grado di corretta integrazione del costrutto 9. Attualmente, cinque diverse cassette di resistenza, HYGR, cbxR, NATR, G418R, e phleoR mediare resistenza contro Hygromycin, carbossina, nourseothricin, G418 e phleomycin, sono impiegati per selezionare per trasformanti 7,9. Inoltre, la resistenza igromicina è stata sviluppata in una cassetta riciclabile (FRT-HYGR) che può essere rimosso mediante l'espressione transiente di un eterologa ricombinasi FLP 12. Questo permette la rimozione della cassetta di resistenza e quindi in teoria illimitato modificazioni genetiche. Phleomycin è mutageno 13, in modo che con le nuove cassette, in particolare riciclabile cassette HYGR, l'uso di phleoR sta diminuendo. Mutanti quadruple possono così essere generati utilizzando gli altri quattro cassette, ma per mutanti quintuple, il sistema FRT-HYGR è consigliato 14.
Questa strategia generale gene delezione è stato trasferito con successo ad altri funghi Smut come Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, o U. esculenta 17 e offre quindi la possibilità di ulteriori applicazioni in organismi geneticamente ancora intrattabili con un sistema di ricombinazione omologa efficiente. Inoltre, gli organismi privi ricombinazione omologa possono essere modificati per migliorare l'ingegneria genetica come esemplificato dalla delezione di geni coinvolti nella non-omologa-itd-entrare in Neurospora crassa 18,19.
Qui si descrive la strategia di eliminazione del gene pubblicato per U. Maydis 7,9 in dettaglio sperimentale con un focus sulla verifica rapida e accurata dei candidati. A titolo di esempio, usiamo le chitinasi fungine e rappresentare la generazione dei singoli mutanti, nonché l'eliminazione più ceppi 20,21. Chitinasi sono esempi interessanti, perché agiscono sulla chitina nella parete cellulare rigida. è richiesto il rimodellamento della parete cellulare di cambiamenti morfologici durante la divisione cellulare, passare alla crescita filamentosa, e formazione di spore. Quindi, in mutanti di delezione può aspettare fenotipi in tutto il ciclo di vita.
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Protocol
1. Generazione di eliminazione costrutti
- Generare un plasmide contenente la delezione costrutto (Figura 1) comprendendo una rispettiva 1 kb fianco upstream (UF) e sul fianco valle (DF) ciascuno e la cassetta di resistenza appropriata fiancheggiata da siti di restrizione taglio smussato.
NOTA: Qualsiasi strategia clonazione può essere utilizzato (per la clonazione vedi riferimento 22) si consiglia di Golden Gate clonazione per tali plasmidi 9. - Excise la cancellazione costruire dal plasmide con un taglierino smussato per ottenere 1 mg DNA della cancellazione costruire 9. Purificare la cancellazione costrutto per eliminare enzima e buffer 22 ad esempio utilizzando reagenti commerciali e seguire le istruzioni del produttore.
NOTA: La spina dorsale vettore può rimanere nella miscela trasformazione.
2. Preparazione di protoplasti
NOTA: Mantenere condizioni di sterilità in ogni momento della postaXperiment. La parete cellulare è una forte barriera protettiva che limita l'accesso delle molecole alla membrana plasmatica. Per consentire l'assorbimento del DNA contenente la delezione costrutto, la parete cellulare deve essere rimosso dalla parete cellulare enzimi di degradazione in una reazione protoplasting. Passaggi critici in preparazione protoplasti sono 1) la stabilizzazione osmotica del mezzo e 2) evitando sollecitazioni meccaniche sui protoplasti.
- Mark 2 ml tubi con un fondo rotondo di congelare i protoplasti e raffreddare a -20 ° C. Avviare una pre-cultura in 3 ml Yeps-luce da un piatto fresco del ceppo con il background genetico desiderato. Incubare su una ruota girevole per 24 ore a 28 ° C.
NOTA: Il ceppo può essere il ceppo solopathogenic SG200 10, ceppi di tipo selvatico, ceppi tester, come AB33 23, o qualsiasi sfondo mutante per la generazione di doppi mutanti. Assicurarsi che il ceppo è privo della resistenza desiderata. - Diluire la cultura in 50 ml Yeps-luce in un flas sconcertatok ed incubare su un agitatore orbitale a 28 ° C con 200 rpm.
NOTA: Il tempo di raddoppio è di circa 2 ore per i ceppi di tipo selvatico. Lasciare almeno tre duplicazioni. - Crescere fino fase esponenziale. Assicurarsi che la densità ottica, misurata ad una lunghezza d'onda di 600 nm (OD 600), è di circa 0,8 (0,6 a 1,0 viene accettabile). Un OD 600 di 1,0 corrisponde a circa 1 a 2 x 10 7 U. Maydis cellule per ml.
- Controllare le cellule per la contaminazione al microscopio. Utilizzare 40x. Agglomerare le cellule della completa cultura 50 ml per 5 min, 1.500 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 25 ml di citrato di sodio, soluzione di sorbitolo (SCS), centrifuga 5 min, 1.500 XG, e scartare il surnatante.
NOTA: contaminazioni batteriche possono essere identificati come i piccoli e spesso in movimento le cellule. Contaminazioni fungine possono essere identificati sulla base di una diversa forma di cella o dimensioni rispetto alle cellule a forma di sigaro di U. maydis. - durante centrifugation preparare soluzione protoplasting (12,5 mg / ml Trichoderma lisi enzimi, in SCS; preparare 3 ml al pellet cellulare; filtro sterilizzare attraverso un filtro 22 micron; soluzione deve essere fresco per l'attività enzimatica ottimale). SCS è uno stabilizzatore osmotico per impedire la rottura di protoplasti dopo la rimozione della parete cellulare.
- Risospendere il pellet in 2 ml protoplasting soluzione. Incubare per 5 a 20 min a RT e controllare al microscopio fino 30 al 40% delle cellule sono tonda o simili pinheads (Figura 2).
NOTA: eseguire tutti i passi sul ghiaccio da ora in poi e gestire protoplasti con cura! - Lavare 3x 10 ml freddo (4 ° C) SCS, centrifugare a 1000 xg per 5 min.
- Risospendere il pellet in 10 ml di sorbitolo freddo, soluzione TrisHCl, CaCl 2 (STC), far girare a 1000 xg per 5 minuti, scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 1 ml freddo STC, fare aliquote di 100 microlitri nei tubi raffreddati. Congelare le aliquote a -80 ° C fino all'utilizzo.
3. Trasformazione di U. maydis
NOTA: La trasformazione di U. Maydis protoplasti basa sul polietilene glicole (PEG) metodo di trasformazione mediata, che è tecnicamente semplice e contrasto elettroporazione o trasformazione biolistic non richiede attrezzature specializzate.
- Preparare i piatti di selezione a due strati (2 piastre per reazione di trasformazione). Lo strato inferiore contiene l'antibiotico in concentrazione raddoppiata. Pipettare 12 ml di RegLight contenenti 400 ug / ml igromicina (o 300 ug / ml nourseothricin o 4 mg / ml carbossina o 1 mg / ml G418) in una piastra di Petri. Evitare le bolle.
NOTA: piatti di strato inferiore può essere memorizzato un paio di giorni a 4 ° C, ma preparare lo strato superiore di fresco durante la trasformazione (vedi sotto). - protoplasti Scongelare su ghiaccio (1 tubo / trasformazione). Aggiungere 1 ml di eparina (15 mg / ml). Aggiungere 1 mg DNA (costrutto linearizzato) o 10 ml H 2
- Durante questo tempo, per lo strato superiore si sviluppa 12 ml liquefatti RegLight (ebollizione e raffreddare a 60 ° C) sulla piastra inferiore RegLight.
NOTA: Questo strato non contiene antibiotici. - Aggiungere 500 microlitri STC / PEG (polietilenglicole) al tubo di trasformazione (3. 2) e miscelare accuratamente per inversione. Incubare 15 min in ghiaccio.
- Distribuire ciascuna reazione di trasformazione su due delle piastre RegLight due strati. Stendere con attenzione e lentamente con una pipetta di vetro. Incubare le piastre in posizione verticale a 28 ° C per 5 a 7 giorni fino a quando trasformanti crescere come colonie. Ottenere circa 100-200 colonie per piastra.
NOTA: I numeri più bassi potrebbero essere causati da protoplasti "cattivi" che o contengono parete cellulare troppo e quindi non può prendere DNA o non può rigenerare. I primi possono essere testati da trasformazione con un plasmide autoreplicante, quest'ultimo testando la rigenerazione su piastre senza antibiotici. <li> Preparare piastre Yeps-Light contenenti l'antibiotico appropriato a 200 ug / igromicina ml (o 150 mg / ml nourseothricin o 2 mg / carbossina ml o 500 mg / ml G418; queste concentrazioni uguali mezzo di quello utilizzato per piastre inferiori). Re-purificare almeno 24 colonie trasformanti putativi su queste tavole. colonie singole devono essere ottenuti. Allo stesso tempo consecutive il ceppo originale su supporti non selettivo.
NOTA: Le piastre possono essere conservati a 4 ° C per 1-2 settimane.
4. Verifica di una corretta eliminazione Eventi
NOTA: Le mutazioni sono verificati in un procedimento in tre fasi (Figura 1). Innanzitutto, i candidati che contengono la copia di tipo selvatico del gene sono esclusi mediante PCR. In secondo luogo, l'integrazione della cassetta di resistenza nel locus è verificata mediante PCR. In terzo luogo, l'integrazione della cassetta di resistenza unica nel locus desiderato viene verificata mediante analisi Southern blot. Un'attenta verifica ceppo è essential, in modo che fenotipi mutanti correlano veramente con l'eliminazione.
- Prima di diagnostica PCR 20
- Disegno primers accoppiamento nel gene da cancellare quel risultato in un prodotto di 250-600 bp (Figura 1). Tali prodotti di piccole dimensioni sono facili per amplificare in una colonia PCR, e abbastanza a lungo per il rilevamento in elettroforesi su gel standard.
- Per ciascun candidato e il ceppo originale come controllo positivo, risospendere un po '(quantità di uno spillo) di materiale cellulare di una singola colonia con uno stuzzicadenti in 20 microlitri 0,02 M NaOH. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
NOTA: Utilizzare le colonie freschi. Se le piastre sono più vecchi di 1 settimana ri-striscia per ottenere una colonia fresca. - Usare 1 ml di sospensione cellulare per la PCR immediatamente. Eseguire una reazione PCR standard e analizzare frammenti risultanti.
NOTA: Questi campioni non possono essere memorizzati.
NOTA: i test Questo PCR per la presenza del gene di tipo selvatico e in tal modo consente una rapida identificazione di cand negativoidates in cui il gene di interesse non è stato sostituito. I cloni che producono bande in questa reazione di PCR verranno scartati. Un tale clone negativo dovrebbe comunque essere trasportato lungo come controllo negativo aggiuntivo. I candidati senza un prodotto di PCR devono essere analizzati ulteriormente. Per geni senza effetti negativi circa la metà dei candidati deve contenere il gene di tipo selvatico, mentre l'altra metà non dovrebbe tradursi in una band. Ciò corrisponde ad un tasso di ricombinazione omologa del 50%.
- Secondo diagnostico PCR
- Preparazione di DNA genomico.
NOTA: DNA genomico (gDNA) può essere preparato usando due diversi protocolli. Il primo riguarda i reagenti tossici come il fenolo e cloroformio e, di conseguenza, deve essere maneggiato solo da ricercatori esperti (descritti in 4.2.1.1 a 4.2.1.5), mentre il secondo può anche essere gestita da studenti meno esperti (descritti in 4.2.1.6 a 4,2. 1.11). Entrambi i protocolli funzionano in modo affidabile. Passo 4.2.1.1 è identico per entrambi ProtoCols.- Seminare 5 ml Yeps-Light con ciascun candidato e incubare su una ruota girevole per 24 ore a 28 ° C. Goccia 2 ml di coltura su una piastra CM. Mantenere la cultura sterile.
NOTA: In seguito è un protocollo standard (ATTENZIONE: gradini tossiche). - Mettere 1 misurino (~ 200 ml) di perle di vetro HCl-lavati a 2 ml tubi. Aggiungere 2 ml di U. cultura maydis. Spin 12.000 xg per 5 min. Gettare il surnatante (pellet può essere congelato in questa fase). Aggiungere 500 microlitri fenolo / cloroformio / Isoamylalcohol (25: 24: 1) al pellet. ATTENZIONE! Il fenolo è TOSSICO!
- Aggiungere 500 microlitri Usti-lisi-buffer 1. Agitare per 6 a 10 minuti su un Vibrax a 1.000 giri al minuto. Verificare che il pellet è completamente risospeso, ma evitare estesa agitazione per impedire taglio del gDNA. Spin a 12.000 xg per 15 min. Trasferire 400 ml di fase acquosa nel nuovo tubo di reazione (non toccare il interfase).
- Aggiungere 1 ml di 100% (v / v) etanolo. Invertire i 3x tubo di mescolare, osservare la cforte di DNA che appare a breve. Spin a 12.000 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e lavare con 200 ml 70% EtOH. Non risospendere il pellet in questa fase.
- Rimuovere il surnatante completamente (non lasciare che il pellet asciugare completamente). Aggiungere 50 microlitri TE / RNase. Sciogliere gDNA agitando a 400 rpm a 50 ° C per 10 min. Analizzare 2 ml di gDNA su un gel di agarosio 0,8% 20.
NOTA: I passaggi riportati di seguito comprendono un protocollo non tossico alternativa.
- Seminare 5 ml Yeps-Light con ciascun candidato e incubare su una ruota girevole per 24 ore a 28 ° C. Goccia 2 ml di coltura su una piastra CM. Mantenere la cultura sterile.
- preparazione alternativa di DNA genomico
- Mettere 1 misurino (~ 200 ml) di HCl lavato perle di vetro a 2 ml tubi. Aggiungere 2 ml di U. cultura maydis e far girare a 12.000 xg per 5 min. Gettare il surnatante (pellet possono essere congelati in questa fase).
- Aggiungere 500 microlitri Usti Lysis buffer di 2 al pellet. Agitare per 5 a 15 minuti su un Vibrax a 1.000 rpm. Verificare che il pellet è completamente risospeso.
- Incubare le provette a 65 ° C per 15 a 20 min. utilizzando approincubatori appropriate progettati per ospitare da 2 ml tubi è fondamentale. Poi, metterlo in ghiaccio per 5 min.
- Aggiungere 100 ml 8 M acetato di potassio, vortice o invertire 8 a 10 volte. Spin 12.000 xg per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Trasferimento 500 ml di surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml e aggiungere 400 ml di isopropanolo. Vortex o invertito da 8 a 10 volte. Spin 12.000 xg per 15 min. Rimuovere il surnatante e lavare con 500 microlitri 70% EtOH. Spin 12.000 xg per 5 min.
- Impregna fuori dal surnatante completamente! Alla fine, aggiungere una breve rotazione (10 sec) per rimuovere il liquido residuo. Lasciate asciugare pellet di DNA per 3-5 min. Aggiungere 50 microlitri TE / RNAase e incubare a 50 ° C per 10 a 15 min a 400 rpm.
- PCR
- Disegno due coppie di primer con uno di essi vincolante al di fuori i fianchi e la corrispondente vincolante ai cassetta di resistenza (UF-f, RC-r; RC-f, DF-r, Figura 1) 9.
- Usare 1 ml di una diluizione 1:10 del gDNA di ogni candidate come modello in 2 reazioni PCR verifica del corretto inserimento monte ea valle 9.
- Utilizzare le reazioni standard di PCR per ciascun candidato e analizzare conseguente frammenti 22.
NOTA: Queste PCR test per l'inserimento della cassetta di resistenza nella corretta locus genomico. Se i prodotti sono ottenuti per entrambe le parti, il candidato è probabile un corretto inserimento. Tuttavia, anche i candidati in cui potrebbe essere confermata solo da un lato (a monte oa valle) dovrebbero essere effettuati insieme per ulteriori analisi nel caso che le reazioni PCR semplicemente non riuscita per un fianco.
- Preparazione di DNA genomico.
- Verifica del corretto inserimento Genomic da Southern Blot analisi 22
- Digest 15 ml di gDNA (4.2.1) dei candidati mutanti e la corrispondente ceppo di tipo selvatico / progenitore con un enzima appropriato che taglia fuori del locus / costruire e in aggiunta, tagli o nel gene o nella cassetta resistenza che porta a chiaramente distmodelli inguishable (Figura 1) 8.
NOTA: Nessuna delle bande attese dovrebbe essere più grande di 10 kb, in modo che siano chiaramente distinguibili dal DNA non digerito. - Utilizzare il monte ed il fianco valle come sonde. Per etichettarli per esempio utilizzare il kit di etichettatura PCR DIG o qualsiasi metodo standard simile. Mescolare le sonde marcate in un rapporto 1: 1 molecolare ed eseguire la Southern blot. Mantenere almeno due trasformanti corretti indipendenti.
NOTA: Il modello di tipo selvatico deve essere chiaramente rilevabile nel ceppo originale e cloni corretto dovrebbe contenere soltanto le bande attese. bande aggiuntive presenti solo nei candidati indicano altre inserzioni del costrutto in un luogo sbagliato. Tali cloni devono essere eliminate. Il candidato negativo identificato nel primo diagnostico PCR dovrebbe contenere le bande di tipo selvatico e le bande (imprevedibili in termini di dimensioni) della eliminazione costrutto torto integrato.
- Digest 15 ml di gDNA (4.2.1) dei candidati mutanti e la corrispondente ceppo di tipo selvatico / progenitore con un enzima appropriato che taglia fuori del locus / costruire e in aggiunta, tagli o nel gene o nella cassetta resistenza che porta a chiaramente distmodelli inguishable (Figura 1) 8.
- Azioni glicerolo
NOTA: le scorte Glicerolo servono a mantenere i cloni per anni in collezioni di deformazione. Almeno due trasformanti indipendenti dovrebbero essere conservati per ogni mutante. Questo permette fenotipi confrontando che dovrebbero essere identiche.- Grow 5 ml culture dei ceppi mutanti confermati in Yeps-Light su una ruota girevole per 24 ore a 28 ° C Mescolare 500 ml di ogni cultura con 500 microlitri NSY-glicerolo-media. Capovolgere il tubo fino a quando la cultura e medie sono ben miscelati. Glicerolo nel mezzo previene la formazione di cristalli di ghiaccio.
- Congelare a -80 ° C. Re-depositano su una parte della cultura congelata per verificare se lo stock è funzionale.
5. microscopici Fenotipi
- Grow 5 ml culture di tipo selvatico e mutanti in Yeps-Light su una ruota girevole per 12 ore a 28 ° C.
- Il giorno seguente, diluire la coltura ad una OD 600 di circa 0,1 e crescere finché un OD 600 tra 0,5 e 0,7. Un OD 600 di 1,0 correspcondi per circa 1 a 2 x 10 7 U. Maydis cellule per ml.
- Ispezionare la morfologia delle cellule al microscopio.
NOTA: Healthy cellule sembrano forma di sigaro (figura 4, WT). vacuoli pronunciati o formazione filamento indicano che le cellule sono stressati.
NOTA: A seconda del fenotipo mutante previsto, l'analisi può essere adattato, per esempio, se vengono utilizzati ceppi reporter di dosaggio appropriato può essere effettuato in questa fase. Se viene analisi statistica modificata dovrebbe essere condotta morfologia cellulare, ad esempio, per determinare la lunghezza media delle cellule.
6. Infezione Assay
NOTA: Il saggio infezione piantina è stata visualizzata in precedenza in questa rivista 11. Esso può essere effettuata utilizzando un aploidi, solopathogenic sfondo ceppo come SG200 10 o mescolando i partner di accoppiamento compatibili che sia portare la mutazione.
- Crescere almeno 40 piantine di mais perceppo per 7 giorni alla luce del ciclo di 16 ore, 200 μE, 28 ° C / 22 ° C (giorno / notte). Essi dovrebbero essere nella fase 3-foglie e 10-15 cm di altezza al giorno di infezione.
- Due giorni prima dell'infezione, iniziare una pre-coltura dei ceppi in 5 ml Yeps-Light su una ruota girevole per 24 ore a 28 ° C. Crescere una cultura principale in 50 ml Yeps-Light fino a OD 600 = 1,0 (divisione cellulare rate = 2 ore, consentono almeno 3 divisioni, si può fare O / N).
- Spin giù le cellule della cultura 50 ml a 1.500 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. Lavare 3x con H 2 O. sterili Risospendere le cellule in H 2 O sterile ad una OD 600 di 3,0. Se necessario, mescolare i partner di accoppiamento.
- Iniettare 250 - 500 ml di sospensioni di cellule staminali nel giorno del 7 vecchie piante di mais con una piccola siringa. Utilizzare H 2 O sterile come controllo. Mantenere piantine infette per altri 7-14 giorni nelle stesse condizioni di luce e temperatura. Punteggio il fenotipo di ogni pianta unecondo sano, clorosi, la formazione di antociani, piccoli tumori, tumori di grandi dimensioni, piante morte 10.
NOTA: Scoring può essere fatto fin da 7 giorni e ripetuto a 14 giorni per seguire l'infezione nel corso del tempo.
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Representative Results
I costrutti di delezione per tutti i quattro geni chitinolytic codificati nel U. maydis genoma sono stati generati dal Golden Gate clonazione utilizzando la cassetta HYGR per l'eliminazione della CTS1, il NATR per l'eliminazione della CTS2, cassetta G418R per l'eliminazione della cts3 e il cbxR per l'eliminazione di cts4 20. Una panoramica generale della strategia di sostituzione genica è esemplificata dalla delezione di cts3 (Figura 1). Mutanti singoli e doppi di CTS1 con un secondo gene chitinolytic sono stati generati in sequenza con gli stessi costrutti in due differenti background genetico per l'analisi del ruolo della chitinasi nella virulenza. Due diversi ambiti di deformazione sono stati impiegati: AB33 consente l'induzione di crescita filamentosa, il primo passo verso la patogenicità 23, SG200 è un ceppo solo-patogeno che consente una rapida malattia segnando 10 cts3 -deletion costrutto nello sfondo ceppo appropriata, singole colonie della seconda piastra di selezione sono stati testati per la corretta eliminazione dalla PCR diagnostici (Tabella 1) e Southern blot (Figura 3). È interessante notare che, per cts3 il tasso di ricombinazione omologa era molto più alto in SG200 che in AB33, ma questa differenza non è stata costantemente osservata in eliminazioni degli altri chitinasi.
Il rigoroso controllo ceppo assicura un singolo inserimento della delezione costrutto nella posizione desiderata. Tuttavia, ulteriori modifiche come ad esempio mutazioni puntiformi può rimanere inosservato, che potrebbe indurre in errore l'interpretazione dei fenotipi. Pertanto, almeno due trasformanti indipendenti phenotyped.
Figura ure 1. Panoramica della strategia di eliminazione esemplificato da cts3. Questa panoramica schematica include la cancellazione costrutto con il fianco a monte (UF), fianco a valle (DF), e la resistenza geneticina cassetta (G418R), il locus genomico di tipo selvatico (WT ) e cts3 mutante di delezione e tutti i primer nonché i siti di restrizione usati nella verifica ceppo. I primi risultati PCR diagnostici in un prodotto solo se la copia del gene di tipo selvatico è presente, le due seconde PCR diagnostici producono prodotti se la cassetta di resistenza è stato correttamente integrato. Per il Southern blot del DNA genomico è digerito con PstI, le sonde coprono l'UF e DF (barre rosse) che conduce al rilevamento di una banda 6,7 kb nel tipo selvatico e due bande di 5,6 kb e 2,0 kb nel mutante. Inoltre, la sonda DF riconosce debolmente un prodotto 2,6 kb. Favoreclicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. la verifica al microscopio di protoplasting reazione. (A) di tipo selvatico cellule non trattate (FB2) appaiono a forma di sigaro. (B) dopo il trattamento con parete cellulare enzimi di degradazione (qui per 30 min), la comparsa di sfere rotonde ad una estremità (s) e bar-campana come le strutture (b) indica che la degradazione parete cellulare è iniziata. Infine i protoplasti sono completamente rotonda (r), che è dovuto alla mancanza di parete cellulare. Barra di scala = 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Fig ure 3. Southern blot per cts3 eliminazione. Il DNA genomico è stato digerito con PstI. Entrambi i fianchi sono stati etichettati, miscelati in rapporti equimolecolari e utilizzato come una singola sonda. Nel SG200 di tipo selvatico e delezioni della chitinasi CTS1 e CTS2, viene rilevata una singola banda di 6,7 kb. In delezioni cts3 (G e K), due bande di 5.6 kb e 2,0 kb sono visibili indicative della corretta eliminazione di cts3. Un ulteriore banda di 2,6 kb può essere visualizzata da una massiccia sovraesposizione. Ciò corrisponde a un frammento che viene riconosciuto da una sovrapposizione di soli 100 bp della sonda fianco a valle. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Alcune mutazioni portano a difetti di crescita evidenti rilevabili microscopicamente. Nelle eliminazioni chitinasi, singoli mutanti non mostravanoun difetto evidente, mentre CTS1 / 2 mutanti doppi mostrato una separazione delle cellule pronunciato difetto 20. La colorazione dei setti ha mostrato che cytokinesis è stata completata ma le cellule rimasto connesso probabile via chitina residuo (figura 4 da Langner et al. 2015). Una simile fenotipo crescita microscopica è noto per la cancellazione di khd4 24, un gene che codifica una proteina RNA-binding mediare fatturato RNA post-trascrizionale di geni coinvolti nella morfologia e patogenicità 25.
Figura 4. Analisi microscopica dei mutanti di delezione. Morfologia cellulare e setto formazione dei ceppi chitinasi cancellazione. CTS1 / 2 Δ ceppi presentano un difetto di separazione delle cellule e formare grandi aggregati, che non è a causa della mancanza di formazione del setto. Primario e secondariosetti (vedi ingrandimento 5x in inserti) sono state colorate con calcofluor White (CW) prima di microscopia. Barre di scala = 10 micron. Questa cifra è ristampato con il permesso di Langner et al. 2015 Cellula eucariotica 20. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Per verificare il contributo di chitinasi alla virulenza, saggi di infezione piantina sono state effettuate utilizzando i mutanti nei precedenti ceppo SG200. Mentre mutanti in khd4 sono state ridotte nella virulenza, la cancellazione delle chitinasi non ha influenzato l'infezione di piantine di mais (Figura 5) 20,25.
Figura saggio 5. L'infezione di mutanti di delezione. Valutazione Malattiapiantine di mais 9 giorni dopo l'infezione con il rispettivo U. Maydis ceppi. (A) sintomi macroscopici che vengono utilizzati per la malattia di punteggio. (B) due trasformanti indipendenti sono stati testati per ogni ceppo (N> 100). Tutti i mutanti chitinasi-deficienti (1/2 / 3Δ: endochitinases mutanti triple, 4Δ: singolo mutante N-acetilglucosaminidasi, 1/2/3 / 4Δ: mutanti quadrupla) infetti la pianta ospite che porta alla formazione del tumore pesante come osservato nelle infezioni di tipo selvatico con il SG200 ceppo solopathogenic. Per contro, un ceppo che trasportano una delezione del gene che codifica la proteina legante l'RNA Khd4 stata ridotta virulenza come riportato in precedenza 24. Le barre di errore indicano la deviazione standard di tre esperimenti indipendenti. Questa cifra viene modificato con il permesso di Langner et al. 2015 Cellula eucariotica 20. Clicca qui per visualizzare un grander Versione di questa figura.
| background genetico | 1 ° Diagn. PCR (escluso / testato) | 2 ° Diagn. PCR (confermata / testato) | Meridionale (confermata / testato) | % RECOMB. |
| AB33 | 7/22 | - | 7/15 | 32 |
| AB33 CTS1 Δ | 19/24 | - | 5/5 | 21 |
| SG200 | 0/10 | 8/10 | 7/8 | 70 |
| SG200 CTS1 Δ | 0/20 | 19/20 | 14/19 | 70 |
Tabella 1:. Verifica Strain per le eliminazioni cts3 Il cts3 gene chitinasi stato eliminato in quattro differenti background genetico per consentire studi di crescita filamentosa (AB33) e infezioni (SG200) in delezioni singole e multiple.
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Discussion
Questo protocollo descrive come generare mutanti di delezione per studi di genetica inversa a U. maydis. Il punto di partenza è un costrutto delezione che contiene sequenze fiancheggianti del gene di interessi contenente sequenze di circa 1 kb a monte dell'inizio e valle del codone di stop, nonché una cassetta di resistenza appropriata come è stato precedentemente ottimizzato 7,9 . I costrutti devono essere generate singolarmente per ogni gene e controllate con cura per errori di sequenza prima di eliminare il gene. mutazioni puntiformi nel fianchi possono causare alterazioni indesiderate nella sequenza genomica, in particolare se i fianchi raggiungono nel gene vicina o la mutazione modifichi elementi regolatori. Questo interesserebbe tutti i trasformanti e può causare fenotipi e gli effetti collaterali non correlati alla delezione del gene desiderato.
Quando si pianifica la strategia eliminazione, il fenotipo atteso deve essere considerato scegliere il background genetico. Nella fattispecie, AB33 23 e SG200 10 sono stati scelti per permettere test fenotipi nel commutatore e pianta morfologica infezione. Allo stesso modo, molti altri read-out possono essere di interesse, ad esempio, fusioni con CTS1 sono impiegati in esportazione di proteine eterologhe 14,26, e uno sfondo ceppo con fluorescente contrassegnati rrm4 permette l'analisi del trasporto di RNA su endosomi 27,28.
Durante la verifica ceppo, le PCR diagnostici high-throughput permettono una rapida riduzione del numero di candidati da testare nella Southern blot piuttosto laborioso. In particolare, la prima PCR diagnostica permette esclusione di candidati che contengono ancora la copia di tipo selvatico del gene e impedisce in tal modo l'uso massiccio di fenolo tossico nei preparati gDNA. In un caso normale con un gene non essenziale, circa la metà delle colonie può contenere il gene di tipo selvatico. Questa pre-screening può essere di grande interesse per i geni con fenotipi di crescita potenzialmente dannosi. Centinaia di candidati possono rapidamente essere sottoposti a screening.
Se tutti i candidati contengono la copia di tipo selvatico, la delezione del gene è più probabile letale. Questo può essere confermato eliminando una copia in uno sfondo diploide ceppo (ad esempio D132) e l'analisi di segregazione dopo la germinazione teliospore 29. In alternativa, una strategia delezione condizionale mediante un promotore inducibile può essere scelto per seguire il fenotipo mutante. Tuttavia, anche contaminazione derivante dal metodo greggio NaOH-based per la preparazione gDNA può interferire con la PCR e portare a falsi negativi esempio candidati non mostrano una banda e quindi sono mantenuti anche se contengono il gene. Questo può essere escluso testando un gene di controllo con un prodotto dimensioni paragonabili in una reazione PCR indipendenti o multiplex-PCR con due primer gene-specifici e primer per un gene di controllo che si traducono in un frammento grande.
content "> Se un mutante è già disponibile, ad esempio, CTS1 Δ 30 o rrm4 Δ, generazione ceppo di versioni targhetta può essere accelerato sostituendo la resistenza gene delezione cassetto (es HYGR) nel genoma con un nuovo costrutto contenente, ad esempio, la rrm4 fluorescente e un marcatore di resistenza differente (es NATR). In questo caso, trasformanti possono essere sottoposti a screening per la perdita del marcatore resistenza iniziale 9. candidati corrette sono resistenti solo contro il nuovo antibiotico (nourseothricin) e hanno perso la loro resistenza iniziale (igromicina ). Inoltre, complementazione del fenotipo mutante in trans può essere effettuata per verificare la funzionalità dei costrutti targhette 30,31.La strategia gene eliminazione e la modifica qui descritto offre uno strumento affidabile e preciso in analisi genetica di U. maydis. Per delezioni multiple tuttavia, il ceppo generazione può ottenere tempo, in quanto le modifiche devono essere eseguite sequenzialmente. Pertanto, come strumento complementare, l'anno scorso il sistema CRISPR-Cas è stata stabilita per il U. Maydis 32. Offre la possibilità di distruggere diversi geni allo stesso tempo, ed è un'ottima aggiunta alla casella degli strumenti di genetica U. maydis.
In sintesi, il protocollo per la manipolazione genetica e U. maydis generazione ceppo qui descritto è un metodo robusto che è stato ampiamente utilizzato nella comunità per anni. Insieme con la raccolta completa di moduli cassette rispettiva resistenza consente a tutti i tipi di ingegneria genetica in questo fungo, affrontare questioni diverse che vanno da quella di base alla ricerca applicata.
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Acknowledgments
Un ringraziamento particolare al Dr. Benedikt Steuten per la lettura critica del manoscritto. L'opera originale sulle chitinasi è stato effettuato dal Dr. Thorsten Langner. Il laboratorio di VG è supportato dal Cluster di Eccellenza in Plant Sciences (CEPLAS, DFG EXC 1028) e BioSC, il laboratorio di KS è supportato da BioSC. KB è supportato da BioSC. Le attività scientifiche del bioeconomia Science Center (BioSC) sono stati sostenuti finanziariamente dal Ministero per l'Innovazione, la Scienza e la ricerca nell'ambito del NRW Strategieprojekt BioSC (n ° 313 / 323-400-00213). LF è sostenuto da una borsa di studio di dottorato del 1525 iGRADplant DFG International Group formazione alla ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto yeast extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+) Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
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