En Gjentatte concussive hodeskade Model i Mus

Introduction

Hjernerystelse, også kalt mild traumatisk hjerneskade (mTBI), er den mest hyppige forekomsten av traumatisk hjerneskade (TBI) og påvirker millioner av mennesker i USA. Hjernerystelser kan være vanskelig å diagnostisere, og det er ingen spesifikk kur for hjernerystelse. Det er en økende erkjennelse og noen bevis for at mild mekanisk traumer som følge av idrettsskader, militær kamp, og andre fysisk engasjerende sysler kan ha kumulative og kroniske nevrologiske konsekvenser ^1,2. Men det er fortsatt mangel på kunnskap om hjernerystelser og deres effekter. Nåværende metodikk begrenser studier av patologi og behandling hos mennesker siden bare nevrologisk vurdering og bildebehandling evaluering er tilgjengelig for klinisk diagnose. Dyremodeller gir et middel til å studere hjernerystelser i en effektiv, nøyaktig og kontrollert måte med håp om videre diagnostisering og behandling av mTBI.

Studier har tilpasset tradisjonelle TBImodeller som kontrollerte kortikalt innvirkning (CCI), til væske-perkusjon effekt (FPI), vekt fall skade, og blast skader utføre mTBI og stimulere lave skadegradene ved å endre skade parametere. Disse modellene er fordelaktig å bruke på grunn av deres evne til å replikere hjernetraume morfologisk lik den kliniske tilstanden; Men de har også sine egne begrensninger. Alvorlighetsgraden av skade indusert av en akselerasjon skade (vekt drop) er ofte svært variabel. De to resultatene av mild CCI - Hjernehinneblødning og fokale kontusjon - er ikke sammenlignbare med typiske menneskelige hjernerystelser. CCI og FPI krever en kraniotomi, som ikke er klinisk relevant, mens blast skade er en mer kontroversiell modell i forhold til de ulike eksponeringsposisjon og maksimal trykkmålinger samt variabel sekundær skade under eksponeringen ^_3-6. En oppdatert concussive dyremodell som kan oversette pre-klinisk forskning i kliniske setting er nødvendig i forskning.

Det avgjørende i modellering mild TBI er å definere den eksperimentelle skadegrads, som tettest replikerer skaden i en klinisk setting. Nylig ulike forskningsmiljøer utviklet lukket hodeskade eller concussive hodeskade (CHI) modell ^7-10. CHI er en modifikasjon av CCI uten en kraniotomi, men det fremdeles bruker en tradisjonell elektronisk magnet støt system for å generere et hode innvirkning. En CHI kan indusere en hjernerystelse alt fra mild til moderat ved å justere støtparametre. Tap av bevissthet (LOC) kan observeres umiddelbart etter et støt ved påvisning av en reduksjon i pustehastighet eller den forbigående opphør av pusting. Perioden av LOC anvendes for å bestemme graden av skade. Dette papir har en litt forbedret og oppdatert versjon av en repeterende CHI (rCHI) modell i mus, sammen med en detaljert trinn-for-trinn-protokollen og representative resultater. Den rCHI modell forskningsstrategier enre fordelaktig ved bestemmelse mTBI effekter og potensielle behandlinger, spesielt siden det ikke er noen individuell dyremodell i stand til å etterligne alle de hjernerystelse-induserte patologiske forandringer.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført under protokoller # 201207692 godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité University of Florida og i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.

1. Animal Care

1. Bruk 3-4 måneder gamle mannlige C57BL / 6J mus. Gi sengetøy, reirmateriale, mat og vann ad libitum. Hold mus i temperaturer kontrollert ved 20-22 ° C med konstant 12-timers lys / 12-timers mørke sykluser.

2. Pre-else Forberedelse

1. Fest en skreddersydd silikon metalltupp gummibelagte til en elektromagnetisk stereotaxic innvirkning enhet. Sørge for at den flate bunn av spissen er parallell med overflaten av sondespissen (figur 1A).
2. Bedøve mus med 4% isofluran fulgt av vedlikehold anestesi på 2,5% isofluran. Sjekk anestesi via strømningsmåler. Monitor anestesi nivå til dyret når et kirurgisk nivå av anestesi ved å vise tap av pedal tilbaketrekking refleks.
3. Sett musen i en utsatt posisjon på en varmepute. Bruk en traktformet nese kjegle for å holde musen under bedøvelse. Helt barbere hodet ved hjelp av en trimmer. Bruk petrolatum oftalmisk salve på musens øyne for å hindre tørrhet mens under anestesi.

3. Impact Parametere Setting

MERK: Virkningen Systemet inkluderer en kontrollboks for å stille støtparametre, en aktuator for å utføre toppelse, og en digital stereotaktisk ramme med 3-bevegelsesakser.

1. Forhåndsinnstilt hastighet av virkningen enheten til 4 m / sek og holdetid til 240 msek på kontrollboksen.

4. Plassering av Impact Senter

1. Sett en myk varmepute under dyrets kropp for å holde kroppstemperaturen nær 39 ° C. Monter mus i en stereotaktisk ramme i en prone posisjon med butt-end øret barer.
2. Senk innvirkning spiss inn mot mus hode ved å flytte Z-driver. Juster flat slag spissen (9 mm i diameter) ved å bevege X- og Y-driverne midtveis til målet koordinatene over sagittal sutur.
3. Pass på at den ene kanten av virkningen spissen er vertikalt parallelt med en tenkt horisontal linje trukket mellom de to ørene (figur 1C). Sentrum av virkningen tilsvarer den sentrale sagittale suturen midtveis mellom interfrontal og bakhode suturer (interaurale 9 mm til interaural 0 mm, lateral 4,5 mm).

5. Impact Dybdeinnstilling

1. Slik angir virkningen dybde riktig, bruk ekstra probespiss å erstatte isolert silikon innvirkning tips gummibelagt.
2. For å sikre at det ikke er noen forskyvning av virkningen sentrum etter bytte tips, sett X og Y-kanal på det digitale stereotaxic kontrollpanelet til null før du bytter tipsene.
3. Flytt probe spissen til midten av nedslagsfeltet ved manuelt å bevege X-og Y-driverne.
4. Clip kontakt sensor til musens hale.
5. Bevege anslags (Z stasjon) ned inntil sondespissen berører overflaten av virkningen området.
6. Sett Z kanal på stereotaxic kontrollpanelet til null.
7. Flytt innvirkning spissen tilbake til nedslagsfeltet ved å manuelt justere X- og Y-drivere (ikke null knappene på den digitale stereotaxic kontrollpanelet) til X- og Y-driverne er null (der virkningen Tipset ble tidligere plassert).
8. Kjør aktuatoren ved å flytte tilbaketreknings bryteren på kontrollboksen. flytte manuelt anslags ned (Z driver) med 4 mm.

6. Impact

1. Utløse effekten ved å klikke innvirkning på kontrollboksen og oppnå en deformasjon dybde på 4 mm.

7. Post-toppelse

1. Mål tiden fra virkningen til musens første åndedrag ved hjelp av en timer.
2. Tillat for utvinning før retur dyret tilbake til et rent bur. Ikke returner et dyr til selskap med andre dyr før fullt restituert.
3. Observer og veie mus daglig. Hvis musene viser tegn på smerte, intraperitonealt å injisere dem med Meloxicam på 1 - 2 mg / kg hver 12 til 24 timer.

8. Gjentatte Impaction

1. Gi musene ytterligere skader på dager 4, 7 og 10 etter den første skaden (72 timers intervall mellom virkninger).

9. Immunohistokjemi (IHC)

1. Transcardial perfusjon
   1. Anesthetize musene via intraperitoneal injeksjon med 200 m / kg pentobarbital.
   2. Vurdere og sikre kirurgisk-fly anestesi ved en tå klype. secure musen i liggende stilling ved å forsiktig taping forpotene og bakpotene til en Styrofoam arbeidsflate inne i et avtrekksskap.
   3. Lag et snitt gjennom huden langs thorax linjen fra like under xiphoid prosessen til krageben. Lag to ekstra hud snitt på xiphoid prosessen og fortsette langs bunnen av ventral brystkasse lateralt.
   4. Åpne brysthulen og utsette hjertet ved å skjære gjennom brystmuskulaturen og brystkasse.
   5. Fest bankende hjerte med sløv tang og gjøre en 1-2 mm snitt i venstre hjertekammer.
   6. Umiddelbart sette inn en sommerfugl nål inn i høyre atrium. Begynn infusjon av 20 ml saltløsning ved å trykke på sprøyten langsomt.
   7. Bytt fra saltvann til 4% paraformaldehyde. Fortsett perfusjon med 20 ml paraformaldehyde.
   8. Halshogge musen og fjerne huden med saks. Isoler hjernen fra skallen ved hjelp av et bein cutter.
2. Cryostat seksjonering
   1. Embed hjernen vev i optimal skjæring temperatur (OCT) formulering og fryse ved -80 ° C. Sett hjernen i kryostaten i en sagittal orientering. Skjær hjernen seksjoner fem mikrometer tykt.
3. farging
   1. Tørk de frosne seksjoner ved romtemperatur i 1 time.
   2. Inkuber objektglass med 100 ul 2% geiteserum og 0,1% Triton X-100 i fosfatbufret saltvann (PBS) i 1 time ved RT.
   3. Vask objektglassene 3 ganger med 300 ul PBS. Deretter inkuberes skinnene med anti-GFAP (1: 200) eller anti-ferritin-antistoff (1: 200) separat over natten ved 4 ° C.
   4. Vask objektglassene 3 ganger med 300 ul PBS. Deretter inkuberes lysbildene i 2 timer ved romtemperatur med biotin-konjugert sekundært antistoff.
   5. Vask objektglassene 3 ganger med 300 ul PBS. Deretter inkuberes skinnene med avidin-biotin kompleks (ABC) løsning (1:50) ved værelsestemperatur i 30 min.
   6. Vask objektglassene 3 ganger med 300 ul PBS. Deretter inkuberes i 3,3'-diaminobenzidin (DAB) substrat-oppløsning (50 ml PBS, 10 ul _{H2O 2,} 10 mg DAB pille, filter før bruk) i 5 - 8 min. Observer lysbildene under mikroskopet til de positive celler vises.
   7. Skyll lysbildene i sakte rennende vann fra springen i 5 min. Rene lysbilder med en lab-tørke. Deretter monterer delene med monteringsmedium og dekkglass.

Representative Results

I denne modellen (figur 1 AC), var det korte perioder med gisping og grunne respirasjon. Et tap av bevissthet (ubevisst) er definert som en reduksjon i pustefrekvens eller forbigående oppsigelse av pust før du gjenopptar normal respirasjon. En innvirkning på midten av hodet som skyldes kortvarig bevisstløshet (7,5 ± 4,7, 7,8 ± 5,5, 10,2 ± 8,8, 9,5 ± 8,0 sek ved hvert slag separat, figur 1D). Muse hjerner viste normal morfologi av H & E histologisk flekker, som indikerte ingen åpenbare strukturelle lesjoner eller vev skade som følge av virkningen (figur 2A). Som svar på TBI blir astrocytter kjent for å gjennomgå visse endringer, inkludert aktivering, proliferasjon, eller reaktive gliose ^11,12. Økt Glial fibrillary acidic protein (GFAP) positive celler med store celle organer og tykke synapser er de aktiverte astrocytter. den corpus callosum fra rCHI mus hjerner viste tydelige tegn på astrocytter aktivering 7 dager etter siste effekten (figur 2B).

Microbleeds i vevet er vanlig i mTBI og kan føre til frigjøring av jern fra hemoglobin ^13. Jernoverskudd i serum kan påvises ved ferritin tester i kliniske settinger ^13. De ferritin immunopositive celler i mus cortex ble funnet dagen etter den siste støt og varte i minst sju dager, noe som tyder på at flere forstoppelser kan resultere i kortikale microbleeds (Figur 2C).

Figur 1. En musemodell for Repetitive concussive hodeskade. (A) Skreddersydd 1 mm tykk silikongummibelagt tips måler 9 mm i diameter med en sonde tips. (B) En mus er mounted i en stereotaktisk ramme i en liggende stilling med en myk varmeputen under kroppen. (C) Virkningen sentrum posisjonering. Kanten av virkningen spissen er vertikalt parallelt med en tenkt horisontal linje trukket mellom de to ører. Virkningen sentrum tilsvarer midtveis mellom interfrontal og bakhode sting (interaurale 9 mm til interaural 0 mm, lateral 4,5 mm). (D) Apnea er definert som korte perioder med forbigående oppsigelse av pusting. Mean og SD er vist i nedre panel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Histologi for Repetitive concussive hodeskade. (A, venstre) En mus hjerne ble fjernet etter perfusjon med 4% paraformaldehyde. Ingen skade på vev ble funnet. (B) Forhøyelse av biokjemisk markør for gliose (GFAP) i corpus callosum 7 dager etter den siste skade. Scale bar = 200 mikrometer. (C) Ved immunhistokjemi, ferritin-H-kjeden ble funnet å være uttrykt i hjernebarken etter skade. Innleggs Bildene representerer forstørret positive celler. Scale bar = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Å etterligne hjerneskader morfologisk lik kliniske tilstand, er post-hjernerystelse symptomer forventet. Post-hjernerystelse symptomer generelt er hodepine, svimmelhet, svimmelhet, tretthet, minne og søvnproblemer, problemer med konsentrasjon samt angst og nedstemthet. Siden somatiske symptomer ennå ikke kan være målbare i dyremodeller, blir endringene av motorisk og kognitiv funksjon og emosjonelle atferd brukt som kriterier for rasjonelt evaluere hjernerystelse i dyremodeller. I en tidligere rapportert studie ble det vist at rCHI musemodell induserer underskudd i romlig læring, hukommelse og angst ^8. Enda viktigere, rCHI modellen som brukes i denne protokollen representerer et klinisk miljø uten invasiv hjerneskade eller hjernestrukturen brudd, som begge kan resultere i blødning, blødning, ødem, akutt eller tap celledød / vev.

Følgende er viktige tips for vellykket modellering konsekvent concussion / mTBI ved hjelp av en elektronisk magnet innvirkning system:

Unngå en andre hjerneskade direkte etter den første hjerneskade som kan være forårsaket av bevegelse under innvirkning. Musen hodet kan bevege seg litt ned under sammenstøtet. For å unngå en hjerne kontusjon forårsaket av en rask bevegelse mot harde bakken eller hodet stretching, må en myk oppvarming puten bli satt under musen kroppen. Hodet og kroppen må også holdes vannrett. I tillegg bruker butt-end øret barer å fikse musen hodet i stereotaktisk ramme, og ikke sette dem inne i øregangen. Dette beskytter mus mot skader forårsaket av skarpe kanter under bevegelsen.

Korrekt posisjon virkningen sentrum og etablere null. I motsetning til åpen hodeskade, er virkningen tips posisjonering relativt vanskelig. Størrelsen av virkningen spissen og slagsenteret påvirker skadegrads og lesjoner. Ut fra musehjerne anatomi, vil støtet sentrum er utformet for å tilsvare midtveismellom interfrontal og bakhode suturer (interaurale 9 mm til interaural 0 mm, lateral 4,5 mm). Det er således en optimalisert 9 mm spiss nødvendig. Virkningen spiss må justeres til målet koordinatene over sagittal sutur midtveis, og en kant av slagspissen må være vertikalt parallelt med en tenkt horisontal linje trukket mellom de to ørene (figur 1C). Den isolerte virkningen spiss med en silikongummibelegg blokker av kontaktsensoren og hindrer virkningen dybdeinnstilling. Et sondespissen er nødvendig, og bør være parallell med overflaten av knappen på virkningen spissen. Sentrum av effekten justeres til sondespissen rørende område ved å drive den stereotaksisk instrument. Skrubbing hodet med saltvann øker elektro-følsomhet. Dessuten er sonden avtagbar eller utformet for ikke å skade hjernen under sammenstøtet. En alternativ måte er å bygge to tips med samme lengde; en spiss belagt med silikon gummi og andre tips vil være av metall, noe som vil væreanvendt som en probe spiss. De to tipsene bør byttes mellom posisjonering og støtende.

Overvåk musens korte ubevisste symptomer umiddelbart etter en innvirkning. Som diskutert ovenfor, de fleste post-hjernerystelse symptomer er vanskelige å observere umiddelbart i et laboratorium mus dyremodell. mTBI pasienter kan oppleve en kortvarig tap av bevissthet etter skaden. For å etablere de synlige skader parametre, en kortvarig tap av bevissthet var et symptom brukes til å vurdere gyldigheten av denne concussive TBI modell. Tap av bevissthet (LOC) blir vanligvis brukt som kriterier for å klassifisere skadegrads i TBI pasienter. I de fleste sports-relaterte hjernerystelser, varigheten av LOC er mindre enn ett minutt ^14. Ved å optimalisere de eksperimentelle forhold, slik som anslagshastighet og oppholdstid, er det LOC mindre enn 10 sekunder etter en innvirkning. Den optimale effekt tilstand er en 4 mm slagdybde, 240 msek holdetid, og 4 m / s kollisjonshastighet. Økt effekt hastighet og dveletid kan føre til akutt økt intrakranielt trykk over en stor mengde tid, noe som kan føre til alvorlig hjerneskade eller død umiddelbart fra respirasjonsdepresjon. Mus vil miste kroppsvekt etter hvert slag, men vil gjenvinne vekt etter 72 timer for utvinning. 72 timers gjentatte intervaller er valgt for å etterligne en restitusjonsperiode for skadde idrettsutøvere før retur til sin idrett.

Foruten tap av bevissthet og luftveisproblemer, kan klinikken symptomer på hjernerystelse inkluderer kramper, hodepine, svimmelhet, kvalme og oppkast. I modellen, kan hjerne smerte være de fleste ubehagelig symptomet til dyrene. Kroppens tilstand score og smerte kategoribeskrivelse bør brukes som humane endepunkter. I tillegg bør andre spesifikke nevrologiske endepunkter som ukontrollerte anfall, spontan sirkle oppførsel, tap av balanse og ute av stand til å gå eller stå betraktes som rCHI-spesifikke humane endepunkter. Siden dette er en mild skade-modell, normalt ingen signifikantBetydelige tegn på smerte er observert etter hvert slag. Analgetika er vanligvis nødvendig på dette nivået av hjerneskade. Denne protokollen inneholder detaljerte viktige skritt for å modellere en repeterende concussive mild TBI. Av hastigheten og dybden av hvert støt kan justeres avhengig av den ønskede graden av skade. Denne modellen bruker en elektronisk magnet innvirkning system for å levere konsekvenser. Det er stabil med en nøyaktig kontrollert hastighet, oppholdstid, og deformasjon dybde. Imidlertid, fordi det er en lukket hodeskade uten en kraniotomi, er det mulig å nøyaktig posisjonere musehjerne ved hjelp av virkningen stereotaksiske koordinater. Også bytter de innvirkning / probespisser kan resultere i en innvirkning nettstedet skift, som er den viktigste årsaken til inkonsistente skader. Tatt i betraktning den diffuse skade og hjernerystelse viste seg som forventet, forblir denne modellen nøyaktig og lett å kontrollere.

Denne modellen er gunstig å bruke for nøyaktigheten og enkelheten i å bestemme effekten av påvirkning-relaterte mild hjerneskade, spesielt sports-relaterte hjernerystelse. Det fungerer som en plattform for prekliniske studier som utforsker diagnostiske og prognostiske biomarkører samt testing medisinsk utstyr, medisiner og genterapi løsning. Denne modellen kan også brukes til studier av kronisk traumatisk encefalopati (CTE), som i dag er bare diagnostiserbare gjennom post-mortem nevropatologiske eksamen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anesthesia machine	Eagle Eye Anesthesia, Inc	Model 150	anesthesia
Electromagnetic Impactor	LeicaBiosystems	Impact One Stereotaxic Impactor	perform impaction
Digital Stereotaxic instrument	LeicaBiosystems	39462501	mount mouse and positioning tips
Sicilone rubber-coated metal tip	Precision Tool & Engineering, Gainesvill FL	custom-made	impact tip
Lithium Ion All-in-One Trimmer	WAHL Home Products	9854-600	shave mouse hair
paper clips	custom-made		probe tip
Cotton tipped applicators	MEDLINE	MDS202055	scrub head with saline
Tissue Tek O.C.T.	ASKURA FINETEK USA INC	4583	tissue embedding
anti-GFAP	Dako	CA93013	antibody for IHC
anti Ferritin	Sigma	F6136	antibody for IHC
VECTASTAIN Elite ABC  kit	Vector laboratories	PK-6100	IHC detection system
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Aperio XT ScanScope scanner	Leica Microsystems Inc,		slides scanning
Leica AutoStainer XL	Leica the pathology Company	ST2010	H&E staining
DAB	sigma	D3939	IHC detection system