We beschrijven hier een methode om aanpasbare antigeen-microarrays te genereren die kunnen worden gebruikt voor de gelijktijdige detectie van serum IgG en IgM auto-antilichamen van mensen en muizen. Deze arrays maken een doorvoer en kwantitatieve detectie mogelijk van antilichamen tegen willekeurige antigenen of epitopen van belang.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Genereren van tweekleurige Antigen Microarrays voor de simultane detectie van IgG en IgM Autoantistoffen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Auto-antilichamen, die antilichamen zijn tegen zelf-antigenen, zijn aanwezig in veel ziektetoestanden en kunnen dienen als markers voor ziekteactiviteit. De niveaus van auto-antilichamen tegen specifieke antigenen worden typisch gedetecteerd met de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) techniek. Het screenen op meerdere auto-antilichamen met ELISA kan echter tijdrovend zijn en vereist een grote hoeveelheid monsters van patiënten. De antigen microarray techniek is een alternatieve methode die kan worden gebruikt om auto-antilichamen op een multiplex manier te screenen. In deze techniek worden antigenen gearrayd op speciaal gecoate microscoopglazen met een robotische microarrayer. De glazen worden onderzocht met serummonsters van patiënten en vervolgens worden fluorescent-gelabelde secundaire antilichamen toegevoegd om binding van serum auto-antilichamen aan de antigenen te detecteren. De reactiviteit van de auto-antilichamen wordt onthuld en gekwantificeerd door de glazen te scannen met een scanner die fluorescente signalen kan detecteren. Hier beschrijven we methoden om aangepaste antigen microarrays te genereren. Onze huidige arrays worden gedrukt met 9 vaste pins en kunnen tot 162 antigenen bevatten die in duplicaat zijn aangebracht. De arrays kunnen eenvoudig worden aangepast door de antigenen in de bronplaat te veranderen die door de microarrayer wordt gebruikt. We hebben een tweekleurige detectiemethode voor secundaire antilichamen ontwikkeld die IgG en IgM reactiviteit op hetzelfde glazuuroppervlak kan onderscheiden. Het detectiesysteem is geoptimaliseerd om binding van humane en muis-auto-antilichamen te bestuderen.
Inleiding
Autoantilichamen zijn aanwezig in veel ziektetoestanden en kunnen vaak direct pathogene activiteit hebben1. Identificatie van autoantilichamen is belangrijk voor de diagnose van bepaalde ziekten, voor de prognose van het verloop van de ziekte en voor de classificatie van patiënten die mogelijk baat hebben bij specifieke therapieën2. Autoantilichamen worden doorgaans in patiëntenserum geïdentificeerd met behulp van de ELISA-techniek; het screenen op meerdere antigenen met deze techniek is echter arbeidsintensief en vereist een grote hoeveelheid monsters. Nieuwe technologieën zijn daarom nodig om autoantilichamen op grotere schaal te profileren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Verdunning antigenen en genereren Antigen Microarrays
- Verdun antigenen in PBS tot een eindconcentratie van 0,2 mg / ml. Druk tot 162 unieke antigenen in tweevoud met een microarrayprinter configuratie met 9 pinnen. Onder IgG en IgM antigenen in het antigeen bibliotheek als positieve controles. Omvatten PBS alleen als een negatieve controle.
- Voeg 20 ul van elk antigeen aan de 384 goed bronplaat. Antigenen toevoegen bronplaat in groepen die de instelling van de printkop spiegel (bv regelen antigenen in groepen van 9 bij 9 kunnen worden gebruikt voor het afdrukken).
- Cover bron plaat met folie en bevriezen bij -80 ° C tot klaar ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Antigenen zijn aangebracht in een plaat met 384 putjes en gedrukt op objectglaasjes door een robot microarrayprinter zie figuur 1. Figuur 2 toont glaasjes geplaatst in een frame met incubatie kamers en een gescande dia na verwerking. Figuur 3 toont positieve en negatieve controleglaasjes. De negatieve schuif alleen maar geprobed met secundaire antilichamen, en de positieve controle dia geprobed met serum van een patiënt met systemische l.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven protocol maakt de kwantificering van auto-antilichamen met het antigeen microarray techniek. Antigeen microarrays bieden verscheidene voordelen boven conventionele ELISA screening voor autoantilichamen. Allereerst een grote antigenen zoals nucleïnezuren, eiwitten, peptiden, en cellysaten worden opgesteld op de met nitrocellulose gecoate glaasjes, hetgeen aldus gemultiplexte screenen van autoantilichamen. Bovendien, slechts microgram antigeen nodig om de arrays genereren aangezien nanoliters antigeendo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
A.C. werd ondersteund door een postdoctorale beurs van de Heart and Stroke Foundation of Canada en het Training Program in Regenerative Medicine (Canadian Institutes of Health Research). F.Y.Y.H. werd ondersteund door het Training Program in Regenerative Medicine. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van Astellas Pharma Canada. We willen ook Dr. Mark Menenghini (University of Toronto) bedanken voor het gebruik van zijn Axon microarray scanner.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Ribosomal P0 | Diarect | 14100 | verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS |
| human IgG | Jackson Immuno | 009-000-003 | verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS |
| human IgM | Jackson Immuno | 009-000-012 | verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS |
| mouse IgG | Sigma-Aldrich | I5381 | verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS |
| mouse IgM | Biolegend | 401601 | verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS |
| double-stranded DNA | Sigma-Aldrich | D1626 | verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS |
| single-stranded DNA | Sigma-Aldrich | D8899 | verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS |
| microarrayer | Virtek | VersArray Chipwriter Pro | veel soorten arrayers zijn geschikt |
| solid printing pins | Arrayit Corporation | SSP015 | |
| software voor robotische microarrayer | Virtek | Chipwriter Pro | |
| FAST slides (2 Pad) | GVS Northa America | 10485317 | |
| FAST frame | GVS Northa America | 10486001 | |
| FAST incubation chambers (2 Pad) | GVS Northa America | 10486242 | |
| 384 well plates | Whatman | 7701-5101 | |
| plate sealers | VWR | 60941-062 | |
| foil plate covers | VWR | 60941-124 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 12483020 | |
| Cy3 goat anti-human IgG | Jackson Immuno | 109-165-096 | gebruik werkstock in 50% glyercol |
| Cy5 goat anti-human IgM | Jackson Immuno | 109-175-129 | gebruik werkstock in 50% glyercol |
| Cy3 goat anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 115-165-071 | gebruik werkstock in 50% glyercol |
| Cy5 goat anti-mouse IgM | Jackson Immuno | 115-175-075 | gebruik werkstock in 50% glyercol |
| Microarray Scanner | Molecular Devices | Axon 4200A | |
| Microarray software | Molecular Devices | Genepix 6.1 | |
| Clustering software | eisenlab.org | Cluster 3.0 | |
| Heatmap software | eisenlab.org | Treeview 1.60 | |
| Microarray statistische software | Stanford University | SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays) |
Referenties
- Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
- Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
