Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

استخدام المستحثة الجسدية التحليل القطاعي (ISSA) لدراسة الجينات والمروجين المشاركة في تشكيل الخشب والتنمية الجذعية الثانوية

Published: October 5, 2016 doi: 10.3791/54553
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3,4, 1
1School of Ecosystem and Forest Sciences, Faculty of Science, The University of Melbourne, 2Victorian AgriBiosciences Centre, La Trobe University R&D Park, 3College of Biological Sciences, Department of Plant Biology, University of California, Davis, 4Department of Genetics, Forestry and Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria

Abstract

نمو الجذعية الثانوي في الأشجار وتشكيل الخشب المرتبطة هم كبير سواء من وجهة نظر بيولوجية والتجارية. ومع ذلك، لا يعرف إلا القليل نسبيا عن السيطرة الجزيئية التي تتحكم تنميتها. هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى المادية، والموارد وضيق الوقت وغالبا ما ترتبط مع دراسة عمليات النمو الثانوية. وقد تم استخدام عدد من التقنيات في المختبر تنطوي إما مصنع جزء أو نظام مصنع كامل في كلا الخشبية والنباتات غير الخشبية. ومع ذلك، تساؤلات حول إمكانية تطبيقها لدراسة عمليات النمو الجذعية الثانوية، وعناد بعض الأنواع وكثافة اليد العاملة وغالبا ما تكون باهظة للأجل المتوسط ​​إلى تطبيقات إنتاجية عالية. أيضا، عند النظر في تطوير الجذعية والخشب تشكيل الثانوي سمات محددة في إطار التحقيق قد تصبح فقط قابلة للقياس في وقت متأخر من دورة حياة الشجرة بعد عدة سنوات من النمو. في التصدي لهذه التحديات بديل في الجسم الحي صوقد وضعت rotocols، واسمه المستحثة الجسدية تحليل القطاع، والتي تنطوي على إنشاء قطاعات الأنسجة الجسمية المعدلة وراثيا مباشرة في الجذعية الثانوية للنبات. والهدف من هذا البروتوكول هو توفير وسيلة فعالة وسهلة وسريعة نسبيا لخلق الأنسجة النباتية الثانوية المعدلة وراثيا لالجيني وتوصيف وظيفي المروج التي يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من أنواع الأشجار. وتشير النتائج المعروضة هنا أن القطاعات الجذعية الثانوية المعدلة وراثيا يمكن أن تنشأ في جميع الأنسجة الحية وأنواع الخلايا في ثانويه ينبع من مجموعة متنوعة من أنواع الأشجار والخشب الصفات المورفولوجية وكذلك أنماط التعبير المروج في الثانوية ينبع يمكن تقييمها بسهولة تسهيل متوسطة إلى عالية توصيف وظيفي الخرج.

Introduction

شجرة ينبع تضم كمية كبيرة من الكتلة الحيوية الكواكب وذات الأهمية البيولوجية والثقافية والتجارية الهائلة. ثانويه ينبع خلق الموائل من خلال توفير الموارد والمأوى للعديد من أشكال الحياة الأخرى. أنها تقدم العديد من الخدمات الأخرى إلى النظم البيئية التي تعيش وتعمل كمورد المتجددة لإنتاج الأخشاب والورق وغيرها من الخشب والمنتجات غير الخشبية. ويخضع تنمية الجذعية الثانوية وتشكيل الخشب بشكل أكثر تحديدا من قبل نظام الجزيئية المعقدة التي تنظم تطوير أنواع معينة من الخلايا، وتكوين كيميائي حيوي من جدران الخلايا وكيفية ترتيبها لتشكل الأنسجة والأعضاء. تشريح الأساس الجزيئي للتنمية الجذعية الثانوية وتشكيل الخشب ومرتبك من قبل العديد من العوامل بما في ذلك التغير في خصائص الخشب وساق داخل وبين ينبع وأوقات الجيل طويلة، ونظم التزاوج خارج المعبر، وارتفاع تغاير، وتحميل وراثية عالية، السكون الموسمية، طويل ناضجفترات إقامة السمات الشخصية والحجم المادي الهائل من الأشجار الناضجة. ونتيجة لذلك، فهم التنمية الجذعية الثانوية بالنسبة إلى معرفة تفصيلية لمعظم جوانب أخرى من السيطرة الجزيئية لتطوير المصنع، لا تزال في مهدها.

وقد تم استخدام عدد من التقنيات في المختبر لدراسة وفهم تطور الجذعية الثانوية، في الخشب معين والثانوي تشكيل جدار الخلية. وتشمل هذه البروتوكولات استخدام نبات كامل أو أنظمة جزء النبات، حيث يتم إنشاء أي النباتات المعدلة وراثيا أو يتم تحويل خلايا الثانوية محددة أو أنسجة لدراسة جوانب معينة من الخشب و / أو تطوير الجذعية الثانوي 1. النباتات المعدلة وراثيا يمكن استرداد تحول آخر الوراثي من مجموعة واسعة من الأنسجة النباتية وأنواع الخلايا، ولكن التقدم بطيء، ولا سيما عند تحليل سمات ألياف الخشب بسبب تجديد الطويل ووقف الأوقات النضج (بالترتيب من سنة)، عالية التقنية و رواجا العملس، والإنتاجية المنخفضة من الجينات المرشحة وكذلك صعوبات في نشر بعض أنواع النباتات الخشبية. وقد تم تطوير تقنيات مماثلة في نظام نموذجي غير الخشبية مثل نبات الأرابيدوبسيس أن التغلب بنجاح بعض من هذه القيود، ولكن ليس كل أنواع الخلايا الجذعية الثانوية حاضر في هذه السيقان والصفات المتعلقة موسمية أو طول العمر لا يمكن أن تدرس في مثل هذه الأنواع 2. بدلا من ذلك، نظم جزء النبات، مثل Pinu الصورة رديتا الثقافات الكالس 3 تقلل من الأطر الزمنية المرتبطة بها. هذه الأساليب ولكن تقتصر على الدراسة وجود نوع من الخلايا الفردية ويعاني قيودا مماثلة كما لوحظ للتجارب في المختبر. وبالمثل، فقد أظهرت الثقافات الجذعية قمي 4 تنطوي إإكسبلنتس الجذعية كلها الوعد ولكن حتى الآن لم يتم تطبيق لدراسة الجينات أو المروجين لمصلحة محددة. وفي الآونة الأخيرة، تم وضع بروتوكول بديل تنطوي على الثقافات جذور شعر ليوكاليبتوس ​​وكان بنجاحتطبيق 5، ولكن هذا الأسلوب لا يزال يتطلب في زراعة المختبر، ينطوي على الجذور الثانوية بدلا من السيقان وحتى الآن يقتصر على أنواع الأشجار واحدة.

الناجم عن تحليل قطاع الجسدية (ISSA)، كما هو موضح هنا، وقد وضعت للتغلب على بعض هذه المشاكل توفير متوسطة الى عالية الإنتاجية أداة فحص وظيفي للجينات والمروجين مع الأدوار يشتبه في تشكيل الخشب وتنمية أنسجة الساق الثانوية. ISSA هو التحول وفحص نظام في الجسم الحي والتي وضعت للحد من الوقت اللازم لإنتاج خلايا معدلة وراثيا والأنسجة في جذع الثانوي سليمة في حين التغلب العمل، والقيود الفنية والإنتاجية من روتيني المستخدمة في أساليب المختبر. البروتوكولات وصفها هنا تسمح لإنشاء وقت واحد من مئات من قطاعات الأنسجة تتحول بشكل مستقل والخلايا في ينبع الثانوية في غضون فترة قصيرة من الزمن، في أنواع الأشجار والأنسجة من الاهتمام دون زتباين enetic و / أو البيئة ضمن أطر زمنية قصيرة نسبيا وانخفاض تكلفة اليد العاملة. وصفت ISSA في الجسم الحي تقنيات أولا لالجذعية الثانوي 6 و برعم 7 الأنسجة ومنذ ذلك الحين تم صقلها في أنسجة الساق الثانوية من خلال دراسات الجينات و / أو المروجين تشارك في التمايز متعلق بالصرف المالي وتشمل: تويولين (الحوض) 8، مثل fasciclin arabinogalactan ( FLA) 9، السليلوز سينسيز (CESA) 10 والثانوي الخلية المرتبطة جدار المجال بريدا (SND2) 11، ARBORKNOX (ARK1) 12 ومثيرة للاهتمام حقا الجين الجديد (RING) H2 البروتين 13. هذه الدراسات أجريت في الثانوية ينبع من النباتات أشجار الحور والكافور، وقدمت نظرة ثاقبة مورفولوجيا الخلايا والكيمياء جدار الخلية والتعبير الجيني.

والغرض من هذه البروتوكولات المذكورة هنا من اجل تقريب وتجربةالثانية المعرفة المكتسبة من خلال تطوير وتطبيق ISSA من مجموعة من الدراسات المنشورة وغير المنشورة على مدى العقد الماضي. وهي تركز على التحول في الجسم الحي من أنسجة الساق الثانوية 6 والتركيز على الدراسات التي تنطوي على استنساخ حور أبيض "الهرمي"، الأوكالبتوس كرية وكذلك 11 الأوكالبتوس كرية س استنساخ البان. تأخذ هذه الوثيقة الباحثون من خلال البروتوكول من زراعة النباتات والبكتيريا، والتحول من أنسجة الساق والنمو والحصاد من الأنسجة، وتحديد الخلايا والأنسجة المعدلة وراثيا، والإعداد لعمليات التقييم وأساليب المظهرية لجمع وتحليل البيانات. في حين تم بنجاح تطبيق تقنيات لقياس جدار الخلية تكوين أحادي السكاريد أيضا 9،11، نظرا لضيق المكان، وتركز هذه الوثيقة على التقنيات المستخدمة لقياس الخلايا والتشكل الأنسجة وفهم أنماط التعبير الجيني في الحادي والثانوينظم الإدارة البيئية فقط. وفقا لذلك، وبروتوكول النحو المبين هو مناسبة لأولئك الذين يبحثون لكسب مزيدا من الإيضاحات عن دور و / أو التعبير عن جينات مرتبطة الثانوية ينبع باستخدام منخفضة التكلفة، وسهلة من الناحية الفنية، والمتوسطة إلى طريقة إنتاجية عالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المواد النباتية

  1. قبل التجريب، ورفع شتلة جديدة من أنواع الأشجار المفضلة من البذور أو القطع وتنمو شجرة / ثانية حتى قطر الجذعية في المنطقة المخصصة للالتجريب هو حوالي 1 سم في القطر.
    ملاحظة: الوقت اللازم قد تختلف بسبب معدلات نمو النبات وبالتالي تسمح بين 3-9 أشهر لهذه الخطوة.

2. ثنائي ناقل الخلق

  1. إجراء عمل من هذا الباب إلى الباب 7 في المختبر أو المسببة للاحتباس الحراري حيث يمكن التعامل مع الأجرعية المورمة ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة المنصوص عليها في المختبر يستخدم.
  2. إعداد ناقل ثنائي تحتوي إما على الجينات من ضربة قاضية الفائدة أو كاسيت overexpression وبيتا غلوكورونيداز (المكتب المركزي للاحصاءات) مراسل كاسيت الجين أو مروج للمصلحة تنصهر في جين والمكتب المركزي للاحصاءات اعتمادا على نوع الدراسة.
    ملاحظة: هناك عدد من البكالوريا ناقل ثنائيkbones التي يمكن أن يكون مصدرها تجاريا أو من خلال شبكات البحث وكذلك التقنيات العديدة المتاحة إدراج الجينات والمروجين للاهتمام في ناقلات الثنائية. في سياق هذا البروتوكول هو ما يصل الى المجرب لاتخاذ القرار حول كيفية إنشاء ناقل ثنائي.
  3. تحويل ناقلات ثنائي الى سلالة تم نزع أسلحتهم من أ. المورمة باستخدام Electroporation للأو حرارة صدمة 14 وتخزينها بشكل مناسب لحين الحاجة إليها للتجريب.
  4. كرر الخطوة 2.2 لأي إيجابية و / أو ضوابط السلبية.
    ملاحظة: يجب أن تتضمن الضوابط السلبية ناقل ثنائي لا تحتوي على الجين لجينات دراسة الفائدة والمكتب المركزي للاحصاءات promoterless لمروج للدراسة الفائدة. وينبغي أن تشمل مراقبة إيجابية لمروج للدراسة الفائدة القرنبيط الفسيفساء 35S الفيروسات المروج (CaMV35s) تنصهر لمراسل المكتب المركزي للاحصاءات.

3. إعداد أ. المورمة للتلقيح

  1. في الأسبوع على الأقل قبل EXPERimentation، تأخذ كمية صغيرة (حوالي 1 ميكرولتر) من أ. المورمة أعدت خلال خطوة 2.2 و 2.3 و تنتشر رقيقة على المتوسطة LB منفصل مع أجار 14 لوحات تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة لاختيار البكتيرية. ينمو بمعدل 28 درجة مئوية في حاضنة لتشكيل مستعمرات صغيرة ومن ثم تخزينها في 4 ° C لحين الحاجة إليها.
  2. قبل 48 ساعة من التجريب، ونقل مستعمرة واحدة من أ. المورمة من كل لوحة في منفصلة 50 مل رأس المسمار أنابيب تحتوي على 5 مل من قبل تحسنت (28 ° C) وسائل الاعلام LB 14 التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة لاختيار البكتيرية وتستنهض الهمم في 200 دورة في الدقيقة في حاضنة شاكر لمدة ما يقرب من 48 ساعة على 28 درجة مئوية حتى خليط غائما جدا.
  3. بين 4-6 ساعة قبل التلقيح من محطة ينبع (القسم 4) إضافة 1 مل من LB / أ. المورمة الخليط في 50 مل جديدة المسمار أعلى أنبوب يحتوي على 19 مل (01:20 تمييع) من جديد دافئ (28 درجة مئوية) وسائل الاعلام LB مع المضادات الحيوية المناسبة لاختيار البكتيرية. إذا الكثافة الضوئية (OD) في 600 نانومتر (OD 600، مقاسا الطيفي) فوق 0.1، وتمييع مع مزيد من LB دافئ حتى يتحقق ذلك.
  4. وضع المخفف LB / أ. المورمة الخليط مرة أخرى على حاضنة شاكر ويهز في ظل نفس الظروف (200 دورة في الدقيقة، 28 درجة مئوية) حتى OD 600 ما بين 0،4-0،6 وإزالتها.
  5. الطرد المركزي LB / أ. المورمة الخليط لمدة 15 دقيقة في 1000 x ج و 4 درجات مئوية.
  6. صب السائل و resuspend A. فورا المورمة بيليه في 1 مل من تبريد وسائل الإعلام MS 15، ونقل إلى 2 مل microtube وتخزينها على الجليد حتى المطلوبة للتلقيح (القسم 4). ويشار إلى هذا الحل لمثل التلقيح وسائل الإعلام.

4. تلقيح النبات الجذعية مع أ. المورمة

  1. بدء التجريب في أواخر الربيع أو أوائل الصيف باستخدام النباتات التي تم إنشاؤها في القسم 1 أن يكون لها طبقة الكامبيوم نشطة وسريعة النمو. والتشخيص جيدة لنشط وسريع طبقة الكامبيوم المتزايد هو أن اللحاء يمكن مقشر بسهولة من الخشب.
  2. البحث قسم التوالي واضحا على الساق بالقرب من قاعدة النبات وإزالة أي أوراق الشجر والأغصان.
  3. باستخدام مشرط حاد (ويفضل رقم 11) أو شفرة حلاقة، وخلق 1 سم "نافذة متعلق بالصرف المالي" 2 في القسم واضح للالجذعية عن طريق إدخال اثنين من شق مواز الرأسي من خلال اللحاء من 20 ملم في الطول واحد 5 مم وبصرف النظر بعد ذلك قطع الأفقي الذي يربط بين اثنين من التخفيضات الرأسي في نهايتها القاعدية.
  4. قشر قطاع اللحاء التي أنشأتها شق تعريض صعودا أنسجة الخشب تطوير وإضافة ما يكفي من التلقيح وسائل الإعلام من الخطوة 3.6 لترطيب سطح الخشب تطوير يتعرض باستخدام ماصة (عادة 5-10 ميكرولتر). على الفور أعد قطاع اللحاء.
  5. ربط قطاع اللحاء إلى الجذعية بشكل وثيق مع بارافيلم.
  6. كرر الخطوات من 4،2-4،5 عن أي ويندوز متعلق بالصرف المالي إضافية لهذا الجين (ق) أو المروج (ق) من خلق الفائدةنيويورك النوافذ متعلق بالصرف المالي الجديد لا يقل عن 1 سم فوق أو تحت النوافذ متعلق بالصرف المالي الأخرى وفي 90 ° الإزاحة.
  7. أكمل الخطوات 4،2-4،5 لناقلات السيطرة الإيجابية والسلبية (خطوة 2.4) ضمان أن تتم إضافة كل متجه إلى نفس الجذعية من كل النباتية المستخدمة في التجربة.
  8. مراقبة نمو الجذعية قطر بشكل دوري وحصاد المكتب المركزي للاحصاءات فحص (القسم 5) عندما لوحظ نمو شعاعي من 5 مم على الأقل في ينبع.
    ملاحظة: مقدار النمو شعاعي اللازمة تعتمد على كمية من الأنسجة اللازمة لتحليل المصب.

5. حصاد لالمكتب المركزي للاحصاءات النسيجي الفحص

  1. المكوس على "نافذة متعلق بالصرف المالي" من جذع إزالة أي نوع من الأنسجة ليست جزءا من نمو جديد ضمن إطار متعلق بالصرف المالي.
    1. للدراسات المتعلقة تنضج الخشب واللحاء مورفولوجيا الخلايا / الأنسجة، قشر اللحاء من الخشب.
    2. للدراسات التي تتطلب منطقة متعلق بالصرف المالي للبقاء أنماط التعبير سليمة أو المروج هي أن تقييمالطبعه، شريحة نافذة متعلق بالصرف المالي بشكل مستعرض باستخدام شفرة حلاقة أو غيرها من شفرة حادة إلى أقراص من بين 0.5 و 1 مم في السمك.
  2. وضع معالجة الأنسجة نافذة متعلق بالصرف المالي في 14 مل جولة أنابيب أسفل وشطف مرتين في 0.1 م العازلة الفوسفات في درجة الحموضة 7 14. تأكد من أن الأنسجة مغمورة تماما، لا يزال في حل لمدة خمس دقائق على الأقل وتتم إزالة كل حل الزائد في نهاية شطف الثاني.
  3. إضافة 5 مل من المكتب المركزي للاحصاءات كاشف (0.5 ملم X-gluc (حمض 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-β-D-الغلوكورونيك)، 10 ملي EDTA، 0.5٪ تريتون X-100 ت / ت، و 0.5 ملي البوتاسيوم فيري سيانيد (III)، 0.05 فيروسيانيد ملي البوتاسيوم (II)، تتكون من الحجم النهائي مع 0.1 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7؛ انظر هوكينز وآخرون 16) إلى كل أنبوب. إذا لم يتم المغمورة الأنسجة تماما، إضافة كاشف المكتب المركزي للاحصاءات إضافية.
  4. احتضان الأنابيب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 55 مئوية في الظلام.
  5. احتضان أنابيب ل12-16 ساعة إضافية عن حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية في الظلامباستخدام الإثارة لطيف (بين 30 و 60 دورة في الدقيقة) للسماح للخلط.
  6. عند إزالة من الحاضنة شاكر تحقق عشوائيا درجة الحموضة من المكتب المركزي للاحصاءات كاشف في مجموعة فرعية صغيرة من الأنابيب باستخدام ورقة عباد الشمس مع مجموعة الحموضة 0-7.
    1. إذا كان أي من الأنابيب لديها درجة الحموضة أقل من 6 ثم تسمية لهم. الاستمرار في مراجعة ما تبقى من الأنابيب لتأكيد الرقم الهيدروجيني وتسمية إذا الرقم الهيدروجيني 6 أو أقل.
      ملاحظة: نماذج مع الرقم الهيدروجيني أقل من 6 قد لا تكون مناسبة للتحليل. هذه العينات يجب أن تكون مستبعدة من مزيد من التحليل.
  7. صب المكتب المركزي للاحصاءات كاشف واستبدالها بعدد كاف من الايثانول 70٪ لتغطية الأنسجة.
  8. تخزينها في 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.

6. تحديد المعدلة وراثيا الأنسجة

  1. باستخدام ملقط، واخراج كل الأنسجة نافذة متعلق بالصرف المالي من أنبوب ووضعه في علبة صغيرة أو طبق بتري للسماح التصور المجهري.
  2. باستخدام مجهر تشريح بين 1X و 4X التكبير، وتحديد وحصر عدد الخلايا أو الأنسجةالتي لديها تلطيخ زرقاء لامعة. ويشار إلى الأزرق الخلايا الملون أو الأنسجة لكقطاع من هذه النقطة فصاعدا. حصر لهم في الطرق التالية.
    1. للعينات التي تم فيها إزالة اللحاء (الخطوة 5.1.1)، والاعتماد على عدد من القطاعات في الأنسجة متعلق بالصرف المالي وجدت على سطح من الخشب تطوير (قطاع متعلق بالصرف المالي، الشكل 1A).
    2. للعينات التي تم مقطعة إلى أقراص (الخطوة 5.1.2)، والاعتماد على قطاعات عدد جدت في الخلايا او الانسجة أنواع مختلفة (الشكل 1B، 1C، 1D). القطاعات يمكن العثور عليها في أنواع الأنسجة التالية: محيط بالأدمة (قطاع محيط بالأدمة، الشكل 1E)، اللحاء (قطاع اللحاء، الشكل 1F)، الأنسجة متعلق بالصرف المالي القطاع حمة (قطاع متعلق بالصرف المالي، الشكل 1G، 1H، 1I)، الجرح حمة (بالجروح، الشكل 1J) وفي tyloses (قطاع Tylose، الشكل 1K).
      1. خلال المجهريssessment ضمان أن كلا الجانبين من قرص تم النظر إلى وأن القطاعات التي تحدث عبر اثنين من الأقراص تتم مطابقة بحيث لا يتم المبالغة في تقدير أرقام.
  3. وضع قطاعات فقط الأنسجة التي تحتوي على العودة إلى أنبوب يحتوي على 70٪ من الإيثانول وتخزينها لحين الحاجة إليها.
  4. كرر الخطوة 6،1-6،3 لأي النوافذ متعلق بالصرف المالي إضافية بما في ذلك مراقبة إيجابية و / أو سلبية.
  5. حساب متوسط كفاءة التحويل لكل نوع القطاع لكل الجينات أو مروج للاهتمام والضوابط بشكل منفصل عن طريق قسمة إجمالي عدد القطاعات على العدد الكلي من 1 سم 2 ويندوز متعلق بالصرف المالي لاحتساب متوسط عدد تحول الأحداث في سم 2 من غشاء أحادي الخلية تلقيح (ATScm -2).
  6. انتقل إلى الخطوة 7.2 و 8 لتحليل أنماط التعبير المروج وخطوة 7.1، 7.2 أو 7.3 لتقنيات لتقييم الخلايا والأنسجة التشكل في أنسجة متعلق بالصرف المالي.

7. تحليلالخلايا والأنسجة الصرف في الأنسجة متعلق بالصرف المالي

ملاحظة: فيما يلي مجموعة من التقنيات التي استخدمت بنجاح لتحليل ISSA المستمدة العينات.

  1. تحليل منطقة الخشب خلية، منطقة التجويف، وسمك جدار الخلية ومنطقة جدار الخلية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM).
    ملاحظة: هذا البروتوكول يتطلب إعداد عينة الحد الأدنى ويسمح للإنتاجية عالية نسبيا من تحليل القطاع فيما يتعلق الصفات المورفولوجية المبين.
    1. من هذه الخطوة فصاعدا يرجى التأكد معطف المختبر، وحماية العين وتستخدم قفازات كلما يتم التعامل مع الأنسجة الخشبية وعلاجها.
    2. تحديد القطاع متعلق بالصرف المالي للتحليل وإجراء شق ما يقرب من 0.5 ملم إلى جانبي باستخدام واحدة حافة شفرة حلاقة لإنشاء قرص (الشكل 2A).
    3. تقليم قبالة النسيج الخشب الزائدة وترك حوالي 1 ملم من أنسجة الخشب إلى الجانب عرضية من القطاع (الشكل 2B).
    4. حذرقطع لاي بالعرض من خلال وسط القطاع باستخدام حافة مزدوجة شفرة حلاقة جديدة (الشكل 2C).
    5. جعل اثنين من الشقوق شعاعي الضحلة إضافية على متن الطائرة عرضية جانبي القطاع لترسيم الأنسجة المعدلة وراثيا (الشكل 2D). كما والمكتب المركزي للاحصاءات تلطيخ لا تخترق عمق الأنسجة متابعة على طول الملفات شعاعي من الخلايا لجانبي النسيج الملون وجدت على سطح متعلق بالصرف المالي.
    6. نعلق على استعداد وجه قطاع متعلق بالصرف المالي يصل إلى مرحلة من مراحل دبوس كعب SEM جبل باستخدام SEM شريط موصل (2E الشكل) ونضع في المجفف لحين الحاجة إليها لوزارة شؤون المرأة التصور.
    7. كرر الخطوات من 7.1.2 إلى 7.1.6 عن أي قطاعات إضافية بما في ذلك من سيطرة سلبية.
    8. باستخدام ووزارة شؤون المرأة في وضع فراغ منخفض (الطاقة 5 كيلو فولت، بقعة 3.0 نانومتر)، تصور والتقاط الصور من الخلايا / الأنسجة داخل القطاع وكذلك الخلايا / الأنسجة المجاورة مباشرة للقطاع (الشكل 2F). كمية من التكبيرتعتمد على الميزات المثيرة للاهتمام. للألياف الخشب، 2،000X مناسبة (الشكل 2G).
    9. مرة واحدة وقد تم تصور قطاع متعلق بالصرف المالي والصور التي التقطت في أحد التكبير المناسب، وقياس الخشب خلية / الأنسجة الصفات المورفولوجية الاهتمام باستخدام صورة البرنامج قياس.
    10. للتحليل الإحصائي، وإجراء زوجيا عدة تحليلات باستخدام يقترن تي اختبارات لمقارنة الفرق بين الصرفية قياس في قطاع المعدلة وراثيا والمجاورة غير المعدلة وراثيا الخلايا السيطرة / الأنسجة (قياس تقع ضمن نطاق 0.5 ملم من حافة القطاع) لكل قطاع لتحديد ص -القيمة.
    11. كرر الخطوة 7.1.10 لمراقبة سلبية.
      1. في الحالات التي تظهر مراقبة إيجابية على القيمة الاحتمالية المنخفضة (α <0.05)، وحساب الفرق بين راثيا والمجاورة الخلايا غير المعدلة وراثيا / الأنسجة لسمة شكلية. استخدام هذا "الفرق قيمة 'في أونبايريد اختبار t لمقارنة تأثير الجينات في المصالح مع negatإيف التحكم لتحديد القيمة ص.
  2. تحليل النسيجية من الخلايا متعلق بالصرف المالي / التشكل الأنسجة أو التعبير المروج الأنماط في الخلايا الجذعية / الأنسجة باستخدام المجهر الضوئي.
    ملاحظة: في حين أن أكثر من مضيعة للوقت، هذا الأسلوب يسمح لمزيد من الخيارات بما في ذلك الجوانب تحليل ديناميات متعلق بالصرف المالي، على سبيل المثال، عرض متعلق بالصرف المالي فضلا عن أنماط التعبير المروج. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان غير قادر على الوصول إلى SEM، هذا البروتوكول يمكن استخدامها كبديل للخطوة 7.1.
    1. قطاع الإنتاج ذات الاهتمام باستخدام شفرة حلاقة وبعض الأنسجة المحيطة بها كتل صغيرة (لا يزيد عن 1 مم 3) ومكان مباشرة في 1-3 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ في قارورة العينة مع غطاء المسمار لا يقل عن 2 أيام في 4 درجات مئوية على شاكر. إعداد كتلة صغيرة في وسيلة من شأنها أن تسمح للسطح من الفائدة يمكن الوصول إليها من قبل مشراح.
    2. كرر لأي قطاعات إضافية بما في ذلك من سيطرة سلبية.
    3. إزالة السائل واستبدالها مع 25٪ من الإيثانول: 75٪ LR خليط البيض لمدة 2 أيام الحفاظ على ظروف.
    4. كرر الخطوة 7.2.3 مع 50٪ من الإيثانول: 50٪ LR أبيض، 25٪ من الإيثانول: 75٪ LR الأبيض ثم أخيرا مرتين مع 100٪ LR الأبيض.
    5. وضع كتلة صغيرة في تضمين القالب مع سطح الفائدة الانحياز إلى نهاية قصيرة، وتغطي بعناية مع LR الأبيض النقي وبلمرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    6. قطع 5 ميكرون المقاطع من سطح الفائدة على مشراح الدوارة وجبل على شريحة زجاجية. استخدام سفرانين O (0.01٪) تلطيخ لتصور جدار الخلية و / أو غيرها من الميزات.
    7. إضافة وسائط تصاعد، ضع زلة غطاء والسماح لضبط بين عشية وضحاها.
    8. عرض تحت المجهر الخفيفة بين 100X و600X التكبير والتقاط الصور.
    9. القبض على الصفات المورفولوجية من الصور باستخدام برنامج صورة القياس.
      1. للتحليل الإحصائي من الصفات المورفولوجية الكمية، اتبع على من الخطوة 7.1.10.
      2. للتحليل النوعي من الصفات المورفولوجية،مقارنة ووصف أنماط لوحظت في الجينات أو مروج للاهتمام والسلبية و / أو مراقبة إيجابية.
  3. تحليل لييف مكروي زاوية (MFA) في ألياف المنقوع باستخدام المجهر الضوئي.
    1. المكوس المعدلة وراثيا الخشب الأنسجة مباشرة من القطاع وكذلك من الأنسجة غير المعدلة وراثيا المتاخمة لها (تقع ضمن نطاق 0.5 مم، الشكل 2H) ومكان في منفصلة 1.5 مل أنابيب. كرر لأي قطاعات إضافية بما في ذلك من سيطرة سلبية.
    2. أكمل الخطوات 7.3.3 إلى 7.3.5 في غطاء الدخان.
    3. إضافة 250 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين و 250 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي إلى كل أنبوب.
    4. وضع أنبوب في كتلة الحرارة عند 90 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في غطاء الدخان.
    5. إزالة الأنسجة من أنابيب وشطف بعناية بالماء المقطر مرتين على الأقل.
    6. استخدام المياه وسائل الإعلام تصاعد القابلة للذوبان، جبل الأنسجة على شريحة زجاجية وندف بعيدا مع ملقط حادة قبل الالصاق زلة غطاء.
    7. رأيتحت ضوء المجهر والتقاط الصور من الألياف الفردية في تضخم أكبر من 400X.
    8. لتحديد زاوية لييف مكروي من الألياف، وقياس الزاوية بين فتحات حفرة و / أو التصدعات جدار الخلية ومحور طويل من الألياف (الشكل 2I) باستخدام صورة البرنامج قياس.
    9. للتحليل الإحصائي، اتبع على من الخطوة 7.1.10.

8. تحليل المروج أنماط التعبير

  1. تحليل أنماط التعبير المروج في الأنسجة الجذعية الثانوية.
    1. نحسب ما تردد من كل نوع القطاع لمروج للاهتمام، فضلا عن الضوابط الإيجابية والسلبية كما لوحظ في الخطوة 6.2.2.
    2. مقارنة تردد من أنواع مختلفة لقطاع المروج في المصالح مع مراقبة إيجابية باستخدام اختبارات تشي مربع لإقامة ف القيم. مزيد من التحليل للخصوصية خلية / الأنسجة يمكن القيام باستخدام الخطوة 7.2 كما هو مطلوب.
      1. إذا المروج أكثر من واحدمن مصلحة يجري التحقيق ثم كرر هذه المقارنة صنع التحليل بين جميع المروجين للاهتمام ومراقبة إيجابية.
      2. إذا لوحظ القطاعات أو تلطيخ الأزرق في السيطرة السلبية ثم يضاف هذا إلى تحليل أو التخلي عن هذا يتوقف على مدى أو إذا اشتبه تلطيخ الذاتية (انظر مناقشة).
  2. تحليل أنماط التعبير المروج خلال متعلق بالصرف المالي التنمية المشتقة والتمايز.
    1. باستخدام مجهر تشريح، تصور كل القطاعات متعلق بالصرف المالي (الشكل 1G، 1H، 1I) التي تم تحديدها في الخطوة 6.2 وتحديد وجود / غياب تلطيخ الأزرق في ثلاثة أنواع الأنسجة المستمدة من طبقة الكامبيوم. اللحاء (P)، ووضع الخشب (X1) أو وضعت أنسجة الخشب (X2) (انظر الشكل 3A).
    2. كما في الخطوة 8.1.2، مقارنة تردد من وجود / غياب المكتب المركزي للاحصاءات تلطيخ في مناطق P، X1 و X2 من المروج من كثافة العملياتerest مع مراقبة إيجابية باستخدام اختبارات تشي مربع لإقامة ف القيم. مزيد من التحليل للخصوصية خلية / الأنسجة يمكن القيام باستخدام الخطوة 7.2 كما هو مطلوب.
      1. نرى خطوات 8.1.2.1 و8.1.2.2 لاعتبارات إضافية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام هذا البروتوكول وقد ثبت عن الخلايا الجذعية والأنسجة أنواع الثانوية الحية لتكون عرضة للA. المورمة التحولات وتم تعريفها في أنواع القطاع استنادا إلى نوع من الخلايا تحولت في البداية، وأنه لاحق نمط النمو التنموي. وتشمل أنواع قطاع محيط بالأدمة، اللحاء، متعلق بالصرف المالي، حمة الجروح وtylose (الشكل 1B، 1C، 1D) ويمكن العثور عليها في مواقع متسقة تصف في ما تبقى من هذه الفقرة. ويتكون قطاع محيط بالأدمة من مجموعة من الخلايا تحولت ينحصر وجودها في محيط بالأدمة وأبدا تمتد إلى اللحاء (الشكل 1E). ويمكن الاطلاع على قطاع اللحاء في مواقع مختلفة بين طبقة التفجير ومحيط بالأدمة، ومع ذلك، لم تمتد إلى هذه الأنسجة المحيطة بها (الشكل 1F). ويتكون قطاع متعلق بالصرف المالي للأنسجة الخشب / طبقة الكامبيوم / اللحاء تحولت المستمدة من ترانيمكن أن يحدث sformation من الأولي متعلق بالصرف المالي وفي ثلاثة أنماط مختلفة: ط) "الكامل" قطاع متعلق بالصرف المالي، حولت خلايا الخشب / متعلق بالصرف المالي / اللحاء تمتد من حدود أنسجة الجرح حمة من خلال منطقة الخشب ومتعلق بالصرف المالي للأنسجة اللحاء تحتوي على كل من راي و الخلايا المغزلية أو عناصر راي فقط (الشكل 1G)، والثاني) "فقدت الأولي" قطاع متعلق بالصرف المالي، وهو البديل للقطاع متعلق بالصرف المالي الكامل حيث قد فقدت أولي من الطبقة شروع ترك الخشب معكوسة والقطاعات اللحاء وطبقة المبادر هو دون تغيير (الشكل 1H)، والثالث) "الخشب فقط" قطاع متعلق بالصرف المالي، تحول الأنسجة الخشب تمتد من حدود أنسجة الجرح حمة لأطوال مختلفة في الأنسجة xylogenic تشكلت حديثا ولكنها لم تصل إلى طبقة المبادر (الشكل 1I). والقطاع الجرح حمة يحتوي على تحويل خلايا حمة الجرح وجدت إما خلية أو مجموعة من الخلايا الفردية، وغالبا في سن الفيل شعاعيوفاق، وتقع بين الخشب الموجودة مسبقا والتي شكلت حديثا الأنسجة الخشب (الشكل 1J). قطاع tylose تتألف من tyloses سفينة تحولت وجدت داخل الخشب الموجودة مسبقا (الشكل 1K).

يتم تقديم البيانات كفاءة التحول تمثيلية لكل من الجينات ومروج للدراسات الفائدة وكذلك الضوابط الإيجابية في الجدول 1 والجدول 2. وقد تم وضع بيانات تجربتين كبيرتين أجريت في نفس الفترة الزمنية (ديسمبر-أبريل) في نفس المورثات من الكافور وشجر الحور في عامين متتاليين تشمل عددا من الجينات تشكيل الخشب والمروجين للاهتمام. التركيز على الضوابط الإيجابية من المروج للدراسات الفائدة (الجدول 2)، ونوع الأنسجة أكثر عرضة للA. نقل المورمة T-DNA هو الأنسجة متعلق بالصرف المالي مع ما يقرب من 60٪ و 40٪ من القطاعات المحددة في يوكاليبتوس والحور على التوالييجري القطاعات متعلق بالصرف المالي. في يوكاليبتوس، هو الجرح القادم نوع القطاع الأكثر وفرة حمة في 35٪ في حين أن أنواع القطاعات الأخرى كافة القيم ATScm -2 أقل من 5٪. في الحور، هو الجرح القادم نوع القطاع الأكثر وفرة حمة بنسبة 20٪ تليها اللحاء بنسبة 15٪ في حين تم العثور على بقية أنواع القطاع على تردد أقل من 5٪. ارتفاع احتمالات العثور على القطاع في إطار متعلق بالصرف المالي فضلا عن أعداد أكبر من القطاعات متعلق بالصرف المالي التي تم تحديدها نموذجي حيث يتم استخدام بروتوكول قشر اللحاء (الجدول رقم 1، خطوة 5.2.1) ويرجع ذلك إلى القدرة على تلطيخ وإمكانية لتصور المنطقة بأكملها من طبقة الكامبيوم.

خلال تطوير هذه البروتوكولات تم بحث عدد من المتغيرات كجزء من التجارب بروتوكول الأمثل. وشملت هذه تركيز البكتيريا في التلقيح وسائل الإعلام ونوع الوسائط المستخدمة في التلقيح وسائل الإعلام، إضافة إلى Acetosyringone التلقيح وسائل الإعلام، عمر الأنسجة و A. سلالة المورمة وكذلك وقت التلقيح وراثى. وتقدم قطاع متعلق بالصرف المالي ATScm -2 البيانات من هذه التجارب في الجدول 3 والجدول 4. معظم المتغيرات التحقيق، عندما تتغير يؤدي إلى تغيرات في متعلق بالصرف المالي ATScm -2 في كل من الأنواع، وشملت على وجه الخصوص زيادة تركيز البكتيريا في التلقيح وسائل الإعلام، واستخدام MS في وسائل الإعلام التلقيح واختيار أ. المورمة سلالة. وبالإضافة إلى ذلك، وقت التلقيح وشجرة راثى أظهرت اختلافات كبيرة في يوكاليبتوس مع التطعيمات في أوائل الصيف تظهر أعلى ATScm -2 في حين أظهر استنساخ الكافور SG21 وSG44 أعلى متعلق بالصرف المالي ATScm -2، 41.6 و 40.4، مقارنة التوالي للآخرين في جميع أشهر مجتمعة.

متوسط ​​حجم قطاع متعلق بالصرف المالي يختلف ويعتمد على مقدار نموها عرضية والشعاعية في إطار متعلق بالصرف المالي. في فرعي واحدعينة من 53 قطاعات في الحور، ونمت ما يقرب من 4 أشهر، وعرض عرضية من القطاعات على طبقة الكامبيوم يتراوح بين 0.09 و 0.58 ملم بمعدل 0.27 مم في حين أن النمو شعاعي عبر النوافذ متعلق بالصرف المالي تراوحت 0،7-2،2 مم بمتوسط ​​1.35 مم. عند الجمع، هذه المقدمة بين 0.063 مم 2 و 1.276 ملم 2 من الأنسجة المعدلة وراثيا لتحليلها. في عينة فرعية أخرى من 188 القطاعات في نفس النوع، حيث لوحظ بين 1.5-4 ملم من النمو شعاعي عبر نافذة متعلق بالصرف المالي على مدى ما يقرب من 5 أشهر، وكان متوسط وزن القطاع 72 ميكروغرام (الجدول 5).

وقد تبين أن كمية الأنسجة المعدلة وراثيا التي أنشئت لتوفير خلايا كافية و / أو الأنسجة لإجراء قياسات المورفولوجية وكذلك لدراسة نشاط المروج. على سبيل المثال، وتأثير ثلاثة الأوكالبتوس جرانديز إف إل أي إس على عدد من الألياف الخشب الصفات المورفولوجية 9 كان سابقا plored في استنساخ الكافور وكشف الأدوار الممكنة لEgrFLA2 في تقرير وزارة الخارجية وEgrFLA1 في تحديد حجم الخلية (الجدول 6). وبالإضافة إلى ذلك، وأنماط التعبير من شجرة الكينا جرانديز المروج CESA الجينات في الخشب تطوير (X1)، الخشب وضعت (X2) واللحاء (P) الأنسجة 10 تحديد أنماط التعبير تختلف اختلافا كبيرا بين EgrCESA1، 2، 3، وEgrCESA4 و 5 و 7 في الكافور ينبع. في هذا التحليل، EgrCESA1، 2، عرضت 3 أن يتم التعبير عنها في المقام الأول في تطوير أنسجة الخشب في حين، عرضت EgrCESA4، 5 7 أن يتم التعبير عنها في كل من الخشب تطوير والنسيج اللحاء (الشكل 3B، الجدول 7). أظهر جميع المروجين EgrCESA أنماط التعبير المختلفة إلى حد كبير في السيطرة الايجابية (CAMV35S المروج) (جدول رقم 7).

4553 / 54553fig1.jpg "/>
الشكل 1: القطاعات المعدلة وراثيا أنواع (أ) القطاعات متعلق بالصرف المالي كما تراه على سطح الخشب تتعرض بعد معالجة باستخدام بروتوكول قشر اللحاء (الخطوة 5.2.1). أقراص تظهر مجموعة من أنواع القطاع على سطح عرضية من الحور في (ب) و الكافور (ج) ينبع بعد معالجة باستخدام مستعرض بروتوكول قطع (الخطوة 5.2.2). (د) رسم تخطيطي لمجموعة من أنواع قطاع جدت في مصنع ينبع. أمثلة من قطاع محيط بالأدمة (ه) والقطاع (و) اللحاء، 'الكامل' قطاع متعلق بالصرف المالي (ز)، "فقدت الأولي" قطاع متعلق بالصرف المالي (ح)، 'الخشب فقط "قطاع متعلق بالصرف المالي (ط)، الجرح قطاع حمة (ي) و قطاع tylose (ك) في الحور. وتشير السهام السوداء حيث تقع القطاع أصغر الحجم. جميع الحانات نطاق = 1 مم.ديزيل / ftp_upload / 54553 / 54553fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: إعداد القطاعات متعلق بالصرف المالي للتحليل الصرفي باستخدام ووزارة شؤون المرأة والمجهر الضوئي (أ) الختان من قطاع القرص يحتوي على. (ب) قلصت القرص لإزالة الأنسجة الزائدة. قطع طريق سطح عرضية من القطاع المعدلة وراثيا (ج). (د) مقدمة من اثنين من التخفيضات شعاعي للمساعدة في تحديد مكان وجود أنسجة معدلة وراثيا تحت SEM. (ه) الأنسجة التي شنت على دبوس SEM باستخدام شريط موصل. (و) تصوير من منطقة المعدلة وراثيا والأنسجة غير المعدلة وراثيا التي ينبغي تصويرها لتحليلها. (ز) صورة نموذجية للخلايا ألياف الخشب وراي القبض على 2،000X التكبير. (ح (ط) الألياف متآكلة ينظر تحت المجهر الضوئي تصور زاوية الحفر و / أو التصدعات جدار الخلية والمحور الطويل للخلية. يشير السهم الأسود حفرة الفتحة. الحانات النطاق = بالعربية، ح = 1 ملم، ز، ط = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: تحليل ونتائج الجينات أنماط التعبير المروج المشتقات متعلق بالصرف المالي (أ) تصوير للP (اللحاء)، X1 (الخشب النامية)، وX2 (الخشب المتقدمة) المناطق. (ب) نتائج تشير إلى نسبة P، X1 و X2 تلطيخ في القطاعات متعلق بالصرف المالي من محاكمة التي تتضمن مجموعة من CESA الأوكالبتوس جرانديز تتحول إلى ينبع الهجينة الكافور. البيانات الواردة من Creux وآخرون. 10. n = عدد من القطاعات تقييمها. شريط مقياس = 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أنواع الأشجار نوع ناقل عدد من الجينات ذات الاهتمام تستخدم إجمالي عدد الإطارات التي تم إنشاؤها عدد من النوافذ حيث تم تحديد القطاع (٪) متعلق بالصرف المالي ATScm -2 متعلق بالصرف المالي (في ويندوز حيث تم التعرف على القطاع)
الهجينة شجرة الكينا كرية س البان (ما مجموعه ثلاثة استنساخ) تحكم الإيجابي (جينات الفائدة) 1 (المكتب المركزي للاحصاءات فقط) 96 97٪ 45.1 (1.5)
جينات الفائدة 20 630 92٪ 46.1 (2.2)
حور أبيض "الهرمي" تحكم إيجابي (الجينات من الفائدة) 1 (المكتب المركزي للاحصاءات فقط) 110 74٪ 10.8 (1.5)
جينات الفائدة 20 700 81٪ 14.6 (0.8)

الجدول 1: نموذجي متعلق بالصرف المالي ATScm -2 للسيطرة الإيجابية وجينات الفائدة كانت مصدرها أرقام من الدراسات التي أجريت على مدى سنتين متتاليتين في نفس الكافور واستنساخ الحور باستخدام مجموعة من الجينات واللحاء بروتوكول حصاد قشر (الخطوة 5.2. 1). قيم الخطأ القياسية بين قوسين. </ P>

<td> 1 (المكتب المركزي للاحصاءات فقط)
أنواع الأشجار نوع ناقل عدد المروج / الجينات إجمالي عدد الإطارات التي تم إنشاؤها عدد من النوافذ حيث تم تحديد القطاع (٪) ATScm -2 جميع القطاعات ATScm -2 محيط بالأدمة ATScm -2 اللحاء ATScm -2 متعلق بالصرف المالي ATScm -2 الجرح حمة ATScm -2 Tylose
شجرة الكينا كرية س camal-
الهجينة dulensis (ما مجموعه ثلاثة استنساخ) 		تحكم إيجابي 118 63٪ 25.74 (2.35) 0.24 (0.07) 0.89 (0.19) 15.7 (1.71) 8.84 (1.4) 0.07 (0.03)
المروجين الاهتمام 28 1050 31٪ 14.67 (1.77) 0.02 (0.01) 0.05 (0.01) 13.79 (1.75) 0.78 (0.21) 0.03 (0.01)
حور أبيض "الهرمي" تحكم إيجابي 1 (المكتب المركزي للاحصاءات فقط) 110 54٪ 12.37 (1.77) 0.22 (0.07) 1.85 (0.29) 5.07 (0.6) 2.78 (0.75) 0.29 (0.53)
المروجين الاهتمام 28 990 26٪ 8.28 (1.18) 0.16 (0.04) 0.9 (0.09) 6.67 (1.16) 0.27 (0.07) 0.28 (0.11)

تم مصدرها قطاع نموذجي ATScm -2 للسيطرة الإيجابية والمروجين لمصلحة شخصيات من الدراسات التي أجريت على مدى سنتين متتاليتين في نفس الكافور واستنساخ الحور باستخدام مجموعة من تسلسل المروج وبروتوكول حصاد القرص (الخطوة 5.2: الجدول 2. 2). وقد استمدت القيم ATScm -2 من النوافذ حيث تم التعرف على القطاع فقط. قيم الخطأ القياسية بين قوسين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

نوع التجربة العلاج الوصف عدد من النوافذ في العلاج -2
اليوكاليبتوس الكروي تركيز نوع A. tumefaciens في التلقيح وسائل الإعلام معلق في 25 مل MS 10 1.4 (0.62)
معلق في 5 مل MS 10 1.6 (0.72)
معلق في 1 مل MS (مراقبة) 10 2.4 (1.16)
نوع وسائل الإعلام في التلقيح وسائل الإعلام رطل 10 0.4 (0.22)
MS (مراقبة) 10 2.4 (1.16)
إضافة Acetosyringone إلى تلقيح وسائل الإعلام مع Acetosyringone 11 0.9 (0.37)
دون Acetosyringone (مراقبة) 11 0.6 (0.64)
العمر من الأنسجة الجذعية تلقيح 6 أشهر (كنترولل) 11 1.1 (0.66)
18 شهرا 11 1.8 (0.95)
A. المورمة سلالة AGL1 (مراقبة) 18 0 (0)
C58 18 0.1 (0.1)
LBA4404 18 0.6 (0.4)
حور أبيض "الهرمي" تركيز نوع A. tumefaciens في وسائل الإعلام معلق في 25 مل MS 10 2.2 (0.55)
معلق في 5 مل MS 10 2.7 (0.63)
معلق في 1 مل MS (مراقبة) 10 5.1 (1.58)
نوع الوسائط المستخدمة للتلقيح الجذعية رطل 10 2.8 (0.71)
MS (مراقبة) 10 5.1 (1.58)
إضافة Acetosyringone إلى تلقيح وسائل الإعلام مع Acetosyringone 11 0.3 (0.14)
دون Acetosyringone (مراقبة) 11 0.5 (0.25)
العمر من الأنسجة الجذعية تلقيح 6 أشهر (مراقبة) 11 1.5 (0.33)
18 شهرا 11 1.5 (0.63)
A. المورمة سلالة AGL1 (مراقبة) 20 8.1 (2)
C58 20 12.5 (2)
LBA4404 20 11.1 (2)

الجدول 3: متعلق بالصرف المالي ATScm -2 القيم لمجموعة من المتغيرات التحقيق كجزء من مسارات الأمثل بروتوكولوقد تم التحقيق المتغيرات. في استنساخ الحور ومجموعة من كرية الأفراد الأوكالبتوس عبر عدد من السنوات مع متعلق بالصرف المالي ATScm -2 البيانات المقدمة. تم حصاد النوافذ متعلق بالصرف المالي باستخدام بروتوكول حصاد القرص (الخطوة 5.2.2). قيم الخطأ القياسية بين قوسين.

شجرة الكينا كرية س معرف البان استنساخ عدد من النوافذ متعلق بالصرف المالي عن كل شهر متعلق بالصرف المالي ATScm -2 أواخر الربيع الثاني (نوفمبر) التلقيح متعلق بالصرف المالي ATScm -2 المبكر الصيف (ديسمبر) التلقيح متعلق بالصرف المالي ATScm -2 منتصف الصيف (يناير) التلقيح متعلق بالصرف المالي ATScm -2 أواخر الصيف (فبراير) التلقيح متعلق بالصرف المالي ATScm -2 الخريف المبكر (مارس)تلقيح متعلق بالصرف المالي ATScm -2 كل الشهور جنبا إلى جنب
SG5 10 15.7 (7.8) 50.7 (13.7) 10.5 (5.1) 30.7 (4.4) 16.8 (6.3) 24.9 (4.3)
SG6 10 6.1 (3.1) 38.5 (15.1) 4.5 (1.7) 14.5 (3.3) 27.6 (8.4) 18.3 (4)
SG13 10 28.4 (6.7) 41.8 (9.1) 16.1 (7) 29.3 (5.2) 19.8 (4.3) 27.1 (3.1)
SG18 10 6.7 (2.9) 18.3 (6.7) 17.4 (3.4) 19.2 (6.1) 18.1 (6.3) 15.5 (2.4)
SG21 10 38.7 (14.3) 77 (17.5) 23.9 (5.7) 27.5 (6.9) 40.7 (13.5) 41.6 (6)
SG35 10 23.5 (10.2) 42.8 (12.2) 7.6 (2.5) 17.6 (4.3) 31.3 (4.6) 24.6 (3.8)
SG37 10 19.7 (8) 55.2 (14.5) 7.4 (1.8) 35 (10.4) 15.9 (4.5) 26.6 (3.8)
SG39 10 12.5 (2.4) 23.6 (6.3) 6.9 (3) 26.3 (8.1) 7.3 (2.3) 15.5 (2.6)
SG40 10 24.8 (11) 24.5 (6.8) 14 (5.6) 35.6 (6.1) 19.9 (4.2) 23.8 (3.2)
SG44 10 22.3 (3.4) 63 (29.3) 9.8 (2.6) 52.5 (10.3) 54.3 (15) 40.4 (7.4)
SG46 10 15.3 (5.2) د> 63.9 (20.1) 23.6 (4) 22.5 (4.8) 17.4 (4.9) 28.5 (5.1)
شهريا متعلق بالصرف المالي ATScm -2 19.9 (5) 45.3 (9.1) 12.6 (2.8) 27.8 (4.5) 24 (5.1)

أدخلت تأثير النمط الجيني ووقت التلقيح على متعلق بالصرف المالي ATScm -2 في استنساخ الكافور عشرة النوافذ في كل شهر خلال موسم النمو إلى 10 مختلفة استنساخ الأوكالبتوس كرية س البان التي كانت كلها تحصد مايو: الجدول 4. وتقدم البيانات الشهرية لكل الوراثي بمتوسط شهري وراثية ATScm عموما -2 قدمت أيضا. تم حصاد النوافذ متعلق بالصرف المالي باستخدام اللحاء بروتوكول حصاد قشر (الخطوة 5.2.1). قيم الخطأ القياسية بين قوسين.وفاق / ftp_upload / 54553 / 54553tbl4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

عدد النباتات عدد من القطاعات متعلق بالصرف المالي يستأصل الكتلة الإجمالية لجميع القطاعات (ميكروغرام) متوسط كتلة من القطاعات (ميكروغرام)
1 11 750 68
2 19 1460 77
3 21 160 8
4 26 4460 172
5 15 1320 88
6 22 2490 113
7 19 1720 91
8 30 830 28
9 25 360 14
مجموع 188 13550 72

وقد تم التحقيق كتلة النموذجية لقطاع متعلق بالصرف المالي 45 النوافذ عبر تسع محطات في الحور لتحديد متوسط كتلة القطاع وتحصد باستخدام بروتوكول حصاد القرص (الخطوة 5.2.2): الجدول 5. كانت تزرع النباتات لمدة 5 أشهر، وكان نمو شعاعي عبر نافذة متعلق بالصرف المالي بين 1-4 ملم.

يتحول-
سمة ological 		المكتب المركزي للاحصاءات فقط (مراقبة إيجابية) الأنسجة غير المعدلة وراثيا (المكتب المركزي للاحصاءات فقط) ف قيمة الجين من الفائدة 1 (FLA1) الأنسجة غير المعدلة وراثيا (FLA1) ف قيمة الجين من الفائدة 2 (FLA2) الأنسجة غير المعدلة وراثيا (FLA2) ف قيمة الجين من الفائدة 3 (FLA3) الأنسجة غير المعدلة وراثيا (FLA3) ف قيمة
متوسط جدار الخلية سمك (ميكرون) * 1.81 (0.1) 1.65 (0.1) 0.2692 1.47 (0.14) 1.55 (0.12) 0.6403 1.65 (0.13) 1.78 (0.13) 0.4839 1.59 (0.12) 1.63 (0.11) 0.8254
منطقة حائط متوسط الخليوي (ميكرون 2) * 69.1 (4.74) 60.7 (2.03) 0.1229 64.1 (15.68) 59.9 (9.79) 0.5004 61.6 (3.4) 65 (3.96) 0.5182 61.9 (3.56) 61.5 (3.16) 0.9438
المساحة متوسط الخليوي (ميكرون 2) * 115.9 (11.01) 99.9 (5.1) 0.2041 124.4 (6.1) 108 (4.36) 0.0445 110.8 (8.45) 111.3 (9.06) 0.9671 108.5 (4.43) 103 (3.07) 0.3204
متوسط منطقة التجويف (ميكرون 2) * 46.9 (7.55) 39.2 (4.89) 0.407 60.2 (5.28) 48.1 (4.46) 0.0991 49.2 (7.56) 46.3 (7.5) 0.7882 46.6 (3.31) 41.5 (3.9) 0.3264
متوسط ييف مكروي زاوية (O) # 24.3 (0.75) 24.2 (0.45) 0.8648 22.3 (0.82) 22.7 (0.7) 0.5664 23.7 (0.55) 26.6 (0.5) 0.0001 26 (0.88) 27.2 (0.72) 0.0903

الجدول 6: القياسات ISSA الألياف التشكل مستمدة من الجينات في دراسة الفائدة مقارنة بين جدار الخلية الألياف، حجم الخلية والقياسات وزارة الخارجية اتخذت من الألياف المعدلة وراثيا مصدرها الأوكالبتوس استنساخ كرية س البان ينبع تحولت مع الأوكالبتوس جرانديز إف إل أي إس (EgrFLA1، 2، 3) و السيطرة الايجابية (المكتب المركزي للاحصاءات فقط) مع الألياف السيطرة المعدلة وراثيا غير المجاورة. البيانات الواردة من ماكميلان وآخرون. 9. * يشير شملت محاكمة قياس 10 الألياف في القطاع 10 (TOTآل من 100 الألياف). # يشير شملت محاكمة قياس 5 الألياف في 20 قطاعا (ما مجموعه 100 الألياف). α <0.05 هو مبين في جريئة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

د> 11.05
EgCESA1 EgCESA2 EgCESA3 EgCESA4 EgCESA5 EgCESA7 المكتب المركزي للاحصاءات فقط (مراقبة إيجابية)
EgrCESA1 0،708 2،839 8،856 9،976 9.18 29،165
EgrCESA2 1.11 12،008 11،363 30،234
EgrCESA3 15،151 16،123 15،488 37،791
EgrCESA4 4،852 0.108 46،858
EgrCESA5 3.275 11،278
EgrCESA7 36،082
المكتب المركزي للاحصاءات فقط (مراقبة إيجابية)

ف together.within الصفحات = "1"> الجدول 7: تشي 2 القيم المستمدة من المقارنة بين أنماط التعبير المروج في المشتقات متعلق بالصرف المالي تشي 2 تحليلا مقارنا لحضور / غياب المكتب المركزي للاحصاءات في تلطيخ P، X1 و X2 المنطقة المشتقات متعلق بالصرف المالي. بين ستة الأوكالبتوس جرانديز CESA المروجين الجين تسلسل (EgrCESA 1، 2، 3، 4، 5، 7) والسيطرة الايجابية (المكتب المركزي للاحصاءات فقط). البيانات الواردة من Creux وآخرون. 10. α <0.05 هو مبين في تسطير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول ISSA هي طريقة بسيطة وفعالة نسبيا لخلق أنسجة الجذعية المعدلة وراثيا في أنواع الأشجار في غضون بضعة أشهر لتحليل الجينات والمروجين للاهتمام المشاركين في الخشب وتنبع تشكيل. القليل من الجهد، وراء حفظ النباتات على قيد الحياة، وذلك لزراعة الأنسجة الجذعية المعدلة وراثيا بعد التلقيح التي تقف على النقيض من الأساليب في المختبر حيث يتطلب زراعة واسعة للحفاظ على الأنسجة أو النباتات، حيث يمكن إنتاج الأخشاب يستغرق فترة تصل الى سنوات لبدء أو حيث حقيقي لم يتم إنشاء الجذعية الثانوي 1. وقد تبين أيضا ISSA قابلة للتطبيق على نطاق واسع من أنواع الأشجار، بما في ذلك الأنواع في جنس من حور، الكافور والصنوبر 6 وكذلك أكاسيا وCorymbia (لا تظهر البيانات) حيث القليل جدا، إن وجدت، مطلوب الأمثل ل استخلاص الأنسجة المعدلة وراثيا. باستخدام هذه الطريقة، ولذلك فمن الممكن للتحقيق في عدد سالجينات F أو المروجين للاهتمام في معظم الأنواع من الفائدة. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول يمكن استخدامها بمفردها أو بالاشتراك مع أكثر استخداما في تقنيات المختبر حيث يمكن التحقيق جينات متعددة باستخدام ISSA في المقام الأول إلى تحديد المرشحين المحتملين للمضي قدما إلى المزيد من المشاركة في أساليب المختبر.

توضح الأمثلة وصفت أن القطاعات كافية يمكن إنشاء لإجراء تحليل المصب من سوى عدد قليل من النوافذ متعلق بالصرف المالي المعدلة وراثيا. مع القيم ATScm -2 46.1 في الكافور و 14.6 في الحور النوافذ متعلق بالصرف المالي واحد أو اثنين فقط ستكون كافية للتحقيق في سمة واحدة كما أنه من الممكن لإضافة العديد من النوافذ في ساق نبات واحد أو تكرار في العديد من النباتات. في الممارسة العملية، ومع ذلك، ليس كل النوافذ متعلق بالصرف المالي تؤدي إلى إنشاء قطاع متعلق بالصرف المالي التي يمكن استخدامها (انظر الجدول 1، الجدول 2) ويبلغ حجم القطاعات يمكن أن تختلف، أنها عادة ما تكون صغيرةوفي الحالات يمكن أن يكون موجودا على مقربة من بعضها البعض يحد من استخدامها لتحليل المصب. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الجين قد يؤثر على بقاء الخلية 12 أو غيرها من جوانب التنمية خلية ما قد يؤدي في ظل غياب كامل للقطاعات المعدلة وراثيا لجين معين من الاهتمام. ولذلك فمن المستحسن أن نسعى دائما لعدد أكبر من النوافذ مما قد تكون هناك حاجة للتحليل. وينبغي أن تطبق بحذر مماثل عند استخدام ISSA للدراسات المروج كما يمكن أن يتوقع تقلب كبير مع قليل / ضعيفة أو معدومة التعبير لوحظ في بعض الحالات (الجدول 2). ومع ذلك، فقد تبين أن عددا أصغر من القطاعات، بأقل قدر من 6 إلى استخدامها بنجاح لتحليل 10. وتشير هذه النتائج إلى أن تجارب متواضعة جدا لا تنطوي إلا على عدد قليل من النوافذ يمكن أن يؤدي إلى رؤى كبيرة في وظيفة الجينات ونشاط المروج.

من وجهة نظر التحليل، وعلى مقربة من transgenيوفر جيم وغير المعدلة وراثيا الأنسجة أداة قوية لتحديد الاختلافات صغيرة ولكنها ذات مغزى في الصفات بين الجينات في المصالح. الخلايا والأنسجة عينات المتاخمة مباشرة لبعضها البعض هي من نفس الخلفية الوراثية، وقد تتأثر نفس الظروف البيئية والحد من عدد من المتغيرات المستقلة وتبسيط التحليل الإحصائي المطلوبة. من منظور أخذ العينات، وتحليل الطاقة على ISSA اشتقاق بيانات من تجارب متعددة (على سبيل المثال، الجدول 6)، وقد أظهرت أن عددا أصغر من القياسات في القطاع، على سبيل المثال، جدار الخلية سمك 3-5 خلايا في كل قطاع، وقياس عدد أكبر من القطاعات، على سبيل المثال، 20-25 القطاعات لالجينات في المصالح، وتوفر استراتيجية أكثر كفاءة وقوية إحصائيا أخذ العينات. يمثل كل قطاع حدث التحول مستقلة أو "خط" من الخلايا التي تحتوي على التحليل الإحصائي التي تقوم تحديد تأثير متوسط ​​من أحداث التحول متعددةالتي تنطوي على الجينات في المصالح. وبالمثل، فإن القدرة على تحويل جميع أنسجة الجذعية توفر فرصة لدراسة التعبير عن المروجين للمصالح عبر الجذعية كله، وبشكل أكثر تحديدا خلال تمايز طبقة الكامبيوم. بروتوكولات ISSA الموصوفة هنا توفر خط أنابيب موثوق بها والتحقق من صحتها من خلق نسيج المعدلة وراثيا من خلال لحصاد العينات، وجمع وتحليل البيانات عن الأنسجة ومورفولوجيا الخلايا وأنماط التعبير المروج.

في معظم الحالات، والقطاعات هي نتيجة للتحول من خلية واحدة، والتي من خلال انقسام الخلية قد أدت إلى عدد من الخلايا والأنسجة المشتقة. على سبيل المثال، ينشأ قطاع متعلق بالصرف المالي من التحول من خلية واحدة هذا المنصب الجرح الانتعاش يصبح الأولي متعلق بالصرف المالي والذي بدوره يقسم periclinally وanticlinally لخلق قطاع تمتد على طول الطريق من الجرح الأصلي في اللحاء. في هذه الحالات، واستمر الأولي حولتضمن طبقة الكامبيوم حتى وقت الحصاد ومتغير "الكامل" لوحظ، ومع ذلك، حيث يتم فقدان هذه الأولية من طبقة متعلق بالصرف المالي خلال نمو شعاعي واستبداله ثم غير تتحول الخلية المجاورة من خلال "الخلية الغزو»، وهو ' سوف تفقد الأولي "البديل يكون نتيجة. من أجل ضمان التصنيف الصحيح للأنواع القطاع وللمساعدة في تفسير النتائج فمن المستحسن أن التعريف مع الخصائص التشريحية للاستجابات تنمية الجذعية وجرح الثانوية تكون الشروط الأساسية لتحليل النتائج ISSA. أيضا، ينصح الفحص الدوري للدرجة الحموضة كاشف المكتب المركزي للاحصاءات (راجع الخطوة 5.6). وانخفاض الرقم الهيدروجيني (على سبيل المثال، أقل من 6) يمكن أن يؤدي إلى تفعيل الذاتية β-glucuronidases (المكتب المركزي للاحصاءات) في ساق نبات والتي يمكن إخفاء الحجم الحقيقي لقطاع أو تؤدي إلى التعرف على ايجابيات كاذبة. حيث يشتبه ذلك، فمن المستحسن أن يتم استبعاد هذه العينات من مزيد من التحليل. بروتوكول المكتب المركزي للاحصاءات كاشفتطبق بشكل صحيح في الدراسات المذكورة هنا من أجل التخفيف من حدة المشاكل المحتملة مع نشاط المكتب المركزي للاحصاءات الذاتية تم تكييفها من هوكينز وآخرون (2002) 16 وتستخدم الخطوات الرئيسية إضافية بما في ذلك اثنين يشطف مع العازلة الفوسفات لكي تتوازن عينات لPH7، والمعالجة الحرارية في 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لزعزعة استقرار النشاط المكتب المركزي للاحصاءات الذاتية 17،18. المكتب المركزي للاحصاءات كاشف النفاذية هي أيضا محدودة ومسؤولة عن عدد أقل من القطاعات التي تم تحديدها باستخدام بروتوكول القرص عرضية مقارنة مع بروتوكول قشر اللحاء.

جميع الأنواع محاكمتهم أظهرت أن يكون عرضة للتحول من الأنسجة متعلق بالصرف المالي. ومع ذلك، فقد لوحظت فروق ذات دلالة إحصائية في ATScm -2 الموجودة داخل وبين جنس والأنواع. وبالمثل، فإن سلالة من أ. المورمة والوقت / موسم التلقيح يمكن أن تؤثر ATScm -2. ويقترح أن تجري بعض التجارب الأولية لهذه المتغيرات في SPECIوفاق والمورثات تحت التحقيق قبل اعتماد نطاق أوسع من البروتوكول. نظريا ليس هناك حد لعمر أو حجم ينبع التي ISSA يمكن تطبيقها طالما هناك طبقة الكامبيوم بنشاط متزايد. بتلقيح ومع ذلك، لسهولة التجهيز النهائي من قطاعات الأنسجة المعدلة وراثيا فمن المستحسن ينبع من حوالي 1 سم القطر.

ISSA لا يخلو من حدودها. حجم صغير نسبيا من قطاعات الأنسجة المعدلة وراثيا يحد حاليا طرق phenotyping المصب، وبالتالي سوى عدد محدود من هذه الأساليب التي استخدمت بشكل روتيني حتى الآن. وتتركز هذه الطرق أساسا على التوصيف المورفولوجي على النحو المبين أعلاه، وكذلك تقدير الكمي شبه تكوين السكريات الأحادية في جدار الخلية الثانوي كما ورد في مقدمة 9،11. مع ظهور وصقل تقنيات جديدة لتحليل نطاق جيد من المواد البيولوجية هناك إمكانية أخرى لتطوير phenotyping إضافيةخطوط الأنابيب لقطاعات ISSA، على سبيل المثال في التحليل التركيبي جدار الخلية. ما زال من الصعب، ولكن، لأداء كمي، كل قطاع على حدة، التعبير الجيني وحمض النووي الريبي (RNA) ومقرها البروتين دراسات و / أو تحديد ونشر ISSA المستمدة الخلايا المعدلة وراثيا من خلال المختبر في زراعة للتحليل إضافية بسبب طبيعة المدمرة للفحص المكتب المركزي للاحصاءات . تم محاكمتهم بعض الجينات مراسل الفلورسنت والطباعة الأنسجة لتحديد الحمض النووي الريبي من القطاعات الفردية ولكن حتى الآن لم يتم استخدام هذه الطرق بنجاح لمتوسطة إلى فحص إنتاجية عالية في عملية روتينية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن التقنيات المعدلة وراثيا لا محاكمتهم حتى الآن مثل رني تعقيد التحليل حيث التعبير المكتب المركزي للاحصاءات وأسفل تنظيم الجين المستهدف قد لا يشترك في المعربة.

في حين أن هناك بعض القيود الحالية، إدماج التكنولوجيات الجديدة والناشئة والأساليب التحليلية من المرجح أن التغلب على هذه القيود، ومواصلة تعزيز دور الجمعية الدولية لسا المتوسطة لبروتوكول إنتاجية عالية للتشريح الطبيعة الجزيئية المعقدة للتمايز متعلق بالصرف المالي والتنمية الخشب ووقف تشكيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plants NA NA Please consult local nursery suppliers for plants as needed
Agrobacterium strain NA NA There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region.
Binary vector (gene and promoter) NA NA We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community.
LB media Sigma L3022 The same product could be sourced from another company
LB media with agar Sigma L2897 A like product could be sourced from another company
Antibiotics Sigma NA The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a  range of companies
50 ml Screw top tubes Fisher Scientific 14-432-22 The same product could be sourced from another company
2 ml Microtube Watson Bio Lab 132-620C The same product could be sourced from another company
MS Media Sigma M9274 The same product could be sourced from another company
Scalpel blade no. 11 Sigma S2771 The same product could be sourced from another company
Parafilm "M" Bemis PM996 This is the best product to use to bind the cambial window post creation 
14 ml round bottom tubes Thermo Scientific 150268 The same product could be sourced from another company
EDTA Sigma E6758 The same product could be sourced from another company
Triton Sigma X100 The same product could be sourced from another company
X-Gluc X-GLUC direct You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html
Potassium Ferricyanide(III) Sigma 244023 The same product could be sourced from another company
Potassium Ferrocyanide(II) Sigma P9387 The same product could be sourced from another company
Litmus paper Sigma WHA10360300 The same product could be sourced from another company
Single edge razor blade ProSciTech L055 The same product could be sourced from another company
Double edge razor blade ProSciTech L056 The same product could be sourced from another company
SEM Pin Stub ProSciTech GTP16111 The same product could be sourced from another company
Sample vial with screw cap ProSciTech L6204 The same product could be sourced from another company
Ethanol sigma E7023 The same product could be sourced from another company
LR white ProSciTech C025 The same product could be sourced from another company
Embedding Mould ProSciTech RL090 We recommend this variety, however there are plenty of options available
Water Soulable mounting media ProSciTech IA019 One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored.
Hydrogen peroxide Sigma 216763 A like product could be sourced from another company
Glacial acetic acid Sigma A9967 A like product could be sourced from another company
Safranin O ProSciTech C138 A like product could be sourced from another company
Quanta Environmental Scanning Electron Microscope FEI This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised
ImageJ imaging software can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
  2. Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
  3. Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
  4. Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
  5. Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
  6. Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
  7. Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
  8. Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
  9. MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
  10. Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
  11. Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
  12. Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
  13. Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
  14. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
  16. Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
  17. Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
  18. Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).

Tags

علم الوراثة، العدد 116، الخشب تشكيل، Xylogenesis، الجذعية النباتية الثانوية، المستحثة الجسدية التحليل القطاعي، المعدلة وراثيا، جين توصيف الوظيفي، أنماط المروج التعبير، الكافور، الحور،
استخدام المستحثة الجسدية التحليل القطاعي (ISSA) لدراسة الجينات والمروجين المشاركة في تشكيل الخشب والتنمية الجذعية الثانوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Spokevicius, A., Taylor, L., Melder, … More

Spokevicius, A., Taylor, L., Melder, E., Van Beveren, K., Tibbits, J., Creux, N., Bossinger, G. The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development. J. Vis. Exp. (116), e54553, doi:10.3791/54553 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter