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Immunology and Infection

अलगाव और murine लिम्फोसाइटों के सक्रियण

Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54596
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Biological Sciences, College of Science, Nanyang Technological University

Protocol

सभी चूहों नस्ल और विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत बनाए रखा और सभी माउस प्रोटोकॉल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार आयोजित कर रहे हैं।

1. बफ़र और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. , पूरा रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) मध्यम (10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी एल glutamine, पेनिसिलिन (100 आइयू / एमएल) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) तैयार 55 माइक्रोन के 2-मर्केप्टोइथेनाल )।
  2. उधर, तैयार 20x बैलेंस्ड नमक समाधान (बीएसएस) स्टॉक 1 और शेयर 2।
    1. 20x बीएसएस शेयर 1 (111 मिमी डेक्सट्रोज, 8.8 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट, 26.7 मिमी सोडियम फास्फेट 1 एल बाँझ पानी में द्विक्षारकीय) तैयार करें और इससे पहले अंतिम मात्रा समायोजन 20x बीएसएस शेयर 1 करने के लिए 40 मिलीलीटर 0.5% फिनोल लाल जोड़ें। बाँझ फिल्टर 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले 0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर।
    2. 20x बीएसएस शेयर 2 (25.8 मिमी कैल्शियम क्लोराइड dihydrate, 107 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, 2.73 एम सोडियम चर्चा को तैयारloride, 19.6 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड hexahydrate, 1 एल बाँझ पानी में 16.6 मिमी मैग्नीशियम सल्फेट)। बाँझ फिल्टर 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले 0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर।
    3. प्रयोगात्मक उपयोग के लिए 1x बीएसएस तैयार करने के लिए, 50 मिलीलीटर बीएसएस शेयर 1 और 50 मिलीलीटर बीएसएस शेयर 2 पतला, अलग से, 400 मिलीलीटर बाँझ पानी प्रत्येक में। दोनों पतला समाधान गठबंधन, 7 पीएच को समायोजित, और 20 मिलीलीटर FBS (2%) जोड़ें। बाँझ पानी और बाँझ फिल्टर का उपयोग कर 0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करने के लिए 1 एल ऊपर।
      नोट: बीएसएस स्टॉक समाधान अलग से तैयार किया जाना चाहिए, क्योंकि केंद्रित बीएसएस शेयरों का मिश्रण सीधे वर्षा में परिणाम सकता है।
  3. लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) बफर
    1. आरबीसी lysis बफर तैयार करने के लिए उपयोग करने से पहले 1 हिस्सा शेयर Tris आधार (130 मिमी Tris (hydroxymethyl) बाँझ पानी में aminomethane, पीएच 7.65) के लिए 9 भागों मिश्रण शेयर अमोनियम क्लोराइड (बाँझ पानी में 155 मिमी अमोनियम क्लोराइड)।
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर अमोनियम क्लोराइड और Tris आधार की दुकान बाँझ स्टॉक समाधान। तैयार सेल बीuffer लाल रक्त कोशिकाओं की कुशल सेल सुनिश्चित करने के लिए नए सिरे से।

2. प्लीहा या लिम्फ नोड्स से लिम्फोसाइट निलंबन की पीढ़ी

नोट: यह सभी अभिकर्मकों और उपकरण माउस इच्छामृत्यु से पहले प्रयोग के लिए आवश्यक तैयार करने के लिए और लिम्फोसाइटों के एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न करने के लिए जितनी जल्दी हो सके उच्च सेल viabilities बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।

  1. ग्रीवा अव्यवस्था या सीओ 2 asphyxiation द्वारा प्रयोगात्मक माउस euthanize।
    नोट: इस कदम के बाद से, सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं aseptically किया जाना चाहिए।
  2. किसी भी चीरों करने से पहले 70% इथेनॉल में पूरे माउस डुबकी। प्लीहा और लिम्फ नोड्स aseptically 8 निकालें, और उन्हें 5 मिलीलीटर ठंडा RPMI / FBS युक्त या बीएसएस / FBS (कदम 1.2.3 से) (RPMI 2% FBS के साथ) अलग 15 मिलीलीटर ट्यूब में जगह है।
    नोट: चूंकि बीएसएस कुशल आरबीसी सेल को रोकता है, प्लीहा सेल निलंबन की तैयारी के लिए RPMI का उपयोग करें और afte बीएसएस के लिए स्विचआर आरबीसी lysis।
  3. तिल्ली या लिम्फ नोड्स से एक एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न करने के लिए, 2 मिलीलीटर ठंडा RPMI / FBS या बीएसएस / FBS युक्त एक पेट्री डिश में बाँझ 100 माइक्रोन सेल झरनी के जाल के दो टुकड़ों के बीच में अंग (s) जगह है। 1 मिलीलीटर सिरिंज के सवार का प्रयोग, अंग (s) सानी जब तक यह बहुत ठीक भागों में फाड़ा गया है।
  4. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण और सेल झरनी ठंडा RPMI / FBS या बीएसएस / FBS के साथ जाल धो लें। , शेष सेल निलंबन लीजिए ही 15 मिलीलीटर ट्यूब को जोड़ने के लिए, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 453 XG पर नीचे स्पिन। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    नोट: बाद के चरणों में आरबीसी lysis बफर या मध्यम जोड़ने से पहले उंगलियों के साथ ट्यूब flicking द्वारा pelleted कोशिकाओं फिर से निलंबित।
  5. सेल निलंबन के centrifugation के दौरान कमरे के तापमान (आरटी) आरबीसी lysis बफर तैयार (1.3 चरण देखें।)। कोशिकाओं pelleting और सतह पर तैरनेवाला हटाने के बाद, हर 10 8 कोशिकाओं के लिए 1 मिलीलीटर आरबीसी lysis बफर के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित। Incuपीटा 3-4 मिनट के लिए आरटी पर सेल प्रतिक्रिया।
  6. 14 मिलीलीटर ठंडा बीएसएस / FBS के साथ आरबीसी सेल बंद करो और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 453 XG पर नीचे स्पिन।

3. बी और टी कोशिकाओं की शुद्धि

  1. बी कोशिकाओं की शुद्धि
    1. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। 300 μl बीएसएस / FBS में अप करने के लिए 10 8 प्लीहा कोशिकाओं को फिर से निलंबित और 50 μl विरोधी CD43 चुंबकीय microbeads 9,10 जोड़ें। , मृत कोशिकाओं को हटाने 30 μl Annexin वी चुंबकीय मोतियों को जोड़ने के लिए। 30 मिनट के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में सेल निलंबन सेते हैं।
  2. टी कोशिकाओं की शुद्धि
    1. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। गैर-टी सेल कमी एंटीबॉडी कॉकटेल में 10 8 कोशिकाओं (CD19, B220, जीआर -1 के खिलाफ biotinylated एंटीबॉडी अप करने के लिए पुनः निलंबित, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 और सीडी 4 या सीडी 8 को लक्ष्य सेल की आबादी के आधार पर 200 μl बीएसएस / FBS 4,5 में 200: शुद्ध किया जा), 1 पतला। एक में सेल निलंबन सेते4 डिग्री सेल्सियस 15 मिनट के लिए फ्रिज।
    2. ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को धोने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 453 XG पर नीचे स्पिन करने के लिए 10 मिलीलीटर बीएसएस / FBS जोड़ें। तैरनेवाला निकालें और 30 μl streptavidin microbeads और 15 μl Annexin वी चुंबकीय मोतियों के साथ 165 μl बीएसएस / FBS में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। 30 मिनट के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में सेल निलंबन सेते हैं।
      नोट: यहां तक ​​कि चुंबकीय microbeads साथ लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए 15 मिनट के लिए microbeads के साथ कोशिकाओं को सेते हैं, तो 15 मिलीलीटर ट्यूब दोहन से धीरे सेल निलंबन मिश्रण और कदम 3.1.1 के दौरान एक और 15 मिनट सेते हैं। या 3.2.2।
  3. सेल शुद्धि के लिए जुदाई स्तंभ की तैयारी
    1. कोशिकाओं के microbead लेबलिंग के दौरान एक अप्रयुक्त जुदाई स्तंभ तैयार (कदम 3.1.1। या 3.2.2।)। आरटी के लिए पूर्व गर्म बीएसएस (FBS के बिना) और 2 मिलीलीटर का उपयोग धोने और aseptically स्तंभ संतुलित करना। बीएसएस के साथ संतुलन के बाद, धोया स्तंभ बाहर सुखाने के लिए अनुमति नहीं दी जानी चाहिए।
      नोट: हम का उपयोग करें लोकसभा गolumn बजाय सिफारिश एलडी स्तंभ के अपने पुनः प्रयोज्य के कारण (3.4 कदम देखें।)।
    2. चुंबकीय मोतियों के साथ लेबलिंग के बाद, कोशिकाओं को धोने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 453 XG पर नीचे स्पिन करने के लिए 14 मिलीलीटर बीएसएस / FBS जोड़ें। तैरनेवाला निकालें और 1-3 मिलीलीटर आरटी बीएसएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
    3. स्तंभ की नोक पर एक बाँझ 21 जी सुई संलग्न शुद्धिकरण की प्रक्रिया के दौरान प्रवाह की दर को कम करने के लिए। equilibrated स्तंभ पर सेल निलंबन लोड और शुद्ध लक्ष्य कोशिकाओं से युक्त प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा।
      नोट: स्तंभ को लोड करने में बुलबुले शुरू करने से बचें।
    4. 1 मिलीलीटर बीएसएस / FBS के साथ एक बार स्तंभ धो लें और शुद्ध लक्ष्य कोशिकाओं से युक्त प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा। एक बार फिर से के माध्यम से प्रवाह के साथ स्तंभ पुनः लोड करें। वही 15 मिलीलीटर ट्यूब में दूसरा लदान के बाद के माध्यम से प्रवाह लीजिए।
    5. 1 मिलीलीटर बीएसएस / FBS के साथ कॉलम 3 बार धोएं और शुद्ध लक्ष्य कोशिकाओं से युक्त प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा। इसके बाद, वें 5 मिलीलीटर बीएसएस / FBS जोड़नेई स्तंभ और एक सवार के साथ, एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्तंभ के बाहर चुंबकीय लेबल कोशिकाओं फ्लश।
    6. एंटीबॉडी कि शुद्ध बी या टी कोशिकाओं 4,5 के एंटीजन सतह से बँधे का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा एकत्र की कोशिकाओं की शुद्धता की जाँच करें।
  4. पुनः उपयोग जुदाई स्तंभ
    नोट: लोकसभा स्तंभ शोधन क्षमता को प्रभावित किए बिना 4 गुना तक पुन: उपयोग किया जा सकता है।
    1. 5 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और सवार का उपयोग कर ऊपर से आसुत जल 5 मिलीलीटर के साथ 3 बार के साथ स्तंभ 3 बार धोएं।
    2. 5 मिलीलीटर 70% इथेनॉल के साथ स्तंभ धो लें और बड़े पैमाने पर एक हवाई नल का उपयोग कर स्तंभ में जंग के buildup को रोकने के लिए स्तंभ सूखी।
    3. एक अलग शुद्धि प्रयोग के लिए एक प्रयोग किया लोकसभा स्तंभ तैयार करने के लिए, 5 मिलीलीटर 70% इथेनॉल सिरिंज अनुकूलक का उपयोग कर के साथ नीचे से ऊपर स्तंभ धो लें। अगले, 5 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस, स्तंभ के ऊपर से एक बार 5 मिलीलीटर पीबीएस के द्वारा पीछा के साथ दो बार नीचे से ऊपर स्तंभ धो लें। 2 जोड़ेमिलीलीटर आरटी बीएसएस स्तंभ संतुलित करने और उसके बाद लेबल की कोशिकाओं के साथ स्तंभ लोड करने के लिए आगे बढ़ें।

4. CFSE लेबल और उत्तेजना

नोट: शुद्ध कोशिकाओं में इन विट्रो की एक किस्म के लिए और इन विवो कार्यात्मक assays में किए जा सकता है। यहाँ, हम APCs 5 के टी सेल उत्तेजना क्षमता निर्धारित करने के लिए शुद्ध टी कोशिकाओं का उपयोग करें।

  1. पूर्व गर्म लेबलिंग समाधान (पीबीएस में 0.1% FBS) 37 डिग्री सेल्सियस से पहले CFSE के लिए लोड हो रहा है।
    नोट: पीबीएस में एफबीएस के एक कम प्रतिशत का उपयोग कर CFSE लोडिंग के दौरान कोशिका मृत्यु को कम कर देता है और centrifugation के दौरान सेल नुकसान को कम करता है। हालांकि, बहुत ज्यादा FBS CFSE लदान के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।
  2. शुद्ध कोशिकाओं लेबलिंग समाधान के साथ दो बार धोएं, तो 2 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में पूर्व गर्म लेबलिंग समाधान में फिर से निलंबित कर दिया।
  3. 10 माइक्रोन CFSE समाधान तैयार है (1: 5 मिमी CFSE शेयर समाधान के 500 कमजोर पड़ने) पूर्व गर्म लेबलिंग समाधान में। CFSE समाधान करना चाहिएहौसले से हर बार इष्टतम लेबलिंग प्राप्त करने के लिए तैयार रहना।
  4. CFSE के साथ कोशिकाओं को लोड करने के लिए, 1 भाग सेल निलंबन 1 हिस्सा 10 माइक्रोन CFSE समाधान करने के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर जोड़ सकते हैं और अंधेरे में सेते हैं। 5 माइक्रोन के CFSE के अंतिम एकाग्रता 1 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल लेबल करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
  5. ट्यूब पलटना हर 2 मिनट CFSE लोडिंग के दौरान कोशिकाओं का एक समरूप मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए।
  6. प्रतिक्रिया को रोकने, ठंडा पूरा RPMI मध्यम के कई संस्करणों को जोड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 453 XG पर नीचे स्पिन। सफल CFSE लोडिंग पर, सेल गोली पीले रंग के दिखाई देगा।
  7. धो CFSE ठंडा पूरा RPMI मध्यम के साथ कोशिकाओं लोड एक और अधिक समय और नीचे में इन विट्रो संवर्धन के लिए या विवो उत्तेजना में उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 453 XG पर स्पिन।

5. इन विट्रो उत्तेजना

  1. तुरंत उपयोग करने से पहले उत्तेजनाओं की एक 2x शेयर समाधान (2x उत्तेजनाओं शेयर समाधान) तैयार करें तो यह है कि 102x उत्तेजनाओं स्टॉक समाधान के 0 μl एक 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 200 μl के अंतिम मात्रा के लिए कोशिकाओं के 100 μl करने के लिए जोड़ा जा सकता है।
  2. एक थाली उत्तेजनाओं (आईजीएम या CD40 बी कोशिकाओं या CD3 और टी कोशिकाओं के लिए CD28 के लिए) के साथ लेपित की आवश्यकता है, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में उत्तेजनाओं और पूर्व कोट संस्कृति की थाली पतला। वैकल्पिक रूप से, संस्कृति की थाली प्रयोग के दिन पर 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लेपित किया जा सकता है। लेपित थाली पीबीएस (प्लेट किसी भी समय बाहर शुष्क करने की अनुमति नहीं है) के साथ दो बार धोएं।
बी कोशिकाओं के लिए
उत्तेजनाओं अंतिम एकाग्रता
एफ (एबी) 2 बकरी विरोधी माउस आईजीएम 0.6-2.4 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
विरोधी माउस CD40 एमएबी 0.5-2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
संयोजकमाउस आईएल 4 25 यू / मिलीलीटर
lipopolysaccharide 0.1-10 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
ई से (LPS) कोलाई सीरोटाइप 055: बी 5
टी कोशिकाओं के लिए
उत्तेजनाओं अंतिम एकाग्रता
विरोधी CD3 (प्लेट लेपित) 2-10 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
(50 μl / अच्छी तरह से कोटिंग के लिए)
विरोधी CD28 (प्लेट लेपित) 2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
संयोजक आईएल -2 40 यू / मिलीलीटर
PDBu (phorbol एस्टर) 5-50 एनजी / एमएल
A23187 (कैल्शियम ionophore) 250 एनजी / एमएल

तालिका 1: इन विट्रो संस्कृति में लिम्फोसाइट को प्रोत्साहित करने के लिए इस्तेमाल उत्तेजनाओं की सांद्रता।

  1. CFSE लेबल बी कोशिकाओं के लिए, तीन प्रतियों में पूरा RPMI मध्यम और संस्कृति में 3 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल 3 एक्स 10 5 कोशिकाओं के साथ / में अच्छी तरह से फिर से निलंबित 96 अच्छी तरह से 72 घंटे के लिए फ्लैट नीचे प्लेटों।
  2. CFSE लेबल टी कोशिकाओं के लिए, 0.5-3 एक्स 10 6 कोशिकाओं / 0.5-3 x 10 5 कोशिकाओं के साथ पूरा RPMI मध्यम और तीन प्रतियों में संस्कृति में मिलीलीटर / में अच्छी तरह से फिर से निलंबित 96 अच्छी तरह से 48 या 72 घंटे के लिए गोल नीचे प्लेटों ।

6. विवो उत्तेजना

  1. इन विवो उत्तेजना, adoptively हस्तांतरण के लिए 4 x 10 6 माउस प्रति CFSE लेबल टी कोशिकाओं (नसों (iv) 200 μl पीबीएस में) प्रत्येक एमएचसी मिलान प्राप्तकर्ता माउस में।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, CFSE लेबल टी कोशिकाओं adoptively पूंछ नस या इन कोशिकाओं के रूप में रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन का उपयोग कर घर में इस तरह के प्लीहा और लिम्फ नोड्स के रूप में अंगों Lymphoid होगा स्थानांतरित किया जा सकता है।
  2. एक दिन बाद प्रतिजन के साथ प्राप्तकर्ता चूहों को चुनौती।
    ध्यान दें:इस उदाहरण में, हम प्रतिजन के रूप में ovalbumin (ओवीए प्रोटीन, 50 ग्राम / माउस) का उपयोग करें क्योंकि ओवीए विशिष्ट, टी सेल रिसेप्टर (TCR) -transgenic टी कोशिकाओं adoptively प्राप्तकर्ता चूहों में स्थानांतरित कर दिया गया। बाँझ पीबीएस में ओवीए प्रोटीन को तैयार है और ओवीए प्रोटीन / पीबीएस या पीबीएस नियंत्रण के 100 μl इंजेक्षन, चमड़े के नीचे इंजेक्शन (एसआई) के माध्यम से प्रत्येक प्राप्तकर्ता माउस 5 में।
  3. हार्वेस्ट और 3 दिन ओवीए प्रोटीन या पीबीएस के साथ टीकाकरण के बाद प्राप्तकर्ता चूहों की लसीकावत् अंगों से एकल कक्ष निलंबन (लिम्फ नोड्स और spleens) उत्पन्न करते हैं। समीपस्थ लिम्फ नोड्स (PLN) है, जो कक्षा, बाहु और सतही ग्रीवा लिम्फ नोड्स) और बाहर का लिम्फ नोड्स (DLN) भी शामिल है, जो mesenteric, घुटने की चक्की, वंक्षण, काठ, और दुम लिम्फ नोड्स शामिल है में अलग लिम्फ नोड्स। उचित FACS एंटीबॉडी का उपयोग कोशिकाओं दाग टी सेल प्रसार के लिए जाँच करें।
    नोट: इस CFSE सेल ट्रैकिंग प्रयोग में, CFSE लेबल पीबीएस इंजेक्शन नियंत्रण चूहों से टी कोशिकाओं गैर di के लिए एक आधारभूत प्रतिदीप्ति की स्थापनाकोशिकाओं viding। Proliferating की कोशिका विभाजन, प्रतिजन उत्तेजित, CFSE लेबल की कोशिकाओं प्रतिदीप्ति चोटियों 12,13 मापने के द्वारा कल्पना कर रहे हैं। पीबीएस नियंत्रण के साथ, proliferating की कोशिका विभाजन की संख्या, CFSE लेबल टी कोशिकाओं 12,13 निर्धारित किया जा सकता है।
  4. नमूने के बीच कोशिका विभाजन या चोटियों की संख्या की तुलना द्वारा CFSE लेबल सेल प्रसार डेटा का विश्लेषण (आंकड़े 1 और 2)।
    नोट: उदाहरण के लिए, CFSE लेबल, ओवीए विशेष टी कोशिकाओं adoptively प्राप्तकर्ता ओवीए प्रतिजन प्राप्त चूहों में स्थानांतरित सक्रिय प्रसार पीबीएस इंजेक्शन नियंत्रण चूहों की तुलना में 5,12 से गुजरना होगा। इसके अलावा, यह CFSE सेल प्रसार डेटा का विश्लेषण करने के लिए कई तरीके के रूप में हॉकिन्स और उनके सहयोगियों ने 14 से प्रदर्शन किया, देखते हैं कि बाहर बात करने से उल्लेखनीय है।

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Representative Results

लिम्फोसाइटों के चुंबकीय सेल शुद्धि उपयोगकर्ताओं को समय की एक अपेक्षाकृत छोटी राशि में एक लक्ष्य सेल की आबादी को शुद्ध करने के लिए अनुमति देता है। हमारे कमी प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम CD8 टी कोशिकाओं का प्रतिशत शुद्धि के बाद 94.2% (करने के लिए 72.8% (पहले शुद्धि) से (ओटी-मैं पुनर्संयोजन सक्रिय जीन-1 (चीर-1) -deficient चूहों में) में वृद्धि करने में सक्षम थे; चित्रा 1 ए) 4,5। ये शुद्ध लिम्फोसाइट फिर नीचे की ओर कार्यात्मक assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता लिम्फोसाइट प्रसार और संकेत पारगमन 4,5 निर्धारित करने के लिए। उदाहरण के लिए, हम APCs के vivo टी सेल उत्तेजना क्षमता का अध्ययन कर सकते हैं wildtype (डब्ल्यूटी) और उत्परिवर्ती (एमटी) चूहों उपयुक्त प्रतिजन 5 के साथ प्रतिरक्षित में CFSE लेबल, प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के हस्तांतरण से।

हमारे प्रतिनिधि प्रयोग में, हम शुद्ध, CFSE लेबल, ovalbumin (OVA) विशिष्ट OT-मैं CD8 टी सी का तबादलानियंत्रण (डब्ल्यूटी) और उत्परिवर्ती (एमटी) चूहों में एल और ओवीए प्रोटीन के साथ एक दिन बाद इन चूहों प्रतिरक्षित। तीन दिन टीकाकरण के बाद, हम लिम्फ नोड्स (समीपस्थ और बाहर का) और spleens काटा और प्रवाह cytometry द्वारा टी कोशिकाओं का विश्लेषण किया। CD45 allelic रूपों बेहतर गैर लेबल, प्राप्तकर्ता CD8 टी कोशिकाओं से विभाजन, CFSE लेबल, दाता OT-मैं सीडी 8 कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इस उदाहरण में, दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं CD45.1 और CD45.2 चूहों, क्रमशः (चित्रा 1 बी) से हैं। इस समय बिंदु पर जीवित रहने की CFSE स्तर, unstimulated OT-मैं टी कोशिकाओं गैर proliferating कोशिकाओं (चित्रा 1C, बिंदीदार रेखा) के लिए पीक परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। उत्तेजना पर, OT-मैं टी कोशिकाओं में CFSE स्तर की तीव्रता प्रत्येक विभाजन के साथ आधे से कम हो जाएगा। टी सेल प्रसार जिससे संख्या की गणना के CFSE चोटियों 6,12 द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। हमारे प्रतिनिधि परिणामों में, हम (WT और मीट्रिक टन APCs के पार प्रस्तुति क्षमताओं में मतभेद नहीं देख पा रहे हैंचित्रा 1C, ठोस लाइनों), के बाद से टी कोशिकाओं दोनों चूहों में समान दरों पर पैदा करना।

एक अलग प्रयोग में, हम एक [3 एच] -thymidine समावेश सक्रिय नियंत्रण और मीट्रिक टन टी कोशिकाओं की सेल प्रसार का अध्ययन करने के लिए परख प्रदर्शन किया। शुद्ध गुम्मट और मीट्रिक टन टी कोशिकाओं 48 घंटे के लिए विभिन्न उत्तेजनाओं के साथ प्रेरित और साथ [3 एच] अंतिम 8 घंटे के लिए -thymidine स्पंदित कर रहे थे। सेल चक्र के एस चरण में कोशिकाओं proliferating radiolabeled न्यूक्लियोटाइड को शामिल करेंगे, [3 एच] -thymidine, नए संश्लेषित deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) में है, इसलिए, तरल जगमगाहट गिनती का उपयोग कर, सेल प्रसार से मापा जा सकता है [3 एच] -thymidine तेज। प्रति मिनट (सीपीएम) की गिनती की संख्या सीधे टी कोशिकाओं proliferating में [3 एच] -thymidine तेज की राशि के साथ संबद्ध। हमारे प्रतिनिधि परिणामों में, उत्तेजना पर मीट्रिक टन टी कोशिकाओं से प्राप्त सीपीएम की कम संख्या की तुलना में गगुम्मट टी कोशिकाओं से ounts मीट्रिक टन टी कोशिकाओं (चित्रा -1) का एक समझौता proliferative क्षमता को दर्शाता है।

बी सेल proliferative क्षमता का निर्धारण करने के लिए, हम वर्णित कमी रणनीति का प्रयोग प्लीहा बी कोशिकाओं शुद्ध। शुद्धि होने पर, हम 98.4% से 63.9% (शुद्धि से पहले) से B220 बी कोशिकाओं (WT चूहों) का प्रतिशत बढ़ाने के लिए सक्षम थे (शुद्धि के बाद, चित्रा 2A) 4। टी कोशिकाओं शुद्ध के लिए इसी प्रकार, शुद्ध प्लीहा बी कोशिकाओं को भी लिम्फोसाइट प्रसार और संकेत पारगमन 4 आकलन करने के लिए नीचे की ओर कार्यात्मक assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बाद में, हम CFSE के साथ शुद्ध गुम्मट प्लीहा बी कोशिकाओं लेबल और विरोधी CD40 साइटोकाइन आईएल -4 के साथ पूरक के साथ लेपित प्लेट का उपयोग कर इन विट्रो में इन कोशिकाओं को प्रेरित किया। तीन दिन उत्तेजना के बाद, हम प्रवाह cytometry द्वारा व्यवहार्य, सक्रिय बी कोशिकाओं का विश्लेषण किया। जीवित रहने की CFSE स्तर, पर इस समय बिंदु पर unstimulated बी कोशिकाओं को इस्तेमाल कर रहे हैंगैर proliferating कोशिकाओं (चित्रा 2 बी, बिंदीदार रेखा) के लिए पीक परिभाषित करते हैं। टी कोशिकाओं के लिए इसी प्रकार, बी कोशिकाओं में CFSE स्तर की तीव्रता प्रत्येक प्रभाग 6,12 के साथ आधे से कम हो जाएगा।

आकृति 1
चित्रा 1: टीकाकरण के बाद adoptively तबादला कर शुद्ध OT-मैं टी कोशिकाओं के CFSE प्रोफाइल (ए) सीडी 4 और सीडी 8 OT-मैं से अलग कक्षों का धुंधला;। चीर-1-चूहों की कमी से पहले (ऊपरी पैनल) और (कम पैनल) गैर-टी सेल कमी के बाद। (बी) तिल्ली (सपा) से टी कोशिकाओं के प्रतिनिधि FACS भूखंडों, समीपस्थ लिम्फ नोड्स (PLN) और बाहर का लिम्फ नोड्स (DLN)। डोनर OT-मैं CD8 टी कोशिकाओं सकारात्मक CD45.1 रहे हैं। (सी) प्रतिनिधि CFSE तिल्ली से स्थानांतरित, CFSE लेबल OT-मैं दाता टी कोशिकाओं की प्रोफाइल (सपा), समीपस्थ लिम्फ नोड्स (PLN) और बाहर का लिम्फ नोड्स गुम्मट की (DLN) (छायांकित घटता) औरमीट्रिक टन (ठोस लाइनों) प्राप्तकर्ता चूहों 3 दिन ओवीए प्रोटीन और LPS के साथ टीकाकरण के बाद। बिंदीदार रेखा टीकाकरण के बिना गुम्मट प्राप्तकर्ता चूहों से OT-मैं टी कोशिकाओं को इंगित करता है (पीबीएस इंजेक्शन)। (डी) सक्रिय नियंत्रण या मीट्रिक टन टी कोशिकाओं के प्रसार के रूप में सेल [3 एच] -thymidine तेज परख द्वारा मापा जाता है। परिणाम प्रति मिनट (सीपीएम) की गिनती में प्रस्तुत कर रहे हैं। शुद्ध नियंत्रण (खुले बार) या मीट्रिक टन (बंद पट्टी) टी कोशिकाओं मध्यम केवल (मध्यम) में 48 घंटे के लिए incubated रहे थे या के साथ या पुनः संयोजक IL- बिना प्लेट बाध्य विरोधी CD3 या विरोधी CD3 प्लस विरोधी CD28 की उपस्थिति में 2। पॉलीक्लोनल सेल सक्रियण पीएमए (phorbol एस्टर) और A23 (कैल्शियम ionophore) द्वारा शुरू किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: के CFSE प्रोफ़ाइलइन विट्रो उत्तेजना पर बी कोशिकाओं। (ए) B220 और (ऊपरी पैनल) पहले और (कम पैनल) गैर-बी सेल कमी के बाद गुम्मट चूहों से अलग प्लीहा कोशिकाओं के CD3 धुंधला हो जाना। (बी) के विरोधी CD40 और IL4 के साथ लेपित प्लेटों के साथ इन विट्रो उत्तेजना के 3 दिन बाद CFSE लेबल डब्ल्यूटी (छायांकित वक्र) प्लीहा बी कोशिकाओं के प्रतिनिधि CFSE प्रोफ़ाइल। बिंदीदार रेखा उत्तेजना के बिना CFSE लेबल गुम्मट बी कोशिकाओं को इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम लसीकावत् अंगों से लिम्फोसाइट सफ़ाई के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शन। सेल चुंबकीय मनका छँटाई का उपयोग कर शुद्धि एक तेज और आसान तरीका है कि व्यवहार्य, अत्यधिक शुद्ध लक्ष्य कोशिकाओं पैदावार है।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

सेल व्यवहार्यता और सेल उपज

इन विट्रो में hematopoietic वंश कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बनाए रखने के सफल प्रयोगों और प्रतिलिपि प्रस्तुत सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। रासायनिक और जैविक अभिकर्मकों, उप इष्टतम प्रयोगात्मक शर्तों या excised अंगों के अनुचित भंडारण की स्थिति सभी सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं। चूहों से छांटना पर, लसीकावत् अंगों बर्फ और जितनी जल्दी हो सके तैयार एकल कक्ष निलंबन पर जमा होने की जरूरत है। सेल निलंबन की उच्च गति centrifugation भी बचा जाना चाहिए। इसके अलावा, सेल छर्रों सतह पर तैरनेवाला को हटाने के बाद उंगलियों के साथ ट्यूब flicking द्वारा ढीला किया जाना चाहिए। यह नहींpipetting द्वारा माध्यम की बड़ी मात्रा के साथ छर्रों सीधे फिर से निलंबित करने की सिफारिश की।

लगभग 2-4 10 x 7 प्लीहा बी कोशिकाओं और सभी प्रमुख लिम्फ नोड्स से 2 10 x 7 टी कोशिकाओं एक 8-10 सप्ताह पुराने WT माउस से अलग किया जा सकता है। शुद्ध बी और टी कोशिकाओं (उम्मीद मूल्य से नीचे) की कम संख्या, उप इष्टतम स्थितियों को इंगित करता है कि पहले उल्लेख किया है।

सेल शुद्धता

इस प्रोटोकॉल का उपयोग अलग कक्षों की औसत शुद्धता 90 से 95% है, जो इन विट्रो में या विवो प्रयोगों (चित्रा 1 ए) में बाद के लिए पर्याप्त रूप से शुद्ध है की सीमा के भीतर है। यह स्तंभ की सीमित क्षमता के कारण बाध्यकारी जुदाई क्योंकि ऐसा करने से सेल शुद्धता समझौता कर सकते हैं की प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं की अत्यधिक संख्या के साथ जुदाई स्तंभ अधिभार के लिए उचित नहीं है।

FBS की गुणवत्ता

FBS की गुणवत्ता के पूरक के लिए संस्कृति के माध्यम लिम्फोसाइट की इन विट्रो अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है इस्तेमाल किया। विभिन्न स्रोतों और बैचों से FBS उनकी विट्रो लिम्फोसाइट प्रतिक्रियाओं में समर्थन करने की क्षमता में भिन्न हो सकते हैं। इसलिए, यह एक है कि कम पृष्ठभूमि के साथ उच्च विशिष्ट प्रतिक्रिया देता लगाने के लिए FBS के विभिन्न प्रकार के परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है। बोतलों की एक पर्याप्त संख्या में तो एक शेयर के रूप में आरक्षित किया जाना चाहिए।

संशोधन और समस्या निवारण

CFSE लेबलिंग की स्थिति

हालांकि CFSE लेबलिंग सादे RPMI में काम करता है, हमने पाया है कि पीबीएस में एफबीएस के एक कम प्रतिशत का उपयोग कर लोड करने की प्रक्रिया के दौरान कोशिका मृत्यु को कम करता है, लेबलिंग की दक्षता में कोई समझौता किए बिना किया है। इसके अलावा, FBS की उपस्थिति centrifugation के दौरान सेल नुकसान को कम करता है।

CFSE लेबलिंग का एक महत्वपूर्ण पहलू आदेश अलग शिखर कल्पना करने में कोशिकाओं की भी लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए हैएस कोशिका विभाजन का प्रतिनिधित्व करता है। CFSE की ओवरलोडिंग विट्रो या विवो में लेबल की कोशिकाओं के गरीब वसूली में वृद्धि हुई कोशिका मृत्यु में परिणाम सकता है। दूसरी ओर, लेबलिंग की प्रक्रिया के दौरान अपर्याप्त CFSE लेबलिंग या लक्ष्य सेल निलंबन में विविधता में परिणाम कर सकते खराब सुलझाया CFSE चोटियों 12। इसलिए, यह CFSE लेबलिंग शर्तों का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया CFSE की राशि से अधिक भार से संभावित विषाक्त प्रभाव को कम करने के लिए संभव के रूप में के रूप में कम रखा जाना चाहिए, लेकिन अभी भी प्रयोगात्मक समय सीमा के भीतर उत्तेजना पर अच्छी तरह से सुलझाया चोटियों का पता लगाने के लिए पर्याप्त लेबलिंग को प्राप्त करने। इसके अलावा, खराब सुलझाया चोटियों से बचने के लिए, सेल झुरमुटों CFSE लोड करने से पहले एकल कक्ष निलंबन से हटा दिया जाना चाहिए।

सेल clumps और सेल नुकसान

यह सुनिश्चित करना है कि कोशिकाओं को पूरी तरह फिर से निलंबित कर दिया जाता है, क्योंकि सदा remova अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले महत्वपूर्ण हैप्रयोग के दौरान सेल झुरमुटों के एल काफी सेल नंबर कम कर देता है। सेल clumps आमतौर पर कम सेल व्यवहार्यता या सेल गोली की अपर्याप्त फिर से निलंबन के साथ जुड़े रहे हैं।

CFSE और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा ओवरलैप

CFSE लेबल की कोशिकाओं कर सकते हैं आगे संस्कृति में एक दिन के बाद fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ परिभाषित किया जा सकता है, हालांकि, इन CFSE लेबल कोशिकाओं को अभी भी संस्कृति में एक दिन के बाद चमकीले फ्लोरोसेंट रहते हैं। , इस तरह के phycoerythrin (पीई) और phycoerythrin-जाती 7 (PeCy7) के रूप में CFSE के साथ उत्सर्जन स्पेक्ट्रा ओवरलैप की न्यूनतम मात्रा के साथ उज्ज्वल fluorophores संयुग्मित एंटीबॉडी के संयोजन का उपयोग इष्टतम धुंधला परिणाम प्रदान करता है। हालांकि, मुआवजे को कम करने के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा ओवरलैप अभी भी आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, फ्लोरिडा -2 मूल्य के उच्च प्रतिशत की कटौती एक ऑप्ट को प्राप्त करने के द्वारा मुआवजा होने की वजह से CFSE संकेत (फ्लोरिडा -1 चैनल) कि फ्लोरिडा -2 चैनल में फैल के उच्च तीव्रता के लिए, फ्लोरिडा -2 चैनल गया हैIMAL CFSE प्रोफ़ाइल। एक कागज क्वाह एट अल।, जो समस्या निवारण CFSE लेबलिंग और परिणाम 12 के विश्लेषण के लिए समाधान प्रदान करता है द्वारा प्रकाशित करने के लिए उल्लेख कर सकते हैं।

CFSE के लिए विकल्प

CFSE के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम ऐसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) संयुग्मित एंटीबॉडी के रूप में fluorescein डेरिवेटिव के साथ CFSE के संयोजन के उपयोग को प्रतिबंधित। वहाँ रहे हैं, हालांकि, अन्य समान रूप से उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता और कम सेल विषाक्तता बैंगनी में (केबल टीवी, उत्तेजना / उत्सर्जन: 405/450 एनएम) के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल रंग, पीले रंग (CTY, 555/580 एनएम), अब तक लाल (CTFR, 630 / 661 एनएम या CPD670, 647/670 एनएम) और लाल (PKH26, 551/567 एनएम)। विभिन्न उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ सेल लेबलिंग रंगों का उपयोग कर प्रयोगात्मक डिजाइन में लचीलापन प्रदान करता है। दूसरी ओर, ऊपर वर्णित सेल लेबलिंग रंगों के सभी नहीं अलग कोशिका विभाजन चोटियों उत्पन्न कर सकते हैं। एक तुलनात्मक अध्ययन का उपयोग कर प्रदर्शनविभिन्न सेल लेबलिंग रंगों निष्कर्ष निकाला है कि केबल टीवी CFSE के लिए एक बेहतर प्रतिस्थापन है क्योंकि केबल टीवी स्पष्ट रूप से परिभाषित कोशिका विभाजन चोटियों 13 के एक उच्च संख्या का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है।

सीमाओं

चुंबकीय सेल छँटाई की प्रमुख सीमा है कि यह साधारण सेल छँटाई के लिए ही उपयुक्त है। हमारे उदाहरण में, हम तिल्ली से सभी गैर-बी कोशिकाओं व्यय करना CD43 इस्तेमाल कर सकते हैं; हालांकि, हम सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं से कूपिक बी कोशिकाओं को अलग करने में सक्षम नहीं होगा। इन उप आबादी ही कई सतह मार्कर के साथ परिभाषित किया जा सकता है। हालांकि यह संभव है कि सकारात्मक चुंबकीय सेल का उपयोग कोशिकाओं की सतह कई मार्करों पर आधारित छँटाई का चयन करने के लिए, यह विशेष रूप से तैयार, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों कि दूसरी मार्कर के लिए आगे बढ़ने से पहले छँटाई के पहले दौर के बाद लक्ष्य कोशिकाओं से microbeads की रिहाई के लिए सक्षम पर निर्भर है। इस प्रकार, उपयोगकर्ता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट पर पूरी तरह से निर्भर होगा। ऐसे एक मामले में, मैं FACSऔर अधिक परिष्कृत सेल आबादी को अलग करने में फायदेमंद है।

तकनीक का महत्व

ऐसे चुंबकीय सेल छँटाई और FACS के रूप में एंटीबॉडी आधारित सेल छँटाई दृष्टिकोण, सबसे विश्वसनीय सेल तकनीक छँटाई तिथि करने के लिए 15 हैं। सेल जुदाई के अन्य तरीकों के घनत्व के आधार पर और पालन-आधारित तकनीकों सहित मौजूद हैं, हालांकि, लिम्फोसाइट खराब पक्षपाती कोशिकाओं रहे हैं और उनके उप-जनसंख्या घनत्व में अपेक्षाकृत समान है, इस प्रकार adherence- और घनत्व आधारित तकनीक या तो लागू नहीं कर रहे हैं या बहुत अक्षम हैं 15 ।

के रूप में परिचय, तेजी से, सरल, उच्च सेल व्यवहार्यता में उल्लेख किया है, और किसी भी अत्याधुनिक उपकरणों की स्वतंत्र चुंबकीय सेल FACS खत्म छँटाई की जीत विशेषताएं हैं। विशेष रूप से, नकारात्मक रिक्तीकरण में चुंबकीय सेल का उपयोग लेबलों छंटाई और एक चुंबकीय जुदाई स्तंभ का उपयोग अवांछनीय कोशिकाओं depletes, कम से कम modificatio के साथ लक्ष्य कोशिकाओं को अलग करते हुएकोशिका की सतह के लिए और भोले स्थिति बनाए रखने के एनएस।

भविष्य के अनुप्रयोगों

इस चुंबकीय आधारित शोधन तकनीक का उपयोग कर शुद्ध अत्यधिक समृद्ध व्यवहार्य, और भोले लिम्फोसाइट लिम्फोसाइट व्यवहार के विभिन्न कार्यात्मक assays और इन विट्रो और इन विवो में संकेत तंत्र के अधीन किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम दो अलग अलग सेल प्रसार assays का उपयोग प्रदर्शन किया - [3 एच] -thymidine समावेश परख और CFSE सेल प्रसार परख - सक्रिय लिम्फोसाइटों के सेल proliferative क्षमता की जांच करने के लिए।

के बीच चुनाव [3 एच] -thymidine समावेश परख और CFSE सेल प्रसार परख काफी हद तक नमूने का आकार और प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर करता है। बड़ा नमूना आकार के साथ [3 एच] -thymidine समावेश प्रयोगों में परख का उपयोग उच्च throughput सेल प्रसार डेटा उत्पन्न करता है। आदेश में इष्टतम सुनिश्चित करने के लिए [<sup> 3 एच] -thymidine तेज और परिणामों के reproducibility, [3 एच] -thymidine संस्कृति के लिए जब कोशिकाओं के बहुमत सक्रिय रूप से बांट रहे हैं जोड़ा जाना चाहिए। लेबलिंग प्रोटोकॉल का अनुकूलन विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और उत्तेजनाओं के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, कारण [3 एच] -thymidine, इस समावेश परख केवल इन विट्रो में, कोशिकाओं के CFSE लेबलिंग, जो इन विट्रो (चित्रा 2 बी) में सक्रिय किया जा सकता है या adoptively का तबादला प्राप्तकर्ता चूहों में विपरीत किया जा सकता है (चित्रा 1 बी के रेडियोधर्मी प्रकृति के लिए और 1 सी)।

CFSE सेल प्रसार परख, दूसरे हाथ पर, [3 एच] -thymidine समावेश से सेल प्रसार के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करता है। चूंकि CFSE लेबल की कोशिकाओं में CFSE की तीव्रता प्रत्येक कोशिका विभाजन के साथ आधे से कम कर देता है, एक कोशिका विभाजन की संख्या और संख्या और चोटियों के आकार की गणना के द्वारा प्रत्येक प्रभाग में कोशिकाओं के अनुपात का निर्धारण कर सकते हैं [3 एच] -thymidine समावेश परख है कि अंतिम समय बिंदु पर सेल प्रसार के उपाय के विपरीत, CFSE सेल प्रसार परख कोशिका विभाजन की ट्रैकिंग के लिए, सेल प्रसार क्षमता के कैनेटीक्स के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करने की अनुमति देता है। हालांकि, CFSE सेल प्रसार परख बड़ा नमूना आकार के साथ प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता।

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Acknowledgments

अध्ययन शिक्षा, सिंगापुर मंत्रालय (AcRF Tier1-RG40 / 13 और श्रेणी 2-MOE2013-T2-2-038) द्वारा समर्थित है। पांडुलिपि Obrizus संचार से एमी सुलिवन द्वारा संपादित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
RPMI 1640 (without L-Glutamine) Gibco 31870025
Fetal Bovine Serum Heat inactivated 
L-glutamine Gibco 25030024
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140114
2-mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-CD43 magnetic microbeads Miltenyi Biotec 130-049-801 Mix well prior use
Streptavidin microbeads Miltenyi Biotec 130-048-101 Mix well prior use
Anti-Annexin V magnetic beads Miltenyi Biotec 130-090-201 Mix well prior use
MACS LD  Miltenyi Biotec 130-042-901
96-well U-bottom sterile culture plate Greiner Bio-one 650180
96-well F-bottom sterile culture plate Greiner Bio-one 655180
100 μm cell strainer mesh To sterilize using UV radiation prior use
0.2 μm  sterile disposable filter units Nalgene 567-0020 Can be substituted with any sterile filter device
CellTrace Violet Invitrogen C34557 CTV for short; alternative to CFSE
CellTrace Yellow Invitrogen C34567 CTY for short; alternative to CFSE
CellTrace Far Red Invitrogen C34564 CTFR for short; alternative to CFSE
Cell Proliferation Dye eFluor 670 eBioscience 65-0840 CPD670 for short; alternative to CFSE
PKH26 Sigma Aldrich PKH26GL PKH26, alternative to CFSE
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Dextrose Sigma Aldrich G7021
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5655
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S5136
Phenol Red Sigma Aldrich P0290
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C7902
Potassium chloride Sigma Aldrich P5405
Sodium chloride Merck Millipore S7653 Can use from other sources
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich M2393
Magnesium sulfate Sigma Aldrich M2643
Ammonium chloride Sigma Aldrich A9434
Tris-base
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich  D8418
(5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) Molecular Probes C-1157 Reconstitute in DMSO
Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester) Sigma Aldrich P1269
A23187 (Calcium ionophore) Sigma Aldrich C7522
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies and recombinant protein
CD11b biotin (clone m1/70) Biolegend 101204 T cell depletion cocktail
CD11c biotin (clone N418) Biolegend 117304 T cell depletion cocktail
Gr-1 biotin (clone RB6-8C5) Biolegend 108404 T cell depletion cocktail
Ter119 biotin (clone Ter119) Biolegend 116204 T cell depletion cocktail
TCR-γδ biotin (clone GL-3) Biolegend 118103 T cell depletion cocktail
CD19 biotin (clone 6D5) Biolegend 115504 T cell depletion cocktail
B220 biotin (clone RA3-6B2) Biolegend 103204 T cell depletion cocktail
CD49b biotin (clone DX5) Biolegend 108904 T cell depletion cocktail
CD4 biotin (clone GK1.5) Biolegend 100404 T cell depletion cocktail
CD8 biotin (clone 53-6.7) Biolegend 100704 T cell depletion cocktail
F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated) Jackson ImmunoResearch  115-006-075 50 µl/well for coating (96-well)
Anti-mouse CD40 mAb (plate coated) Pharmingen  553722 50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-4 ProSpec  Cyt-282
LPS from E. coli Serotype 055:B5 Sigma Aldrich L-4005
Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated) eBioscience  16-0037-85 50 µl/well for coating (96-well)
Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated) eBioscience  16-0281-85 50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-2 ProSpec Cyt-370
Albumin from chicken egg white, Ovalbumin Sigma Aldrich A7641

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References

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Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 116 बी कोशिकाओं टी कोशिकाओं सेल शुद्धि अलगाव सक्रियण उत्तेजना CFSE लेबलिंग
अलगाव और murine लिम्फोसाइटों के सक्रियण
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Lim, J. F., Berger, H., Su, I. h.… More

Lim, J. F., Berger, H., Su, I. h. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. J. Vis. Exp. (116), e54596, doi:10.3791/54596 (2016).

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