Abstract
Questo protocollo descrive la generazione di un tridimensionale (3D) ex vivo modello fegato e la sua applicazione allo studio e sviluppo di sistemi di vettori virali. Il modello è ottenuto ripopolamento matrice extracellulare di fegato di ratto decellularized con una linea cellulare di epatociti umani. Il modello consente di studi in un sistema di celle 3D vascolarizzato, in sostituzione di esperimenti potenzialmente dannose con gli animali viventi. Un altro vantaggio è la natura umanizzata del modello, che è più vicino alla fisiologia umana rispetto ai modelli animali.
In questo studio, dimostriamo la trasduzione di questo modello fegato con un vettore virale derivato da virus adeno-associato (AAV vector). Il circuito di perfusione che fornisce il modello di fegato 3D con i media fornisce un facile mezzo per applicare il vettore. Il sistema consente il monitoraggio dei principali parametri metabolici del fegato. Per ultima analisi, campioni di tessuto possono essere adottate per determinare il grado di recellularizazione mediante tecniche istologiche. Distribuzione del vettore del virus e l'espressione del transgene consegnato può essere analizzato mediante PCR quantitativa (qPCR), Western blotting ed immunoistochimica. Numerose applicazioni del modello vettore nella ricerca di base e nello sviluppo di applicazioni terapeutiche gene può essere immaginato, compreso lo sviluppo di nuove terapie antivirali, ricerca sul cancro, e lo studio di vettori virali e loro potenziali effetti collaterali.
Protocol
NOTA: RL ottenuto l'approvazione etica per l'espianto di organi dal Landesamt für Gesundheit und Soziales (LAGeSo). I fegati sono stati espiantati da ratti Wister. La vena cava inferiore e la vena porta del fegato sono stati cannulata con una cannula 22 G. Metodi per la decellularization di fegati espiantati sono stati descritti in precedenza. 4,5 Le matrici extracellulari usati qui sono stati ottenuti da eccessiva perfusione di fegato di ratto con desossicolato di sodio 1%.
1. Recellularization di matrice extracellulare (ECM) di un fegato di ratto
- Ampliamento della linea di cellule epatiche HepG2
- Culture linea cellulare HepG2 carcinoma epatocellulare in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplementato con 10% di siero fetale di vitello, 2 mM glutammina, e 2 mM di penicillina e streptomicina, ogni.
- Seed 1.5 x 10 7 cellule in bottiglie T175 e crescere le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 2.
- Centrifugare le cellule a 300 xg e risospendere in 4 ml di PBS e contare le cellule con una camera di Neubauer sotto un microscopio. Una bottiglia T175 produrrà circa 4,5 x 10 7 cellule.
NOTA: Assicurarsi che la cultura contiene il numero di cellule sufficiente per Recellularization della ECM fegato di ratto con 6 x 10 8 cellule HepG2 per ECM (10 x 175 cm 2 fiasche di coltura con 4-5 x 10 8 cellule ciascuno).
Figura 1. sistema di bioreattore. A) Questo sistema di bioreattore è stato realizzato su misura. Mantiene i modelli di organo a 37 ° C e 5% CO 2. Le portate delle pompe peristaltiche possono essere regolati singolarmente. B) Il fegato è posto in una camera di crescita e collegareed al circuito di perfusione, che consiste in una pompa peristaltica, un serbatoio di media, un gorgogliatore e un sensore di pressione. prego qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Recellularization della ECM
- Impostare il sistema di bioreattore, contenente una camera di perfusione del fegato, un sistema di perfusione, un serbatoio di media e un gorgogliatore. Sterilizzare il sistema di bioreattore (121 ° C, 15 min).
- Collegare il sistema bioreattore con una pompa peristaltica e collocarlo in una incubatrice prevedendo condizioni adeguate (37 ° C, 5% CO 2). Posizionare decellularized scaffold fegato di ratto 8 nella camera di perfusione del fegato del sistema bioreattore (Figura 1).
- Collegare la vena porta cannulato e vena cava con clip tubo al sistema di perfusione. Equilibrare scaffold con 150 ml di RPMI medio (come descritto in 1.1)oltre 5 d con una portata di 1,25 ml / min.
- Scollegare il ponteggio fegato dal circuito media e inoculare il ponteggio con 3 x 10 8 cellule HepG2 (in 5 ml) attraverso la vena porta utilizzando una siringa da 5 ml, evitando la formazione di bolle d'aria e consentire alle cellule di ripopolare ECM incubandoli per 1 hr nel scaffold con la pompa spenta.
- Aumentare gradualmente la portata regolando la pompa, a partire da 1,25 ml / min per 10 min; 2,5 ml / min per 20 min e infine 3.75 ml / min per 30 min.
- Ripetere i punti 1.2.4-1.2.5 per raggiungere un numero di cellule totale di 6 x 10 8.
- Eseguire il sistema bioreattore ad una portata di 3,75 ml / min. Cultura del fegato di ratto recellularized per 2 settimane.
NOTA: Sostituire un terzo del mezzo con terreno fresco (50 ml) a giorni alterni. Campione mezzo di coltura per rilevare parametri fisiologici, come l'attività di lattato deidrogenasi, il pH dei campioni medi e la concentrazione di glucosio e lattato.
2. La trasduzione del Recellularized fegato di ratto
- Produzione su larga scala di AAV vettori
- Produrre, purificare, e quantificare vettori AAV come descritto in precedenza: 11
- In breve, la produzione di vettori AAV in bottiglie a rulli e purificare da iodixanolo gradiente di centrifugazione. Rimuovere iodixanolo residua mediante filtrazione su PD10 colonne di filtrazione di gel. Determinare la concentrazione AAV vettore per qPCR utilizzando DNA genomico AAV come standard.
NOTA: L'auto-complementare, pseudotyped AAV2 / 6 vettore utilizzato in questo studio codificato EmGFP come reporter per dimostrare l'efficienza di trasduzione e di una cassetta di espressione shRNA per l'atterramento di un gene endogeno espresso (cyclophilin umano B (hCycB), figura 2) . Garantire una quantità sufficiente di vettori scAAV pseudotyped di sierotipo 6 (2,7 x 10 13 AAV vettori per modello del fegato).
- In breve, la produzione di vettori AAV in bottiglie a rulli e purificare da iodixanolo gradiente di centrifugazione. Rimuovere iodixanolo residua mediante filtrazione su PD10 colonne di filtrazione di gel. Determinare la concentrazione AAV vettore per qPCR utilizzando DNA genomico AAV come standard.
- Produrre, purificare, e quantificare vettori AAV come descritto in precedenza: 11
Figura 2. Mappa del auto-complementari, pseudotyped AAV2 / 6 vettore utilizzato nel presente studio. Il genoma consiste delle ripetizioni terminali invertite (ITR) di AAV2 e codifica EmGFP sotto controllo del promotore CMV e un shRNA sotto controllo di un promotore U6. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- La trasduzione del fegato Modello
- Regolare la soluzione AAV vettoriale in una concentrazione finale di 2,7 x 10 13 genomi vettoriali in 5 ml aggiungendo il rispettivo volume di PBS.
- Scollegare il fegato dal circuito supporti rimuovendo il tubo dalla cannula. Collegare una siringa da 5 ml alla cannula della vena porta e iniettare la soluzione AAV vector completa (5 ml).
NOTA: Optionally, aggiungere rosso fenolo (5 mg / ml) per seguire la distribuzione della soluzione AAV vector tutto il fegato. - Incubare per 1 ora, senza pompaggio. Aumentare gradualmente portata, iniziando con 1,25 ml / min per 10 min; 2,5 ml / min per 20 min e 3,75 ml / min per 30 min. Cultura del fegato di ratto recellularized oltre 6 giorni.
Nota: sostituire un terzo della media come indicato nella nota sotto 1.2.7
3. Valutazione del Fegato Recellularized trasdotte Rat
- Ematossilina e eosina (HE) colorazione e analisi immunoistochimica
- Prendere campioni (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) da ciascun lobo epatico utilizzando un bisturi.
- Incubare campioni (da 3.1.1) in 4% paraformaldeide (PFA) + soluzione di saccarosio 4% per 1,5 ore a 4 ° C. (Attenzione: PFA è tossico e cancerogeno Tenere sempre PFA all'interno di una cappa aspirante e indossare indumenti di protezione adeguati..) Lavare tre volte con PBS (1 min per la fase di lavaggio) e incubare a 8%durante la notte di saccarosio a 4 ° C.
- Versare il fissaggio di media in cryomolds plastica, posizionare i campioni in fissaggio mezzo privo di bolle d'aria. Aggiungere mezzo di fissaggio fino campione è ben coperto. Conservare i campioni incorporato a -80 ° C fino a nuovo uso.
- Preparare crio-sezioni (10 micron) con una cryotome 12. Valutare Recellularization da ematossilina eosina + 8. Valutare l'efficienza di trasduzione dalla colorazione immunoistochimica per l'interesse gene-di-(qui: EmGFP).
- prelievo di campioni biologici molecolare
- Campione ciascun lobo fegato con un punzone biopsia (4 mm di diametro). Isolare RNA totale, DNA e proteine in base alle istruzioni del produttore per la valutazione di espressione del transgene di EmGFP, e hCycB abbattere 8.
Representative Results
Per la valutazione della portata del Recellularization, crio-sezioni sono state preparate da ogni lobo di ogni modello di fegato recellularized. Le sezioni sono state poi analizzate con ematossilina ed eosina. Come si vede in figura 3, ciascun lobo dei tre modelli fegato, indicato nel TLM1, TLM2 (trasdotte modelli fegato 1 +2) e CTRL (modello di fegato controllo che è stato recellularized, ma non trasdotte), sono stati ripopolata con cellule HepG2. Questa linea di cellule di carcinoma epatocellulare è stata istituita dal tessuto tumorale di un 15-anno-vecchio ragazzo argentino. Alcune aree dei modelli di fegato sono stati più intensamente recellularized di altri. Le ragioni di queste variazioni restano da determinare.
Figura 3. ematossilina e eosina di ogni lobo dei tre analizzati modelli di fegato TLM1 + 2:. Fegato trasdottemodelli 1 e 2; Ctrl .: modello di fegato di controllo che è stato recellularized ma non trasdotto. barra della scala: 200 micron. (Ristampato con il permesso di Rif. 8.) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Nella fase successiva, la trasduzione dei modelli di fegato è stata valutata. A tal fine, il DNA è stato preparato da 28 biopsie di ciascuno dei modelli fegato e il titolo vettoriale è stato quantificato mediante qPCR. In media, 55 e 90 interiorizzati genomi vettoriali per cella (VG / cell) sono stati misurati per i due modelli di fegato trasdotte. Gli esperimenti in coltura cellulare 2D hanno dimostrato 30 VG / cella sono sufficienti per una forte espressione del transgene e silenziamento RNAi-mediata. Produzione di EmGFP è stato analizzato mediante RT-PCR e Western blotting. Infatti, l'espressione del reporter è stata rilevata nel 80-90% delle biopsie sui livelli di mRNA e proteine, rispettivamente.8 Per ottenere un quadro completo della efficienza di trasduzione, crio-sezioni sono state analizzate immunoistologico. Come visibile in figura 4, le aree del modello fegato che erano recellularized successo, come visualizzato dalla colorazione DAPI, anche dato segnali fluorescenti forti nell'analisi immunoistochimica dell'espressione EmGFP. Come previsto, il modello di fegato di controllo, non trattato con vettori AAV, non ha mostrato alcuna espressione EmGFP.
Figura 4. L'analisi immunoistochimica di espressione EmGFP cellule che ripopolato i modelli di fegato sono stati visualizzati da colorazione DAPI (blu).; espressione EmGFP è stato visualizzato mediante colorazione immunochimica (rosso). TLM1 + 2: modelli di fegato trasdotte 1 e 2; Ctrl .: modello di fegato di controllo che è stato recellularized ma non trasdotto. barra della scala: 200 micron. (Ristampato con il permessoda Ref. 8.) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
In un test finale, atterramento AAV-mediata di hCycB è stato analizzato mediante qRT-PCR. Il colpo di hCycB è risultato essere tra il 70 e il 90%, come media di tutti lobi dei due modelli fegato trasdotte (Figura 5).
Figura 5. RNAi mediata Knockdown di hCycB in modelli 3D del fegato AAV-trasdotte. Silenziamento di hCycB è stata determinata da qRT-PCR. valori medi e deviazioni standard (SD) sono stati calcolati per tutti i campioni di ciascun modello fegato 3D trasdotte (TLM1 e 2, rispettivamente) e normalizzato al valore medio del controllo non trasdotte (Ctrl.). (Ristampato con il permesso di Ref. 8.) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
I fegati 3D ricostituiti qui descritte forniscono un modello per studiare vettori virali in un sistema umanizzato. Ripopolamento della ECM di un fegato di ratto con una linea cellulare di carcinoma epatocellulare umano genera un sistema vascolarizzato che consente lo studio di grandi biologici. Questi risultati forniscono una prova di concetto che il modello fegato ricostituita può essere trasdotto in modo efficiente con un vettore virale.
Per gli esperimenti qui riportati, ogni lobo del fegato è stato trasdotto dal vettore AAV. Tuttavia, in alcuni esperimenti preliminari, singoli lobi non sono stati ripopolati con cellule. È quindi importante impedire detriti cellulari o altri componenti da occludere il sistema vascolare. Per verificare se tutti i lobi possono essere perfusi, un colorante non tossico come rosso fenolo può essere lavata attraverso il modello fegato.
Un'altra questione fondamentale è mantenere l'impalcatura del fegato sterile. Mentre il trattamento con etanolo o antibiotici è disadvantageous per il sistema vascolare, l'irradiazione della matrice extracellulare con γ-radiazioni conservato i vasi e sterilizzato il campione.
Inoltre, la dimensione di fegati espiantati sarà diverso, in modo che il numero di cellule utilizzate per la procedura Recellularization e il tempo ripopolamento può essere regolato per ottenere risultati riproducibili.
I fegati di ratto utilizzate nel presente studio sono relativamente grandi e richiedono grandi quantità di cellule e reagenti (ad esempio, vettori AAV). Inoltre, la procedura di ripopolamento impiegato più di due settimane. Ciò limita il numero di repliche che può essere fatto con uno sforzo ragionevole. Attualmente stiamo stabilendo il modello per il fegato di topo, che sono solo circa un quinto del volume di fegato di ratto, che consente l'uso di un minor numero di cellule e meno reagenti. Anche se proporzionale scala verso il basso del numero di cellule sembra ragionevole, gli importi esatti devono essere determinati in furti suoi esperimenti.
Un altro inconveniente del presente modello è l'uso della linea cellulare HepG2 epatocellulare. Gli esperimenti sono in corso per sviluppare l'uso di epatociti differenziati da cellule staminali pluripotenti indotte, che fornirà un modello fisiologicamente più rilevanti. Inoltre, il fegato è costituito da diversi tipi di cellule in aggiunta agli epatociti, ad esempio, cellule di Kupffer e sinosoids. Partiamo dal presupposto che i diversi tipi di cellule potranno ripopolare i loro ambienti naturali quando un ECM è recellularized con più tipi di cellule.
Il modello 3D del fegato combina diversi vantaggi. Uno svantaggio dei tradizionali modelli in vivo è che la fisiologia animale differisce sostanzialmente da fisiologia umana. effetti collaterali tossici del trattamento di un paziente umano possono quindi rimanere inosservato. Questa carenza può essere superato ricostituendo il modello di fegato 3D con le cellule umane che riflettono più da vicino la biologia della hupazienti uomo.
Il secondo vantaggio del modello di fegato è il suo contributo al benessere degli animali. Anche se i componenti di origine animale sono necessari per gli esperimenti di ricostituzione, l'approccio segue ancora le finalità del principio 3R (sostituzione, riduzione, perfezionamento), come animali in eccesso possono essere usati che sono stati sacrificati per altri esperimenti su animali, cioè, non sono necessari altri animali e l'approccio evita completamente sofferenza degli animali, che è frequentemente associata con gli esperimenti in vivo. Sferoidi sono uno strumento alternativo per studiare processi cellulari in un sistema 3D. Tuttavia, sferoidi non sono vascolarizzati modo che le grandi sostanze e biologici non penetrano in profondità nelle parti interne della struttura. Questi problemi sono stati superati con il modello di fegato 3D vascolarizzato.
Negli esperimenti descritti qui, vettori AAV sono stati indagati, dal momento che sono tra i candidati più promettenti per gene terapeuticoapplicazioni. Come numerosi geni approcci terapeutici mirano a colpire il fegato, per esempio, per il trattamento delle infezioni da virus dell'epatite o di deficit di alfa-1-antitripsina, il fegato 3D può essere utilizzato nel processo di sviluppo questi AAV vector. È, ovviamente, anche per lo studio di altri vettori virali epatotropi, per esempio, vettori adenovirali. Inoltre, può essere usato per studiare virus dell'epatite infettive come l'epatite B o C virus. Può, ad esempio, essere utilizzato per progettare nuove strategie antivirali. Inoltre, i modelli di organi in 3D rappresentano strumenti promettenti per lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento di citostatici cancro e di effettuare studi tossicologici. Sul lungo periodo, fegati artificiali possono essere utilizzate nella medicina rigenerativa come trapianti. Presi insieme, il modello fegato 3D offre una vasta gamma di applicazioni in biologia infezione e altri campi di ricerca biomedica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Fraunhofer | / | |
| Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
| Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
| O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
| Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
| Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
| Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
| Screw Cap | Duran | 2924013 | |
| Screw Cap | Duran | 2924008 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
| Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
| Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
| Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
| Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
| T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
| RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
| glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
| Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
| penicillin/streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
| fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
| HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
| Cryomold 15 x 15 x 5 mm | Sakura | 4566 | |
| Biopsy punch 4 mm | pfm medical | 48401 | |
| Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
| Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |
References
- Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes. Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).
- Butler, D., Callaway, E. Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal. Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).
- Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029 (2015).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).
- Wagner, A., et al. Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors. J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).
- Kay, M. A. State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).
- Yla-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard. Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).
- Takagi, H., et al. Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR. J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).
