Abstract
Este protocolo descreve a geração de uma imagem tridimensional (3D) modelo ex vivo de fígado e sua aplicação para o estudo e o desenvolvimento de sistemas de vectores virais. O modelo é obtida por repovoar a matriz extracelular de um fígado de rato descelulada com uma linha de células de hepatócitos humanos. O modelo permite estudos num sistema de células 3D vascularizado, substituindo experiências potencialmente prejudiciais com animais vivos. Outra vantagem é a natureza humanizada do modelo, o que está mais perto de fisiologia humana do que os modelos animais.
No presente estudo, nós demonstramos a transdução do fígado com este modelo um vector viral derivado de vírus adeno-associados (AAV vector). O circuito de perfusão que fornece o modelo de fígado em 3D com a mídia proporciona um meio fácil de aplicar o vetor. O sistema permite a monitorização dos principais parâmetros metabólicos do fígado. Para análise, amostras de tecido pode ser feita para determinar a extensão de recellularização por meio de técnicas histológicas. Distribuição do vector de vírus e a expressão do transgene entregue pode ser analisada por PCR quantitativa (qPCR), transferência de Western e imuno-histoquímica. Numerosas aplicações do modelo vector em pesquisa básica e no desenvolvimento de aplicações de terapia génica pode ser visionado, incluindo o desenvolvimento de novas terapias antivirais, a investigação do cancro, e o estudo de vectores virais e os seus efeitos secundários potenciais.
Protocol
NOTA: RL obtido aprovação ética para a explantação de órgãos do Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Os fígados foram explantadas de ratos Wistar. A veia cava inferior e a veia porta do fígado foram canulada com uma cânula de 22 L. Os métodos para a descelularização de fígados explantados foram 4,5 As matrizes extracelulares aqui utilizados foram obtidos por perfusão excessiva de um fígado de rato com 1% de desoxicolato de sódio descrito anteriormente..
1. Recellularization da Matriz Extracelular (ECM) de um rato fígado
- Expansão da hepática HepG2 linha celular
- Cultura da linha celular de carcinoma hepatocelular HepG2 no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, glutamina 2 mM, e 2 mM de penicilina e estreptomicina, cada.
- Semente 1,5 x 10 7 células em frascos T175 e crescer as células a 37 ° C e 5% de CO 2 2.
- Girar as células a 300 xg e ressuspender-los em 4 ml de PBS e contar as células com uma câmara de Neubauer sob um microscópio. Um frasco T175 irá produzir cerca de 4,5 x 10 7 células.
NOTA: Certifique-se a cultura contém o número de células suficientes para recelularização do ECM fígado de rato com 6 x 10 8 células HepG2 por ECM (10 x 175 cm 2 frascos de cultura com 4-5 x 10 8 células cada).
Figura 1. Sistema de biorreator. A) Este sistema biorreator foi feito por encomenda. Mantém os modelos de órgãos a 37 ° C e 5% de CO 2. Os caudais das bombas peristálticas pode ser regulado individualmente. B) O fígado é colocado numa câmara de crescimento e ligared ao circuito de perfusão, que consiste de uma bomba peristáltica, um reservatório médio, uma armadilha de bolhas e um sensor de pressão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Recellularization do ECM
- Configure o sistema de biorreator, contendo uma câmara de fígado de perfusão, um sistema de perfusão, um reservatório de meio e um borbulhador. Esteriliza-se o sistema de bioreactor (121 ° C, 15 min).
- Ligar o sistema de biorreactor com uma bomba peristáltica e colocá-lo em uma incubadora proporcionar condições adequadas (37 ° C, 5% CO 2). Coloque descelularizados andaimes de fígado de rato 8 na câmara de perfusão do fígado do sistema de bioreactor (Figura 1).
- Ligue a veia porta e veia cava canulada usando grampos de tubo ao sistema de perfusão. Equilibrar andaime com 150 ml de meio RPMI (como descrito em 1.1)durante 5 d com um caudal de 1,25 ml / min.
- Desligue o andaime fígado de circuito os meios de comunicação e inocular o andaime com 3 x 10 8 células HepG2 (em 5 mL) através da veia portal utilizando uma seringa de 5 ml, evitar a formação de bolhas de ar e permitir que as células para repovoar a ECM através da sua incubação durante 1 hr no andaime com a bomba desligada.
- Aumentar gradualmente a taxa de fluxo através do ajuste da bomba, começando com 1,25 ml / min durante 10 min; 2,5 ml / min durante 20 min e, finalmente, 3,75 mL / min durante 30 min.
- Repita os passos 1.2.4-1.2.5 para atingir um número de células total de 6 x 10 8.
- Executar o sistema de bioreactor com um caudal de 3,75 ml / min. Cultura do fígado de rato repovoados por 2 semanas.
NOTA: Substituir um terço do meio com meio fresco (50 ml) a cada dois dias. Amostra do meio de cultura para medição dos parâmetros fisiológicos, tais como a actividade de lactato desidrogenase, o pH de amostras do meio e da concentração de glucose e lactato.
2. A transdução do repovoados de Fígado de Rato
- Produção em larga escala de AAV vetores
- Produzir, purificar e quantificar os vectores de AAV, tal como descrito anteriormente: 11
- Resumidamente, produzir vectores AAV em garrafas de rolos e purificá-los por centrifugação em gradiente de iodixanol. Remover o iodixanol residual por filtração em colunas PD10 filtração em gel. Determinar a concentração de vector de AAV por qPCR utilizando ADN genómico de AAV como um padrão.
NOTA: O auto-complementar, pseudotipado AAV2 / 6 vector utilizado no presente estudo codificado EmGFP como um repórter para demonstrar a eficácia de transdução e uma cassete de expressão de shRNA para o knockdown de um gene expresso endogenamente (ciclofilina B humana (hCycB), Figura 2) . Certifique-se de uma quantidade suficiente de vetores scAAV pseudotipados de serotipo 6 (2,7 x 10 13 vectores AAV por modelo de fígado).
- Resumidamente, produzir vectores AAV em garrafas de rolos e purificá-los por centrifugação em gradiente de iodixanol. Remover o iodixanol residual por filtração em colunas PD10 filtração em gel. Determinar a concentração de vector de AAV por qPCR utilizando ADN genómico de AAV como um padrão.
- Produzir, purificar e quantificar os vectores de AAV, tal como descrito anteriormente: 11
Figura 2. Mapa do auto-complementar, pseudotipado AAV2 / 6 vector utilizado no presente estudo. O genoma consiste em as repetições terminais invertidas (ITR) de AAV2 e codifica EmGFP sob o controlo do promotor de CMV, assim como um shRNA sob controle de um promotor U6. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- A transdução do fígado Modelo
- Ajustar a solução de vector de AAV para uma concentração final de 2,7 x 10 13 genomas vectoriais em 5 mL através da adição do respectivo volume de PBS.
- Desligue o fígado a partir do circuito dos meios de comunicação através da remoção do tubo da cânula. Ligar uma seringa de 5 ml para a cânula da veia porta e injectar a solução de vector de AAV completo (5 ml).
NOTA: OptionallY, adicionar vermelho de fenol (5 ug / ml) a seguir a distribuição da solução de vector de AAV por todo o fígado. - Incubar durante 1 hora, sem bombeamento. Aumentar gradualmente a taxa de fluxo, começando com 1,25 ml / min durante 10 min; 2,5 ml / min durante 20 min e 3,75 ml / min durante 30 min. Cultura do fígado de rato repovoados mais de 6 dias.
NOTA: Substituir um terço da média tal como consta da nota sob 1.2.7
3. Avaliação do Fígado repovoados transduzidas Rat
- Hematoxilina e eosina (HE) e Análise imuno-histoquímica
- Tome amostras (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) de cada lóbulo do fígado usando um bisturi.
- Incubar as amostras (a partir de 3.1.1) em 4% de paraformaldeído (PFA) + solução de sacarose a 4% durante 1,5 horas a 4 ° C. (Atenção: PFA é tóxico e cancerígeno Sempre mantenha PFA dentro de um exaustor e usar vestuário de protecção adequado..) Lavar três vezes com PBS (1 min por etapa de lavagem) e incubar em 8%durante a noite em sacarose a 4 ° C.
- Despeje fixação meio para cryomolds plástico, coloque as amostras em que fixa livre meio de bolhas de ar. Adicionar meio de fixação até amostra é bem cobertos. Loja incorporado amostras a -80 ° C até à sua utilização.
- Preparar material crio-secções (10 mm) com um Criótomo 12. Avaliar recelularização pela hematoxilina + eosina 8. Avaliar a eficiência de transdução por coloração imuno-histoquímica para o interesse gene-de-(aqui: EmGFP).
- amostragem biológica molecular
- Amostra de cada lobo do fígado com um perfurador de biopsia (4 mm de diâmetro). Isolar RNA total, DNA e proteínas de acordo com as instruções do fabricante para a avaliação da expressão do transgene de EmGFP e hCycB derrubar 8.
Representative Results
Para a avaliação da extensão da recelularização, crio-secções foram preparados a partir de cada lóbulo de cada modelo de fígado repovoados. As secções foram depois analisadas por hematoxilina e eosina. Como pode ser visto na Figura 3, cada um dos lóbulos dos três modelos de fígado, denotado como TLM1, TLM2 (transduzidas modelos fígado 1 2) e Ctrl (modelo de fígado de controle que foi repovoados, mas não transduzidas), foram repovoada com células HepG2. Esta linha celular de carcinoma hepatocelular foi estabelecida a partir do tecido tumoral de um menino argentina 15 anos de idade. Algumas áreas dos modelos de fígado foram mais intensamente do que outras repovoados. As razões para estas variações continuam a ser determinado.
Figura 3. hematoxilina e eosina de cada lóbulo dos três analisados modelos de fígado TLM1 + 2:. Fígado transduzidasmodelos 1 e 2; modelo de controle de fígado Ctrl .: que foi repovoados mas não transduzidas. Barra de escala: 200? m. (Re-impresso com a permissão da Ref. 8.) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
No passo seguinte, a transdução dos modelos de fígado foi avaliada. Para este fim, o ADN foi preparado a partir de 28 biópsias de cada um dos modelos de fígado e o título de vector foi quantificada por qPCR. Em média, 55 e 90 genomas vectoriais internalizadas por célula (VG / célula) foram medidas para os dois modelos de fígado transduzidas. Experiências em cultura celular 2D têm mostrado 30 VG / célula são suficientes para a expressão do transgene forte e silenciamento mediado por RNAi. Produção de EmGFP foi analisado por RT-PCR e transferência de Western. De facto, a expressão do repórter foi detectada em 80-90% das biópsias sobre os níveis de mRNA e proteína, respectivamente.8 Para obter uma imagem abrangente da eficiência de transdução, crio-secções foram immunohistologically analisados. Como pode ser visto na Figura 4, as áreas do modelo de fígado que foram repovoados com sucesso, tal como visualizado por coloração com DAPI, também deram fortes sinais fluorescentes na análise imuno-histoquímica de expressão EmGFP. Como esperado, o modelo de fígado de controlo, não tratados com os vectores de AAV, não mostraram qualquer expressão EmGFP.
Figura 4. A análise imuno-histoquímica de células que expressão EmGFP repopulated os modelos de fígado foram visualizadas por coloração com DAPI (azul).; EmGFP expressão foi visualizado por coloração com imunoquímico (vermelho). TLM1 + 2: modelos de fígado transduzidas 1 e 2; modelo de controle de fígado Ctrl .: que foi repovoados mas não transduzidas. Barra de escala: 200? m. (Re-impresso com permissãode Ref. 8.) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em um teste final, knockdown mediada por AAV de hCycB foi analisada por qRT-PCR. O knockdown de hCycB verificou-se ser entre 70 e 90%, em média, em todos os lóbulos dos dois modelos de fígado transduzidas (Figura 5).
Figura 5. knockdown mediada por ARNi do hCycB fígado em modelos 3D transduzidas com AAV. Silenciamento de hCycB foi determinada por qRT-PCR. Os valores médios e desvios padrão (SD) foram calculados para todas as amostras de cada modelo 3D fígado transduzidas (TLM1 e 2, respectivamente) e normalizadas para o valor médio do controlo não transduzidas (Ctrl.). (Re-impresso com a permissão de Ref. 8.) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Os fígados 3D reconstituídos descritos aqui fornecem um modelo para estudar vectores virais num sistema humanizado. Repovoamento da ECM de um fígado de rato com uma linha de células de carcinoma hepatocelular humano gera um sistema vascularizado que permite o estudo de grandes biológicos. Estes resultados dão uma prova de conceito de que o modelo de fígado reconstituída pode ser eficazmente transduzidas com um vector viral.
Para as experiências apresentadas aqui, cada lóbulo do fígado foi transduzida pelo vector de AAV. No entanto, em algumas experiências preliminares, foram lóbulos individuais não repovoada com células. Por conseguinte, é importante para evitar que os detritos de células ou outros componentes de oclusão do sistema vascular. Para testar se a todos os lóbulos pode ser perfundido, um corante não-tóxico, tal como vermelho de fenol pode ser lavada por meio do modelo de fígado.
Outra questão fundamental é manter o andaime fígado estéril. Embora o tratamento com antibióticos é etanol ou disadvantageous para o sistema vascular, a irradiação da matriz extracelular com γ-radiação preservou os vasos e esterilizados a amostra.
Além disso, o tamanho de fígados explantados será diferente, de modo que o número de células utilizadas para o processo e o tempo recelularização repovoamento pode ter que ser ajustada para se obter resultados reprodutíveis.
Os fígados de ratos utilizados no presente estudo são comparativamente grande e necessitam de grandes quantidades de células e reagentes de ensaio (por exemplo, vectores de AAV). Além disso, o processo de repovoamento levou mais do que duas semanas. Isso limita o número de repetições que pode ser feito com um esforço razoável. Estamos actualmente a estabelecer o modelo de fígado de rato, que são apenas cerca de um quinto do volume de fígados de rato, permitindo o uso de um número de células e reagentes de teste menos. Embora proporcional escala para baixo do número de células parece razoável, as quantidades exactas devem ser determinadas em furtseus experimentos.
Outra desvantagem do presente modelo é o uso da linha celular HepG2 hepatocelular. As experiências estão em curso para desenvolver o uso de hepatócitos diferenciados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas, que irá fornecer um modelo fisiologicamente mais relevante. Além disso, o fígado é constituído por vários tipos de células para além dos hepatócitos, por exemplo, células de Kupffer e sinosoids. Nós assumimos que os diferentes tipos de células vão repovoar seus ambientes naturais quando um ECM é repovoados com vários tipos de células.
O modelo de fígado 3D combina várias vantagens. A principal desvantagem do convencional em modelos in vivo é que fisiologia animal difere substancialmente da fisiologia humana. efeitos secundários tóxicos do tratamento de um paciente humano pode, portanto, permanecem sem serem detectados. Este defeito pode ser superado através da reconstituição o modelo 3D fígado com células humanas que reflecte mais intimamente a biologia de Hupacientes homem.
A segunda vantagem do modelo de fígado é a sua contribuição para o bem-estar animal. Embora os componentes de origem animal são necessários para as experiências de reconstituição, a abordagem ainda segue os objectivos do princípio 3R (substituição, redução, refinamento), como animais excedentes podem ser usados que foram sacrificados para outras experiências com animais, ou seja, não são necessários animais adicionais e a abordagem evita completamente o sofrimento dos animais, que é frequentemente associados com experimentos in vivo. Esferóides são uma ferramenta alternativa para estudar processos celulares em um sistema 3D. No entanto, não são esferóides vascularizado para que grandes substâncias e produtos biológicos não penetram profundamente nas partes interiores da estrutura. Estes problemas foram ultrapassados com o modelo de fígado 3D vascularizado.
Nas experiências aqui descritas, os vectores de AAV foram investigados, uma vez que estão entre os candidatos mais promissores para o gene terapêuticoaplicações. Como numerosos genes abordagens terapêuticas visando determinar um fígado, por exemplo, para o tratamento de infecções com os vírus da hepatite ou de deficiência de alfa-1-antitripsina, o fígado 3D pode ser utilizado no processo de desenvolvimento destes vector de AAV. É, claro, também adequadas para o estudo de outros vectores virais, por exemplo, hepatotrópicos vectores adenovirais. Além disso, ele pode ser usado para estudar os vírus das hepatites infecciosas, tais como vírus da hepatite B ou C. Ele pode, por exemplo, ser utilizada para conceber novas estratégias antivirais. Além disso, os modelos de órgãos 3D representam ferramentas promissoras para o desenvolvimento de novas terapias citostáticos para tratar o cancro e para a realização de estudos toxicológicos. No longo prazo, fígados artificiais podem ser usados na medicina regenerativa como transplantes. Tomados em conjunto, o modelo de fígado 3D oferece uma ampla gama de aplicações em biologia da infecção e outros campos da pesquisa biomédica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Fraunhofer | / | |
| Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
| Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
| O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
| Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
| Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
| Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
| Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
| Screw Cap | Duran | 2924013 | |
| Screw Cap | Duran | 2924008 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
| Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
| Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
| Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
| Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
| Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
| T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
| RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
| glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
| Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
| penicillin/streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
| fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
| HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
| Cryomold 15 x 15 x 5 mm | Sakura | 4566 | |
| Biopsy punch 4 mm | pfm medical | 48401 | |
| Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
| Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |
References
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