Summary
Protein interaktioner er kernen i en celles funktion. Kalorimetriske og spektroskopiske teknikker er almindeligt anvendt til at karakterisere dem. Her beskriver vi fluorescensanisotropi som et værktøj til at studere interaktionen mellem proteinet muteret i Shwachman-Diamond Syndrome (SBD'er) og elongeringsfaktor-like 1 GTPase (EFL1).
Abstract
Protein-protein interaktioner spiller en væsentlig rolle i funktionen af en levende organisme. Når en interaktion er blevet identificeret og valideret er det nødvendigt at karakterisere det på det strukturelle og mekanistiske niveau. Der findes flere biokemiske og biofysiske metoder til dette formål. Blandt dem, fluorescensanisotropi er en kraftfuld teknik anvendes især når fluorescensintensiteten af en fluorofor-mærket protein forbliver konstant ved protein-protein-interaktion. Ved denne teknik en fluorofor-mærket protein exciteres med vertikalt polariseret lys med en passende bølgelængde, som selektivt exciterer en delmængde af de fluoroforer efter deres relative orientering med den indkommende stråle. Den resulterende emission har også en retningsvirkning hvis forhold i de lodrette og vandrette planer definerer anisotropi (r) som følger: r = (I VV -I VH) / (I VV + 2I VH), hvor jeg VV og jeg
Introduction
Celler indeholder et væld af biomakromolekyler der konstant interagerer med hinanden. Denne forening giver anledning til komplekser, der deltager i cellulære veje, der er ansvarlige for deres funktion i signaltransduktion, regulering af genekspression og cellevandring blandt andre. Alle protein-protein interaktioner, der forekommer i en celle omfatter et netværk kendt som interactome. I Saccharomyces cerevisiae mere end 70% af dets proteiner er blevet vist at have interagerende partnere 1. Forståelse af interactome af en celle og deres funktioner give relevante oplysninger om den kompleksitet og mangfoldighed af levende organismer. Adskillige metoder er blevet beskrevet til at identificere og karakterisere protein-protein interaktioner. Anderledes højkapacitetsscreening metoder såsom gær-to-hybrid 2, protein-fragment komplementerings- assays 3, affinitetsoprensning 4 koblet til massespektrometri og protein microarrays anvendes til at identificere en interaktion 5,6. Når identificeret, er det nødvendigt at validere det og kan variere fra sag til sag. Typisk er disse eksperimenter involverer forstyrre interaktionen selv på niveau med de enkelte medlemmer af samspillet parret, fx ved gen-sletning eller overekspression af et af proteinerne, og derefter på udkig efter ændringer i egenskaber eller funktion af det andet medlem ved celleniveau. Efterfølgende biofysiske teknikker 7 anvendes til at karakterisere protein-protein-interaktion på det molekylære niveau. Til dette formål er strukturen af proteinkomplekser bestemt ved røntgenkrystallografi, kernemagnetisk resonans og cryo-elektronmikroskopi mens kalorimetri og fluorescensspektroskopi anvendes til kvantitativt og mekanistisk beskrive dem.
I dette arbejde blev fluorescensanisotropi anvendt som en teknik til at karakterisere vekselvirkningen mellem GTPase EFL1 og SBDS-protein. Disse proteiner deltager i syntesen af ribosomer ved at fremme frigivelsen af eukaryot initieringsfaktor 6 fra overfladen af 60S ribosomale subunit 8. Den SBD'er proteinet er muteret i en sygdom kendt som Shwachman-Diamond Syndrome 9 og virker som en guanin nukleotid udveksling faktor for EFL1 faldende dets affinitet for Guanosindifosfat 10,11. Sygdomstilstande mutationer i SBD'er afskaffe interaktion med EFL1 og dermed forhindre dens aktivering.
Fluorescensanisotropi er almindeligt anvendt i biologiske anvendelser til at studere protein-peptid eller protein-nukleinsyre-interaktioner. Den er baseret på princippet om, at en fluorofor ophidset med polariserede lys resulterer i en delvist polariseret emission. Fluorescensanisotropi er defineret ved ligning 1:
hvor jeg VV og jeg VH er denfluorescensintensiteter af den vertikalt (VV) og horisontalt (VH) polariseret emission, når prøven er spændt med lodret polariseret lys 12. Fluorescensanisotropi er følsom over for faktorer, der påvirker hastigheden af den roterende diffusion af fluoroforen og således afhænger af temperaturen, viskositeten af opløsningen og den tilsyneladende molekylstørrelse af fluoroforen. Den tilsyneladende størrelse af et protein indeholdende en fluorofor øges, når den interagerer med et andet protein og en sådan ændring kan derefter evalueres som en ændring i anisotropi. Mere specifikt vil en fluorofor, der roterer langsomt i opløsning i forhold til dets fluorescerende levetid har et stort I VV værdi og lille I VH-værdi, og derfor vil udvise en relativt stor anisotropi. For fluoroforer der tumler hurtigt i forhold til deres fluorescerende levetid, jeg VV og jeg VH vil være ens og deres anisotropi værdi vil være små 12 (Figur 1). Endvidere for en god anisotropi signal-støj måling, er det nødvendigt at have en fluorofor med en fluorescenslevetid ligner rotationskorrelationstiden af molekylet af interesse. Ellers er det ikke muligt præcist at registrere forskellen i anisotropi mellem den frie protein og at i komplekset. F.eks anisotropien af en fluorescerende probe med en levetid tæt på 4 ns såsom fluorescein eller rhodamin bundet til en forbindelse med lav molekylvægt på 100 Da er 0,05. Binding til et molekyle på 160 kDa vil øge sin anisotropi værdi til 0,29; en forskel, der kan måles nøjagtigt. I modsætning hertil vil den samme fluorescerende probe involveret i en bindingsreaktion hvis forøgelse molekylstørrelse varierer fra 65 til 1.000 kDa kun resultere i en anisotropi ændring på 0,28 til 0,3, som er for lille til at blive målt nøjagtigt. I dette scenario vil en sonde med en levetid på 400 ns være mere passende 12.
Figur 1. Skematisk gengivelse af det udstyr, der anvendes til at måle fluorescens-anisotropi og proceduren. Skematisk afbildning af udstyr, der anvendes til at udføre et protein-protein-interaktion eksperiment måling af fluorescens-anisotropi. Fluoroforer der tumler hurtigt display lille anisotropi, der øger efter binding til en interaktion partner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fluorescens applikationer kræver tilstedeværelsen af en fluorofor i nogen af de undersøgte molekyler. For at undersøge protein-protein interaktioner er der tre typer af fluoroforer: 1) de tryptophanrester stede i proteinerne, 2) kemisk forbundet fluoroforer og 3) fluorescerende fusionspartnere såsom grønt fluorescerende protein (GFP) og dens derivativer. De fleste proteiner har tryptophanrester af strukturen, således den nemmeste måde at måle interaktion ved at overvåge ændringer i den tilsvarende fluorescens spektre eller ved at overvåge ændringer i fluorescensintensitet af de tryptophanrester. Dog kan tryptophanrester være til stede i begge proteiner komplicerer analysen. På den anden side, for en fluorofor at ændre sine fluorescerende egenskaber skyldes interaktion det skal være placeret på eller nær bindingsstedet og det kunne ændre på selve interaktion. Dette kræver særlig opmærksomhed ved brug af voluminøse fluoroforer såsom GFP. Hvis der kan anvendes ingen af disse fluorophorer til bindingsundersøgelser er det nødvendigt, da, at indføre ekstrinsiske fluoroforer til en af de involverede proteiner. Der findes mange kemisk syntetiserede fluorophorer og kan være kovalent bundet til proteiner via deres reaktive grupper såsom aminogrupper (sidekæde af lysiner eller N-terminus) og thiolgrupperne i cystein. Fluorophore derivater med isothiocyanatgrupperne og succinimidylestere reagerer med amidgrupper mens iodacetamid og maleimid er thiol-reaktive grupper 13. De mest almindelige farvestoffer, der anvendes i fluorescens applikationer er derivater af fluorescein og rhodamin grønne farvestoffer, coumariner, BODIPY fluoroforer og Alexa Fluor farvestoffer. En detaljeret liste over kommercielt tilgængelige fluorophorer og deres anvendelse kan findes i referencer 14,15. For vellykket mærkning, skal den reaktive gruppe eksponeres på overfladen af proteinet, men på grund af det store antal reaktive funktionelle grupper typisk er til stede i polypeptider er det meget svært at få stedspecifik modifikation. Proteinet af interesse i denne undersøgelse, SBD'er, indeholder 5 gratis cysteiner og 33 lysiner der kan resultere i flere mærkning site. Ikke-ensartet mærkning kan påvirke bindende og vil komplicere dataanalyse som forskellige fluoroforen molekyler kan fremkalde forskellige fluorescerende intensitet signaler efter binding. Overcome dette problem, brugte vi blitzen fluoroforen, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein til site-direkte etiketten SBD'er protein. Dette er en arsenoxide farvestof med en høj affinitet for fire adskilte cysteiner i et motiv kender som Flash-tag bestående af sekvensen CCXXCC hvor X er andet end cystein 16,17 aminosyre. Denne tetracysteine motiv tilsættes til N- eller C-terminalen af proteinet ved gensplejsning sammen med en passende linker til at forhindre forstyrrelse af den samlede foldning af proteinet. Parret bestående af Flash farvestof og Flash-tag blev oprindeligt designet til stedspecifikke label proteiner i levende celler 17, men det kan også bruges til at mærke oprensede proteiner in vitro som det er eksemplificeret her. Yderligere er enzymatiske strategier også blevet udviklet for at muliggøre stedspecifik funktionalisering af proteiner 18.
I dette manuskript beskriver vi nytten af fluorescensanisotropi asa værktøj til at studere protein-protein-interaktioner. Binding kan vurderes ved simpel inspektion af bindende kurveform mens kan fås kvantitative oplysninger fra pasningen af eksperimentelle data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SBD'er-Flash tag Protein Expression og oprensning
BEMÆRK: anisotropien eksperimenter, en flash-tag svarende til sekvensen Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys blev tilsat til C-terminalen af de humane SBD'er kodende sekvens ved PCR. Denne konstruktion blev subklonet ind i ekspressionsvektoren pRSET-A og transformeret til Escherichia coli C41-celler til at udtrykke et protein der koder for et N-terminalt hexahistidin tag (His-tag), de humane SBD'er kodende sekvens og en C-terminus Flash tag 10.
- SBD'er flash-proteinekspression
- Transformere kompetente E. coli C41 celler med plasmidet pRSET-HisSBDS flash ved hjælp af en standard varme chok-protokol 19. Plate cellerne i faste Luria-Bertani (LB) medium suppleret med 100 ug / ml ampicillin. LB fast medium sammensætning består af 10 g NaCl, 5 g gærekstrakt, 10 g trypton og 20 g agar i 1 L volumen.
- Kultur transformerede bakterier ved 37 ° C, indtilabsorbans ved 600 nm (A 600) når 0,5-0,7 i 1 liter LB flydende medium suppleret med 100 ug / ml ampicillin.
- Inducerer proteinekspression ved tilsætning af 0,5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid til kulturen, og fortsætte inkubation i yderligere 5 timer.
- Opsaml den bakterielle suspension ved centrifugering ved 3.800 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten. På dette tidspunkt, enten gemme cellepelleten ved -20 ° C eller anvendes straks til proteinoprensning.
- SBD'er flash proteinoprensning
BEMÆRK: udføres Alle kromatografiske trin under anvendelse af en hurtig protein-væskekromatografi (FPLC) system eller en peristaltisk pumpe. Ni2 + -affinity chromatografi anvender en 5 ml Fast Flow kolonne. Anionisk bytningschromatografi anvender en 5 ml stærk sulfopropyl kationbytter-søjle. En strømningshastighed på 3 ml / minut blev anvendt til alle de kromatografiske trin.- Resuspender cellerne i 35 ml SBD'er Lysis buffer (50 mM phosphatbuffer pH 7,5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol) suppleret med 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og lyserer ved sonikering i en tid på 4 minutter under anvendelse cycler på 10 sekunder ON og 30 sek OFF, ved 4 ° C.
- Centrifugeres prøven ved 9.000 xg i 50 minutter ved 4 ° C.
- Hold supernatanten og kassér pellet at fjerne cellerester.
- Ækvilibrer Ni 2+ affinitetssøjlen med 3 søjlevolumener (CV) af SBD'er lysepuffer og indføre hele klarede supernatant på søjlen.
- Fjerne ubundet protein ved vask med 3 CV af SBD'er Lysis buffer og elueres med 3 CV af SBD'er Elution buffer (50 mM phosphatbuffer pH 7,5, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol).
- Fortynd eluerede protein 6-fold med 50 mM phosphatbuffer pH 6,5 og fjerne eventuelle aggregater ved filtrering gennem et 0,22 um cellulosemembran.
- Ækvilibrere den sulfopropylacrylat kationbytteren kolonne med 3 CV af Low salt S kolonnepuffer (50 mM phosphatpuffer pH 6,5, 50 mM NaCl) og indføre protein prøve fra det foregående trin.
- Vask ubundet materiale med 3 CV af lav salt S-søjle buffer og eluering af proteinet i et trin med 50 mM phosphatbuffer pH 6,5, 1 M NaCl.
- Fortynd eluerede protein 3.3-fold med 50 mM phosphatbuffer, pH 6,5. Koncentrer proteinet med ultrafiltreringsindretninger ved centrifugering ved 3.800 x g i 15 min. Flash fryse protein i flydende nitrogen og opbevar det ved -80 ° C indtil videre anvendelse.
- Verificer renheden af proteinet ved SDS-PAGE analyse og Coomassie farvning 20.
2. EFL1 Protein Expression and Purification
BEMÆRK: EFL1 blev udtrykt under regulering af Gal 1/10 divergerende promotor 21 og Saccharomyces cerevisiae MAT A 3'UTR i vektoren pRS426. Det rekombinante protein koder for den humane EFL1 isoform 1 fusioneret til et Tobacco Etch Virus protease (TEV) genkendelsessted og et hexahistidin-tag i den C-terminale ende.
- EFL1 proteinekspression
- Transform S. cerevisiae BCY123 celler med plasmidet pRS426-EFL1TevHis ved hjælp af en standard Lithium acetat protokol 22. Plate alle de transformerede celler i syntetisk frafald medier uden uracil (SD-URA) suppleret med 2% (vægt / volumen) glucose. Sammensætning af SD-URA medier består af 8 g gærnitrogenbase uden aminosyrer, 11 g casaminosyrer, 55 mg adeninsulfat, 55 mg tyrosin, 60 mg leucin og 60 mg tryptophan i 1 L volumen.
- Kultur transformeret gær ved 30 ° C, indtil A600 når 1,8 i 1 I SD-URA-medier suppleret med 0,5% (w / v) glucose.
- Inducerer proteinekspression ved tilsætning 2,8% (vægt / volumen) galactose til kulturen, og fortsætte inkubation i yderligere 18 timer ved 30 ° C.
- Opsaml gær suspensionen ved centrifugering ved 3.800 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten.På dette tidspunkt, enten gemme cellepelleten ved -20 ° C eller anvendes straks til proteinoprensning.
- EFL1 proteinoprensning
BEMÆRK: udføres Alle kromatografiske trin under anvendelse af et FPLC-system eller en peristaltisk pumpe. Ni2 + -affinity chromatografi anvender en 5 ml Fast Flow-søjle ved en strømningshastighed på 3 ml / min. Gelpermeationskromatografi bruger en 125 ml søjle præ-pakket med Superdex 200 harpiks ved en strømningshastighed på 1 ml / min.- Resuspender cellerne i 50 ml EFL1 lysepuffer (50 mM Tris-HCI pH 8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, 5 mM MgCl2, 10% glycerol) suppleret med 1 mM PMSF og 1 mM benzamidin og forstyrre cellerne ved friktion på en perle beater anvendelse af glasperler (Ø = 0,5 mm) i et samlet tidsrum på 6 minutter under anvendelse cyklusser af 2 min ON og 15 min OFF, ved 4 ° C.
- Centrifugeres prøven ved 9.000 xg i 50 minutter ved 4 ° C.
- Hold supernatanten og kassér pellet at fjerne cellerester. Ækvilibrer Ni 2+ affinitetssøjle den med 3 CV af EFL1 lysepuffer og indføre alle de klarede supernatant på søjlen.
- Fjerne ubundet protein ved vask med 3 CV af EFL1 Lysis buffer og elueres med 3 CV af EFL1 Elution buffer (50 mM Tris-HCI pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, 5 mM MgCl2, 10% glycerol).
- Ækvilibrere kolonnen størrelseseksklusion med 1,5 CV af Anisotropi buffer (50 mM Tris-HCI pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 5 mM β-mercaptoethanol).
- Koncentrer til 1 ml af EFL1 protein elueret fra Ni2 + affinitetssøjlen med ultrafiltreringsindretninger ved centrifugering ved 3.800 x g til det ønskede volumen. Indføre prøven på kolonnen størrelseseksklusion.
- Opsaml det eluerede protein og koncentreres ved ultrafiltrering til en slutkoncentration på ca. 30 uM. Flash fryse proteinet i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse. Bekræft the renhed af proteinet ved SDS-PAGE analyse og Coomassie farvning 20.
3. Mærkning af SBD'er blitz med Flash Fluorescent Dye 4 ', 5'-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein
- Bland 3 nmol af SBD'er-FlAsH protein med 3 nmol af 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein farvestof i 5 pi volumen Anisotropy puffer.
- Lad reaktionen fortsætte i 8 timer ved 4 ° C. Dialyseres prøven mod Anisotropy buffer i løbet af natten for at fjerne det frie farvestof.
- Brug Lambert-Beer at kvantificere% af mærkede protein. Absorbansen ved 280 nm og 508 nm i et spektrofotometer under anvendelse af en kvarts cuvette af passende størrelse. BEMÆRK: Overvej følgende molære absorptionskoefficienter (M -1 cm-1):
- Beregning af koncentrationen af mærket SBD'er-FlAsH protein under anvendelse af ligning 2.
- Beregn koncentrationen af total SBD'er protein under anvendelse af ligning 3 ved at substituere det beregnede C SBD'er flash fra foregående trin.
- Beregn procentdelen af mærkede protein ved anvendelse af ligning 4.
4. fluorescensanisotropi Eksperimenter
BEMÆRK: anisotropi eksperimenter blev udført i et spektrofluorometer udstyret med en polarisering værktøjskasse og dataindsamling blev udført ved anvendelse af anisotropi program tilvejebragt i softwaren af udstyret. Excitationsbølgelængden blev sat til 494 nm med en spektral båndbredde på 8 nm og emissionen blev registreret ved anvendelse af et båndpasfilter på 530 ± 25 nm. Målinger blev udført ved 25 ° C i en 200 pi kuvette med en 5 mm vejlængde 10.
- I en fluorescens cuvette, placere 200 pi 30 nM SBD'er-flash i anisotropi buffer og titrere 2 pi 30 pM EFL1. Bland grundigt og lade reaktionen stå i 3 minutter før måling af anisotropi værdi.
- Gentag trin 4.1, indtil et totalvolumen på 40 pi EFL1 er blevet tilføjet.
5. Data Analysis
- Monter data til relevante bindende model ved hjælp af en ikke-lineær mindste kvadraters regression algoritme. Ligningerne for de mest almindelige bindende modeller er vist i tabel 1.
- Evaluere den bedste model, der beskriver interaktionen mellem proteinerne ved at inspicere residualerne i fit 23. Støt den valgte model med yderligere eksperimenter.
Tabel 1. Fælles protein-protein interaktion bindende modeller og de matematiske ligninger, der beskriver dem.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af denne tabel. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At udføre nogen anisotropi eksperiment er det vigtigt at udelukke store ændringer i fluorescensintensitet af fluoroforen siden observerede anisotropi af en blanding af forskellige arter er repræsenteret af ligning 5:
hvor F i repræsenterer fraktioneret fluorescens af hver komponent og r i er den tilsvarende anisotropi. Den fraktionelle fluorescens af hver komponent afhænger af både, dets koncentration og dets relative fluorescens, som er defineret ved ligning 6:
hvor X i repræsenterer molfraktionen af the i'te specie og Ø i er kvante udbytte af det i'te specie.
Hvis fluorescensintensiteten ændrer sig dramatisk langs titreringen er det således bedre at enten måle kompleksdannelse som en funktion af ændringen i fluorescenssignal og ikke af anisotropien signal eller korrigere den observerede anisotropi værdi ved at montere både fluorescensintensiteten og anisotropien data. Fluorescensen af SBD'er-Flash understøtter ikke mærkbar forandring efter binding til EFL1 (figur 2) antyder, at fluorescensanisotropi er egnede til at måle bindingen mellem de to proteiner.
Figur 2. Fluorescens emission af SBD'er flash ved titreringen af stigende koncentrationer af EFL1. Ændringer i fluorescensemission af fluoroforen er negligible og tilfældige langs titrering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Et eksempel på fluorescensanisotropi bindende kurve opnået fra titrering af EFL1 til SBD'er-Flash er vist i figur 3. Kvalitativt formen af grafen viser klart, at de to proteiner interagerer som vist ved en forøgelse i anisotropi signal ved tilsætning af EFL1. Endvidere anisotropi værdier nåede et plateau antyder, at ved afslutningen af titreringen alle SBD'er flash-protein var til stede i et kompleks med EFL1. Det er muligt derefter, for kvantitativt at beskrive interaktionen mellem disse proteiner og passer til dataene ved hjælp af ikke-lineær mindste kvadraters regression til en formodet bindende model og opnå den tilsvarende dissociation ligevægtskonstant. Montering på et et bindingssted model ikke er passende,bart beskrive de eksperimentelle data (figur 3A). Dette er tydeligt ikke blot fra montering spor i bindingen kurven, men også fra afvigelserne af de rester af fit (forskellen mellem de teoretiske og eksperimentelle data), som er mærkbar og ikke-tilfældig. Dette stemmer godt med, at et enkelt bindingssted model beskrives matematisk ved en hyperbolsk kurve snarere end en S-formet kurve som den, der observeres for de eksperimentelle data præsenteret i figur 3. På den anden side, modeller såsom to identiske eller to forskellige binding sites beskriver bedre de eksperimentelle data og residualerne i fit viser nogen systematisk afvigelse støtte en to-site forening model (figur 3B-C). I mangel af andre eksperimentelle oplysninger er vanskeligt at fastslå, hvilke af de to modeller, svarer til den bindende mekanisme mellem EFL1 og SBD'er. Alligevel SBD'er og EFL1 er begge monomere proteiner, så det er difficult at forestille sig en to identiske bindingssteder model.
. Figur 3. Fluorescens anisotropi bindende isoterm af samspillet mellem EFL1 og SBD'er flash Den fuldt optrukne linje i hver af de øverste grunde svarer til fit af data til forskellige bindende modeller: (A) enkelt websted, (B) to identiske steder og (C) to ikke-identiske sites. Lavere plots repræsenterer rester af fit til den tilsvarende model. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fleste biokemiske eksperimenter med proteiner kræver ikke kun rent protein, men også store mængder af dem, uanset hvilken teknik der anvendes. Af denne grund er de proteiner, der anvendes til denne type eksperimenter opnået ved heterolog ekspression, som det var tilfældet præsenteres her. Fluorescens spektroskopi kræver tilstedeværelse af en fluorofor i den undersøgte molekyle. Aromatiske rester udgør iboende fluoroforer af et protein, men ved hjælp af deres signal for at studere protein-protein-interaktioner komplicerer analysen, da de er fælles for de fleste proteiner og ville være til stede i begge, receptorproteinet og liganden. Derudover er levetiden af tryptophan er for kort til fluorescensanisotropi eksperimenter. Af denne grund er det almindeligt at tilføje ydre fluoroforer til en af de undersøgte proteiner. Til dette formål blev en fluorofor tilsat til C-terminalen af SBD'er gennem en koordinering binding mellem farvestoffet 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein med en tetracysteine motiv indført i proteinet ved gensplejsning. Valg af det protein, der blotter fluoroforen er ikke en tilfældig anliggende. På grund af størrelsen af de undersøgte here (SBD'er 29 kDa og EFL1 127 kDa) proteiner, forventede vi en større ændring i anisotropi mellem fri mærket-SBD'er og at i kompleks med EFL1, sammenlignet med ændringen forventes mellem fri mærket-EFL1 og at bundet til SBD'er. Med dette in mente, var en Flash tag indført i SBD'er frem til EFL1. En anden parameter vigtigt at overveje, når oprettelse af en fluorescens anisotropi eksperiment er absorptionen af de løsninger, der anvendes. Den optiske densitet af opløsningen i kuvetten skal ikke være større end 0,1 ved excitations- og emissionsbølgelængden og bør forblive konstant langs hele titrering. Ellers kan indre filter effekt blande sig i målingen, og skal korrigeres for. I eksperimentet præsenteret her, de undersøgte proteiner ikke absorberer ved bølgelængden af excitation eller emission af 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein farvestof; dermed indre filter effekt ikke udgør et problem.
Med hensyn til indsamling af data, og efterfølgende passe dataene korrekt, er det nødvendigt at have veldefinerede nedre og øvre basislinjer med flere datapunkter gennem overgangen langs bindende kurve. Ellers montering af dataene er unøjagtige og oplysninger om bindende tilstand kan gå tabt. At beskrive en ordentlig binding kurve er det nødvendigt, at koncentrationen af fri ligand afviger med to logaritmiske enheder under og over dissociationskonstanten dog eksperimentelt dette kan være vanskeligt at opnå. I den nedre grænse, kan problemer med Udstyrets følsomhed opstår især når affiniteten mellem proteinerne er meget høj, medens store koncentrationer ikke kunne opnås grundet opløselighedsproblemer af liganden. Dette blev klart eksemplificeret ved test af samspillet mellem SBD'erS143L sygdom mutant og EFL1. Denne mutant forstyrret bindingen til EFL1 i en sådan grad, at det ikke var muligt at opnå en ordentlig binding kurve siden EFL1 kun kan koncentreres op til 70 uM, og proteinet bliver fortyndet ≈ 5 gange under titreringen 10. Det er således nødvendigt at have et groft skøn over affinitet for at optimere titrering ordningen og sørg for, at hopper i ligand-koncentration ikke forekommer på positioner, som ville medføre en mindre nøjagtig pasform. For eksempel vil mangler de første punkter af det bindende kurve vist i figur 3 gør det ligner en hyperbel vildledende forskeren på et fælles bindingssted model.
Når indsamlet, blev data monteret på en formodet bindende model. I sammenligning med fluorescensdata, kan anisotropi data anvendes uden yderligere manipulation og behøver ikke korrektion for fortyndingsvirkninger. Ligningerne præsenteret i tabel 1, at [L] ≈[L] 0 på hvert punkt af titreringen. Dette kan ikke ske, når affiniteten mellem proteinerne er meget høj, således at i de første punkter af titreringen ligand udtømning forekommer. I dette scenarie mere komplekse kvadratiske ligninger beskrevet andetsteds 23 er nødvendige for at tilpasse dataene. I eksperimentet beskrevet her, liganden EFL1 var altid stort overskud i forhold til koncentrationen af SBD'er-Flash og ændringen i EFL1 koncentration ved hvert punkt af titreringen kan ses bort fra. Som omtalt i resultatafsnittet, en to ikke-identiske bindingssteder model bedst beskrives de eksperimentelle data (figur 3C). Yderligere biokemisk oplysninger indhentet i gruppen støtter tanken om, at det er den rigtige model til at beskrive samspillet mellem EFL1 og SBD'er (data ikke vist). Denne tilstand af interaktion er almindelig i flere domæner proteiner, såsom EFL1 og SBD'er er, og der findes flere eksempler i litteraturen 24-26. Det er dog enLSO vigtigt at udelukke en ikke-specifik interaktion, der kan fremstå som en vekselvirkning model af distinkte bindingssteder med forskellige tilhørsforhold til deres ligand. Til dette formål en Scatchard plot er meget nyttig. Sammenlignet med andre teknikker, fluorescensanisotropi signal rapporterer mængden af dannede kompleks og det er således muligt at opbygge en Scatchard-afbildning med dataene. En konveks Scatchard kurve foreslår en to forskellige bindingssteder model med negativ kooperativitet eller ikke-specifik binding, mens en konkav Scatchard plot indebærer en to forskellige bindingssteder model med positiv kooperativitet eller ligand ustabilitet (figur 4). Analyse af de eksperimentelle data viste en Scatchard-afbildning med en konkav form understøtter den model af to uafhængige bindingssteder for EFL1 og SBD'er (figur 4D). Endvidere blev positiv kooperativitet bekræftet efter udførelse af en Hill-analyse, der resulterede i en Hill-koefficient-værdi på 1,8 ± 0,02 (data ikke vist).
Figur 4. Scatchard grunde til forskellige protein-protein binding modeller. (A) Single bindingssted eller flere identiske websteder, der ikke interagerer. (B) Multiple forskellige bindingssteder med negativ kooperativitet eller ikke-specifik binding. (C) Multiple forskellige bindingssteder med positiv kooperativitet eller ligand ustabilitet. (D) Scatchard plot som følge af analysen af de eksperimentelle anisotropi data fra titrering af EFL1 til SBD'er-blitz. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fluorescensanisotropi er en løsning baseret, sand-ligevægt teknik, der kræver de undersøgte molekyler at forblive i opløsning ved de testede betingelser. Det kan bruges til at studere påly interaktionen mellem proteiner i fuld længde, men også vekselvirkningen mellem proteindomæner, mutante proteiner eller endda peptider med post-translationelle modifikationer. Desuden kan fluorescensanisotropi også anvendes til at måle binding af proteiner til lipidmembraner under anvendelse af fluorescerende følsomme membraner prober. Denne fremgangsmåde er med held blevet anvendt til at undersøge den virkning, at a-synuclein har på synaptisk vesikel pakning 27. En af de vigtigste fordele ved fluorescensanisotropi, at den tilvejebringer kvantitative oplysninger om binding af de undersøgte molekyler, der kan opnås sande dissociationskonstanter sammen med mekanistisk information. Selv om andre biofysiske teknikker også kan anvendes til at opnå sådan information, fluorescensanisotropi kræver små mængder af prøven og kan udføres ikke kun i ligevægt, som præsenteres her, men også anvendelse af hurtige kinetik, såsom standset flow fluorometri, til opnåelse foreningen og dissociation ratekonstanter (k på og koff henholdsvis) 28. En sammenlignende tabel med de fordele og ulemper ved fluorescens anisotropi med hensyn til andre biofysiske teknikker er præsenteret i tabel 2. Alle de beskrevne metoder er sande-ligevægt teknikker, da ingen af dem omfatter en proces med mekanisk adskillelse af de frie og bundne fraktioner. Som nævnt i afsnittet om resultater, hvis fluorescensintensiteten af et mærket protein i høj grad ændrer ved interaktion, denne egenskab kan derefter anvendes til at kvantificere affiniteten af binding. Men ændringer i fluorescensintensitet som følge af interaktionen foreslå en mulig interferens af den extrinsiske fluorofor på det molekylære interaktion selv; nemlig en mulig ændring af dissociationskonstanten (Kd) -værdi på den tilsvarende ikke-mærkede proteiner. Som sådan kan fluorescensanisotropi betragtes som en mindre invasiv teknik end lmanges i fluorescensintensitet idet førstnævnte bør anvendes, når fluorescensintensitet ikke ændrer ved interaktion. I den forstand, selvom store mængder af proteinet er nødvendige, kan Isoterm Titrering kalorimetri (ITC) give en sand Kd-værdi af den molekylære interaktion, da det er en etiket fri metode. På den anden side er mekanistisk information ikke opnås på grund forskelle i varmen kun referat enthalpien af processen og ikke mængden af dannet kompleks 29.
Til sammenligning, in vivo-metoder, såsom gær to-hybrid eller fragment komplementerings- assays ikke kræver rensede proteiner, men de kun giver semi-kvantitative oplysninger om tilstanden af binding. Trods det faktum, at i gær-to-hybrid-teknik er muligt at udtrykke styrken af binding under anvendelse af Miller-enheder, er dette ikke en reel ligevægtskonstant og mange faktorer ud af kontrol af forskeren kan ændre den.
Tabel 2. Fordele og ulemper ved almindeligt anvendte biofysiske teknikker, der anvendes til at studere protein-protein interaktioner. Klik her for at se en større version af denne tabel. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris Base | Formedium | TRIS01 | Ultra pure |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein | ThermoFischer Scientific | LC6090 | This kit contains the dye to label a FlAsH tag |
| Ampiciline | IBI Shelton Scientific, Inc | IB02040 | |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Formedium | GLU03 | |
| D(+)-Galactose | Formedium | GAL03 | |
| L-Leucine | Formedium | DOC0157 | |
| L-Tryptofan | Formedium | DOC0189 | |
| Bezamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B6506-5G | |
| PMSF | Gold Biotechnology, Inc | P-470-25 | Phenylmethylsulfonyl fluoride |
| NaCl | Formedium | NAC02 | Sodium Chloride |
| Glycerol | Tecsiquim, S.A. de C.V. | GT1980-6 | |
| MgCl2 | Merck Millipore Corporation | 1725711000 | Magnesium Chloride |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-500G | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786-500G | Potassium phosphate dibasic |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139-500G | Sodium phosphate monobasic |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Yeast extract | Formedium | YEM03 | Micro Granulated |
| L-Tyroisne | Formedium | DOC0193 | |
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Casamino acids | Formedium | CAS03 | |
| Tryptone | IBI Shelton Scientific, Inc | IB49182 | |
| IPTG | Formedium | IPTG025 | |
| Filtration units | Merck Millipore Corporation | UFC901096 | Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa |
| Membrane Filter | Merck Millipore Corporation | GSWP04700 | Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain |
| Ni2+ affinity column | QIAGEN | 30760 | Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow |
| Strong Sulfopropyl cation exchanger column | GE Healthcare Life Science | 17-5157-01 | HiTrap SP Sepharose FF 5 ml |
| Size Exclusion column | GE Healthcare Life Science | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 PG |
| Fluorescence cell | Hellma Analytics | 111-057-40 | |
| Spectrophotometer | Agilent Technologies | G6860AA | Cary 60 UV-Vis |
| Shaker | ThermoFischer Scientific | SHKA4000-7 | MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C |
| Centrifuge | ThermoFischer Scientific | 75004271 | Heraeus Megafuge 16R |
| FPLC | Pharmacia Biotech | Discontinued | FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction |
| Spectrofluorometer | Olis | No applicable | Olis DM 45 with Polarization Toolbox |
References
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).
- Snider, J., et al. Fundamentals of protein interaction network mapping. Mol Syst Biol. 11 (12), 848 (2015).
- Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).
- Menne, T. F., et al. The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).
- Boocock, G. R., et al. Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome. Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).
- Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein. J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).
- Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Third, Springer US. (2010).
- Nishigaki, T., Treviño, C. L. Tools to understand protein-protein interactions. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).
- Johnson, I. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).
- Sabnis, R. W. Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. , Wiley. (2015).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
- Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches. Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences. Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Eftink, M. R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions. Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).
- Han, H., et al. Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs). J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).
- Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53. Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).
- Trusch, F., et al. The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97. J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).
- Kamp, F., Beyer, K. Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles. The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).
- Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics. Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).
- Asano, N., et al. Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).
