Aqui, descrevemos as configurações para monitorar em paralelo a bioluminescência circadiana e a atividade secretora das células das ilhotas humanas e miotubos primários. Para isso, empregamos a entrega do gene lentiviral de um repórter de relógio central de luciferase, seguido de sincronização in vitro e coleta de meio de saída por perifusão celular contínua.
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Artigo de método
Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
relógios circadianos são funcionais em todos os organismos sensíveis à luz, permitindo uma adaptação ao mundo externo, antecipando mudanças ambientais diárias. progressos consideráveis na nossa compreensão da estreita ligação entre o relógio circadiano e a maioria dos aspectos da fisiologia tem sido feito no campo ao longo da última década. Entretanto, desfazendo a base molecular que está na base da função do oscilador circadiano em humanos permanece mais elevada do desafio técnico. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de uma abordagem experimental para o longo prazo (2-5 dias) de gravação bioluminescência e coleta médio saída em células primárias humanas cultivadas. Para este fim, temos transduzidas células primárias com um repórter de luciferase de lentivírus que está sob o controle de um promotor do gene do núcleo do relógio, o que permite a avaliação paralela de secreção hormonal e bioluminescência circadiano. Além disso, descrevemos as condições para interromper o relógio circadiano no prcélulas humanas imary por transfecção siRNA CLOCK segmentação. Nossos resultados sobre a regulação circadiana da secreção de insulina pelas ilhotas pancreáticas humanas e Myokine secreção pelas células de músculo esquelético humano, são aqui apresentados para ilustrar a aplicação desta metodologia. Essas configurações podem ser usadas para estudar a composição molecular de relógios periféricos humanos e analisar o seu impacto funcional em células primárias em condições fisiológicas ou fisiopatológicas.
Introdução
O sistema de temporização circadiano (do latim "Circa diem") surgiu em todos os organismos sensíveis à luz, como um mecanismo adaptativo à rotação da Terra. Nos mamíferos, ele é organizado de uma maneira hierárquica, englobando o relógio central, que está situado no núcleo supraquiasmático do hipotálamo ventral e periférica (ou secundário) osciladores que se encontram em vigor nos diferentes órgãos. Além disso, estes osciladores autónomos auto-sustentadas de células são funcionais em quase todas as células do corpo 1. Sinais fóticas representam uma sugestão de sincronização dominante (Zeitgeber) para os neurônios SCN, enquanto que os sina....
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Protocolo
Declaração de ética: Manipulações incluídos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê do Hospital Universitário de Genebra de Ética e pela Comissão de Ética SUD EST IV (Acordo 12/111) 19. Ilhotas humanas foram isoladas de pâncreas de doadores de múltiplos órgãos com morte cerebral na Transplantation Centro Ilhota no Hospital Universitário de Genebra (Suíça), conforme descrito por nós em referências 16,18, ou obtidos de uma fonte comercial.
1. Preparação da cultura de células primárias
- Isolamento Islet humana Pancreatic, dissociação e Cultura
NOTA: Revestimento cada tubo, a ponta de plástico ou com....
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Resultados
Avaliação da Ilhota Hormone Secreção com Parallel circadiano Bioluminescência Gravar a partir de células Perifused ilhéus humanos
Depois de fornecer uma primeira caracterização molecular do relógio circadiano, operativo em células das ilhotas humanos 16, que teve como objetivo estudar o impacto da interrupção do relógio sobre a função das ilhotas e transcrição 18. Montamos um protocolo eficiente siClo.......
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Discussão
As configurações experimentais aqui descritos são compostos de fornecimento de lentivírus de repórteres bioluminescência circadianos em células primárias humanas cultivadas, seguido por sincronização subsequente in vitro e gravação contínua de bioluminescência durante vários dias, e a análise paralela de secreção da hormona pelas mesmas células. Eles representam uma abordagem eficiente para explorar os mecanismos moleculares e aspectos funcionais dos relógios circadianos em células primárias humanas.
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Somos gratos aos nossos colegas da Universidade de Genebra: Jacques Philippe para comentários construtivos sobre este trabalho, Ueli Schibler para ajuda inestimável com o desenvolvimento do sistema perifusão e de inspiração científica, André Liani para o ter concebido o projeto, fabricação e comissionamento de o sistema de perfusão, empresa Lesa-Technology LTD para a assistência no sistema perifusão e desenvolvimento de software Drip-biolumicorder, George Severi para assistência com os experimentos perifusão, Ursula Loizides-Mangold pela leitura crítica do manuscrito, e Anne-Marie Makhlouf para preparações lentivírus ; de Etienne Lefai, Stéphanie Chanon e Hubert Vida....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tripsina-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | Para digestão de biópsia muscular |
| DPBS sem cálcio sem magnésio | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | Para cultura de mioblastos |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Suplemento ao meio de cultura |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma | P0781-100 | Suplemento ao meio de cultura |
| Gentamicina | Axônio | A1492.0001 | Suplemento ao meio de cultura |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Anfotericina B, suplemento ao meio de cultura |
| DMEM 1g/L glicose + Na piruvato + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | Para cultura de miotubos |
| DMEM 1g/L glicose -Na Piruvato - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Meio de gravação para LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanil-L-glutamina dipeptídeo, suplemento ao meio de gravação |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Solução de desprendimento de células, para dissociação de células de ilhotas |
| CMRL | Gibco | 21530-027 Meio de | cultura para células de ilhotas |
| Pyruvate de Sódio | Gibco | 11360-039 | Suplemento para meio de cultura |
| 15 ml Tubo Cônico de Polipropileno de Alta Clareza | Falcon | 352096 | |
| F75 frasco | BD Falcon | 353136 | |
| placa de Petri de 3,5 cm | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Ativador de adenilil ciclase, usado para sincronização |
| Luciferina | Prolume LTD | 260150 | Suplemento para o meio de gravação |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Meio Essencial Mínimo (MEM) sem soro usado para transfecção de células de ilhotas humanas |
| Reagente Lipofectamine RNAiMAX Reagente | Invitrogen | 13778-150 | Reagente de transfecção |
| HiPerFect | Qiagen | 301705 | Reagente de transfecção |
| ON-TARGET mais siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET mais siRNA #1 não direcionado (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Kit de lenços de papel | Qiagen | 69504 | Para extração de DNA de miotubos |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | Para extração de RNA de miotubos |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | Para extração de RNA de miotubos |
| 2 ml tubos coletores | Axygen | 311-10-051 | Para coletar o meio com a perfusão |
| Placa de cultura de tecidos, 6 Poços | BD Falcon | 353046 | Para coletar o meio com o kit de perifusão |
| RNeasy Plus Micro | Qiagen | 74034 | Para extração de RNA de ilhotas |
| Kit ELISA instantâneo IL-6 humano | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Kit de Insulina Humana Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Ácido clorídrico, min,37%,a.a. | Acros organics | 124630010 | Usado para a preparação de tampão de lise (375 ml de etanol + 7,5% HCl + 117,5% H2O) |
| Etanol (>99,8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Usado para preparação de tampão de lise (375 ml de etanol + 7,5%HCl + 117,5% H2O) |
| Ilhotas humanas para laboratórios de pesquisa | Prodo | ||
| Nome | Company | Número de catálogo | Comentários |
| Equipamento: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Banho-maria | VWR | 1112A | em 37 & Capuz |
| de cultura C Tissu | Mais rápido | SafeFastElite | |
| Tissu | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 a 37 ° C, sem água devido à instalação do LumiCycle |
| Incubadora de culturas Tissu | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 a 37 ° C, sem água devido à instalação do LumiCycle |
| Incubadora de cultura Tissu | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 a 37 ° C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | Para agitação da mistura de siRNA |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| Software LumiCycle | Software Actimetrics | ||
| CosinorJ | EPFL | Disponível gratuitamente em: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Software de controle que controla o tempo da chave automatizada |
Referências
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of cent....
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Reimpressões e permissões
