Abstract
La plate-forme analyse d'expression génique permet une quantification robuste et hautement reproductible de l'expression de jusqu'à 800 transcrits d'ARNm (miARN) ou en une seule réaction. Le test miRNA compte transcriptions par imagerie directe et le comptage numérique des molécules de miARN qui sont étiquetés avec fluorescentes ensembles de sondes à code-barres de couleur (une sonde rapporteur et une sonde de capture). Barcodes sont hybridées directement à maturité miARN qui ont été allongés par ligature d'un marqueur oligonucléotidique unique, (miRtag) à l'extrémité 3 '. la transcription inverse et l'amplification de la transcription ne sont pas nécessaires. Reporter sondes contiennent une séquence de six positions de couleur peuplées par une combinaison de quatre couleurs fluorescentes. Les quatre couleurs sur six positions sont utilisées pour construire une séquence couleur code-barres spécifique du gène. le traitement post-hybridation est automatisée sur une station de préparation robotique. Après hybridation, les sondes en excès sont lavés, et les structures tripartites (capture probe-miARN-reporter sonde) sont fixés sur une lame revêtue de streptavidine via la sonde de capture marquée à la biotine. Imagerie et code à barres de comptage est effectué en utilisant un analyseur numérique. Les miARN sont immobilisés à code-barres visualisées et imagées en utilisant un microscope et de la caméra, et les codes-barres uniques sont décodés et comptés. contrôle de la qualité des données (QC), la normalisation et l'analyse sont facilitées par un logiciel de traitement et d'analyse de données sur mesure qui accompagne le logiciel d'analyse. L'essai démontre une linéarité élevée sur une large gamme d'expression, ainsi que de haute sensibilité. L'échantillon et la préparation de l'essai ne comporte pas de réactions enzymatiques, la transcription inverse, ou amplification; a quelques pas; et est largement automatisé, ce qui réduit les effets de l'enquêteur et résultant en grande cohérence et la reproductibilité technique. Ici, nous décrivons l'application de cette technologie pour identifier circulants perturbations miARN dans le syndrome du côlon irritable.
Introduction
Syndrome du côlon irritable (IBS) est le diagnostic ambulatoire le plus commun en gastro-entérologie, affligeant 10-15% de la population générale et qui représente un fardeau important sur les services de santé. Biomarqueurs diagnostiques Actuellement, il n'y a pas généralement accepté pour IBS (c. -à , le diagnostic repose sur les symptômes cliniques et au pouvoir d'autres troubles organiques, tels que les tumeurs gastro - intestinales, les maladies inflammatoires de l' intestin, et gastro - intestinal (GI) infections). Lors de l' étude des profils d'expression des gènes dans les conditions communes avec histopathologie subclinique, comme IBS, haute sensibilité et la précision (reproductibilité) sont nécessaires, comme des perturbations dans les profils d'expression des gènes sont souvent subtiles 1-3. miARN ont été identifiés comme les deux cibles diagnostiques et fonctionnelles dans IBS 4,5, et nous sommes particulièrement intéressés à évaluer leur utilisation comme biomarqueurs de l' IBS-associés perturbations biologiques 3,4,6,7 circulation. L'utilisation clinique de circulabiomarqueurs ting est d'actualité en raison de la facilité et de la nature peu invasive de la collection de la source de biomarqueurs (par exemple, le sang périphérique) provenant de patients.
Gene tests de plate-forme d'expression, en raison de leur composition chimique unique et rationalisé, workflow essentiellement automatisé, fournissent une plate-forme de puces à ADN qui offre une couverture large et personnalisable (800 cibles dans une seule réaction) du transcriptome pour la découverte ciblée. Ils donnent également une grande précision et linéarité sur un large éventail de niveaux d'expression dans la quantification des cibles transcriptomiques. Le dosage ne nécessite pas la transcription inverse de l'ARN, l'amplification de l'ADNc, ou d'autres réactions enzymatiques résultant. Ainsi, les erreurs éventuelles introduites par le nombre élevé de cycles d'amplification à partir d'espèces d'ARN ayant une faible abondance ou de variants d'épissage rares sont réduits par le procédé de comptage numérique. Cela signifie qu'une grande variété de types d'échantillons, tels que le total des purifiéARN (ie, ARNm + miARN), l' ARN à partir (FFPE) spécimens enrobés de paraffine fixés au formol, ainsi que des lysats de tissu brut et cellules, peut être utilisé avec les tests.
Les ARN d'intérêt sont détectés au moyen d'une paire de sondes (sondes de capture et reporteurs), chacune contenant une séquence spécifique d'une cible qui reconnaît une région correspondante de l'ARN cible. Afin d'assurer la détection des ARN courts (c. -à- miARN), la séquence miRNA mature est allongée par recuit d' un marqueur oligonucléotidique unique , (miRtag) à l' extrémité 3 'de la molécule. Un oligonucléotide de pontage, qui est complémentaire à une partie à la fois la cible mûre miRNA et la miRtag miRNA spécifique, est utilisé pour assurer une spécificité de séquence. Capture et journaliste sondes ligaturer à la 3 'et 5' extrémités du complexe miRNA-miRtag mature, respectivement. Les sondes de capture ont un marqueur de biotine à l'extrémité 3 ', qui leur permettent de se fixer à la surface d'une lame de verre revêtue de streptavidine, fixing le complexe de la sonde sonde-miARN-miRtag-reporter la capture à la diapositive. Un courant électrique est alors utilisé pour orienter le complexe sur la surface de glissement, ce qui permet des codes barres fluorescentes portées par la sonde rapporteur à l'extrémité 5 'à visualiser à l'aide d'un microscope et un dispositif à couplage de charge (CCD). Barcodes sont comptées et décodés, ce qui donne un nombre de miARN cibles spécifiques. Le code à barres fluorescent se compose de six positions qui peuvent être occupés par l'une des quatre couleurs fluorescentes, qui peuvent être utilisés pour construire plus de 4000 combinaisons couleur codes à barres, chaque codant pour un ARN spécifique.
La préparation des échantillons (c. -à- purification de l' ARN ou de cellules / tissus préparation de lysat), ainsi que l' hybridation des sondes de capture et de rapporteurs, sont effectués sur le banc. Douze échantillons peuvent être multiplexés sur une seule diapositive. Après l'hybridation pendant une nuit, tout en outre la préparation des échantillons est réalisée par une station de préparation robotisée. Les lames chargées sont ensuite transférées dans l'annonceanalyseur igital pour l'imagerie, le comptage, le décodage et le traitement des données. Les données obtenues sont importées dans le logiciel d'accompagnement, où elles sont traitées ultérieurement avec un degré élevé de contrôle de l'utilisateur. La chimie unique, préparation simple, nature automatisée, simple type de données (chiffres) et flux de travail rationalisé l'ensemble de l'essai facilitent haute précision l'expression du gène de quantification, ce qui en fait un outil utile dans l'étude de circulation des profils et des signatures d'expression miRNA dans des conditions fonctionnelles telles que IBS.
Protocol
La recherche décrite ici a été approuvé par la Commission de révision institutionnelle du National Institutes of Health (Clinicaltrial.gov # NCT00824941).
1. Prélèvement des échantillons de sang total
- Prélever des échantillons de sang total (2,5 ml) de participants à l'étude via venipuncture dans des tubes de collecte de sang contenant une solution d'ARN de stabilisation (permettant le stockage à long terme), et de les stocker à -80 ° C jusqu'à la purification de l'ARN.
2. ARN total Purification
- Décongeler et incuber les tubes de sang pendant 2 heures, puis centrifuger les utilisant un rotor swing-out pendant 10 min à 5000 x g. Eliminer le surnageant par le versant avec précaution ou pipetage hors tension dans un tube de déchets, en faisant attention de ne pas perturber le culot.
- Laver le culot en ajoutant 4 ml d'eau exempte de RNases, remplacer le bouchon en toute sécurité, et le vortex jusqu'à ce que le culot est visiblement dissous. Centrifugeuse à l'aide d'un rotor oscillant seau à 5000 xg pendant 10 min et redéplacer le surnageant, comme décrit dans l'étape 2.1.
- Ajouter 350 pi de tampon BM1 (fourni) à la pastille. Vortexer le culot jusqu'à ce qu'elle soit visiblement dissous et de le transférer dans un tube de traitement de 2 ml pour l'extraction automatique de l'ARN total.
- Effectuer une purification automatisée de l'ARN intracellulaire, y compris des miARN, à partir du sang total en utilisant un kit d'extraction d'ARN disponibles dans le commerce, qui peut être automatisée sur un système d'extraction d'ARN robotisé.
REMARQUE: Le système robotique automatisé, nous avons utilisé peut traiter douze échantillons à la fois, et il faut 3 heures pour le protocole de purification de l'ARN pour terminer.- Chargez les embouts de pipette pré-chargés, des tubes de centrifugation, des tampons et réactifs fournis dans le kit de purification d'ARN dans le système d'extraction d'ARN robotique.
- Sélectionnez le protocole "Blood miRNA partie A" dans le menu de sélection de protocole et commencer la course.
NOTE: Voir les matériaux supplémentaires pour une description des procédures automatisées. - Une fois que le robot a completed partie A du protocole de purification de miARN automatisé, vider le réceptacle à déchets et enlever les matières plastiques utilisées et les contenants de réactifs du système robotique.
- Fermez les couvercles sur tous les tubes micro-centrifugeuse contenant de l'ARN élue et les placer dans l'adaptateur de shaker. Sélectionnez "Blood miRNA partie B" dans le menu de sélection de protocole à incuber les échantillons à 65 ° C pendant 5 min.
- Une fois que le robot a terminé en cours d'exécution la partie B du protocole de purification de miARN, retirer immédiatement les échantillons et refroidir sur la glace.
- Quantifier et évaluer la qualité de l'ARN purifié en utilisant un spectrophotomètre.
REMARQUE: selon les recommandations du protocole pour l'essai miRNA, une concentration minimale de 33 ng / ul est nécessaire, et tous les échantillons devraient atteindre ou dépasser un ratio 280/260 de 1,9 et un ratio minimum de 1,8 260/230 pour assurer l'absence de contamination organique significative, ce qui peut affecter les performances (voir référence 17). - Conserver les échantillons à -80 o C.
3. miRNA Préparation d'échantillons
- Normaliser 12 échantillons d'ARN à 33 ng / ul avec de l'eau sans nucléase.
- Préparer une dilution 1: 500 des contrôles miRNA fournis dans le kit d'essai avec de l'eau sans nucléase. Gardez sur la glace.
- Préparer le mélange maître de recuit: combiner 13 pi de tampon de recuit (fourni), 26 ul de réactif miRtag (fourni), et 6,5 pi de contrôles miARN (préparé à l'étape 3.2) à l'aide de 10 et pipettes 20 ul.
- En utilisant une pipette 10 ul, ajouter 3,5 ul du mélange maître de recuit et 3 pl de l'échantillon d'ARN ( par exemple, 100 ng) à chacun des douze tubes 0,2 ml de la bande. Flick pour mélanger, centrifuger en utilisant une paillasse mini - microcentrifugeuse (2000 xg), et placer dans le thermocycleur (94 o C pendant 1 min, 65 ° C pendant 2 min et 45 ° C pendant 10 min; tenir à 48 o C) .
- Préparer le mélange maître de ligature en combinant 3 μl du tampon de ligature (fourni) et 19,5 ul de polyéthylène-glycol (PEG, à condition) à l'aide d'une pipette 20 ul. Ajouter 2,5 ul du mélange maître de ligature de chacun des tubes en forme de bande à l'étape 3.4 en utilisant une pipette 10 ul.
- Mélanger doucement, tourner vers le bas en utilisant un mini microcentrifugeuse de paillasse (2,000 xg), et revenir à la thermocycleur à 48 ° C pendant 5 min. Après 5 min, à l' aide d' une pipette 10 ul, ajouter 1 pi de ligase directement à chaque tube dans le thermocycleur et les incuber à 48 ° C pendant 3 min, 47 ° C pendant 3 min, 46 ° C pendant 3 min, 45 ° C pendant 5 min et 65 ° C 10 min; maintenir à 4 o C.
- Retirer les tubes du thermocycleur, les mélanger délicatement, tourner les vers le bas à l'aide d'un mini-paillasse microcentrifugeuse (2000 xg), et ajouter 1 pl de ligature enzymatique de nettoyage (fourni). Incuber les tubes dans le thermocycleur (37 o C pendant 1 heure et 70 o C pendant 10 min; maintenir à 4 o
- Retirer les tubes et, à l'aide d'une pipette de 100 pi, ajouter 40 ul d'eau sans nucléase, mélanger, et de spin bas à l'aide d'un mini microcentrifugeuse de paillasse (2,000 xg).
4. miRNA Hybridation
- Décongeler le journaliste et ensembles de sondes de capture (fournies) sur la glace et de spin-les en utilisant un mini microcentrifugeuse de paillasse (2,000 xg).
- En utilisant une pipette de 200 pi, ajouter 130 pi de tampon d'hybridation au code ensemble tube de reporter (130 pi) pour créer le maître de mélange d'hybridation. Mélanger et centrifuger à l'aide d'un mini microcentrifugeuse de paillasse (2,000 xg).
NOTE: Reporter et capture des sondes sont spécifiques et standard pour chaque miARN inclus dans le panneau. panneaux personnalisés et de capture et de jeux de sondes conçues par l'utilisateur peuvent être conçus. - Dans 12 nouveaux tubes de bande de 0,2 ml, ajouter 20 ul du maître d'hybridation mélange à l'aide d'une pipette de 20 pi.
- Dénaturer les échantillons miARN de l' étape 3.7 à 85 o C for 5 min et les refroidir sur la glace. Ajouter 5 ul de chacun des tubes de l'étape 4.3 en utilisant une pipette 10 ul.
- Programmer le thermocycleur à 65 o C à un volume calculé température et couvercle chauffant au moment jamais mise (ne pas le programmer à la rampe vers le bas à 4 o C à la fin de la course) de 30 pi.
- En utilisant une pipette de 10 ul, ajouter 5 pl de la sonde de capture fixé à chaque tube, mélanger, faire tourner le bas en utilisant un mini - paillasse microcentrifugeuse (2000 xg), et placer immédiatement dans le thermocycleur à 65 o C. Incuber pendant pas moins de 12 heures et pas plus de 30 heures.
Station de préparation 5. et analyseur numérique
- Charger la station de préparation.
- Ouvrez la porte de la station et charger les plaques de réactifs (fourni), la cartouche (fourni), embouts de pipette (fournies), les échantillons préparés dans douze 0,2 ml tubes de bande, et douze vides 0,2 ml tubes de bande (fourni). Retirer les capuchons de tubes de bande et couvercle de la plaque de réactif. Fermez la prep stationporte et exécuter le dosage approprié à partir du panneau de commande.
NOTE: Le traitement post-hybridation est le même, quel que soit le test en cours d'exécution. Tous les réactifs et articles en plastique sont préemballées et ne nécessitent pas de préparation, autres que les amener à la température ambiante et centrifugeant les plaques à 96 puits contenant un réactif à 2000 g pendant 2 min. Tous les composants sont chargés dans des positions clairement définies dans la station de préparation. Voir les matériaux supplémentaires pour une description des procédures automatisées.
- Ouvrez la porte de la station et charger les plaques de réactifs (fourni), la cartouche (fourni), embouts de pipette (fournies), les échantillons préparés dans douze 0,2 ml tubes de bande, et douze vides 0,2 ml tubes de bande (fourni). Retirer les capuchons de tubes de bande et couvercle de la plaque de réactif. Fermez la prep stationporte et exécuter le dosage approprié à partir du panneau de commande.
- Visualiser et compter les codes-barres des complexes tripartites immobilisés et orientés.
- Retirez la cartouche de la station de préparation, le sceller avec les lamelles fournies, et le placer dans l'analyseur numérique dans la fente au-dessus de l'optique de la caméra.
- Sélectionnez le dosage approprié (dosage du panneau miRNA) et la version d'essai indiquée sur le kit de dosage et exécuter le programme.
NOTE: L'analyseur numérique prend alors champ de vision des images pour chaque échantillon position at quatre longueurs d'onde d'excitation, permettant aux codes à barres fluorescentes pour être lus et décodés. codes à barres spécifiques, correspondant à un miRNA spécifique, sont comptés. - Exporter les fichiers de données à un port USB ou directement au serveur via une connexion internet.
6. Traitement et analyse des données
- Cliquez sur l'onglet "Données brutes" et sélectionnez "Importer des fichiers RCC". Sélectionnez le dossier contenant les fichiers RCC (fichiers de données brutes) à partir du port USB.
- Cliquez sur "Suivant", sélectionnez toutes les cases QC, et cliquez sur "Importer".
- Cliquez sur l'onglet "Nouvelle étude". Nommer et décrire l'étude et économisez.
- Dans la nouvelle étude, sélectionnez l'onglet "Nouvelle Expérience" et le nom et décrire la nouvelle expérience. Cliquez sur "Suivant" et sélectionnez le dossier RLF dans le volet gauche qui contient les fichiers bruts pertinents de données qui ont été téléchargés. Une fois qu'il a été sélectionné, cliquez sur "Keep Selected", puis cliquez sur "Suivant".
- Ajouterannotations si vous le souhaitez et cliquez sur "Suivant".
- Sélectionnez la méthode de soustraction de fond; soit témoin négatif, vide voie soustraction ou une soustraction définie par l'utilisateur peuvent être sélectionnés. Une fois sélectionné, cliquez sur "Suivant".
NOTE: Déterminer l'approche la plus appropriée de correction de fond sur la base des paramètres techniques et le contexte biologique de l'étude.
NOTE: Les chiffres sont moins précis pour les cibles de faible abondance. Aux fins de l'étude, nous décrivons ici, les données ont été d'abord traité sans correction de fond afin d'examiner QC paramètres et d'examiner la variation de compte pour miRNA des différentes abondances à travers les répétitions techniques. Les données ont ensuite été retraitées en utilisant un seuil de fond 25-count. - Sélectionnez le "Top 100" normalisation, puis cliquez sur "Suivant".
- Pour obtenir les données de rapport, sélectionnez les paramètres de rapport, puis cliquez sur "Suivant".
- Cliquez sur "Terminé".
- Cliquez sur l'ex nomméperiment dans le volet gauche pour faire apparaître un menu déroulant contenant "Raw", "Normalisé", "Regroupées", "Data Ratio" et "Analyse des données".
- Cliquez sur "données brutes" et d'observer un rapport QC dans le volet droit. Observer un drapeau à côté des échantillons qui ne passent pas les paramètres par défaut QC. Construire une nouvelle «étude» qui ne comprend pas les échantillons marqués et retraitent comme décrit, ou tout simplement exclure des échantillons battant pavillon QC de l'étape d'analyse de données en sélectionnant "Exclure des échantillons par QC / normalisation flag".
- Exporter des fichiers "bruts", "Normalisé", ou de données "groupés" dans CVS ou un autre format de fichier compatible pour l'analyse dans un autre logiciel statistique ou microarray.
- Sélectionnez "Data Normalisé" dans le volet gauche et sélectionner les échantillons à inclure dans l'analyse dans le volet droit.
- Cliquez sur «Analyse» et sélectionnez le type d'analyse souhaité (par exemple, "Heat Map & #34 ;, "Violin Plot", "Box Plot", "Scatter Plot", ou "Histogramme Plot"). Cochez les cases de critères d'exclusion souhaités (par exemple, exclure les échantillons aberrants ou des gènes, exclure les échantillons par QC drapeaux, exclure les gènes de contrôle, et / ou exclure les sondes de normalisation de l' analyse des données).
- Sélectionnez échantillons individuels à exclure de l'analyse comme souhaité.
- Sélectionnez gènes individuels à exclure de ou inclus dans l'analyse comme souhaité.
- Sélectionnez les paramètres pour la manipulation statistique ou la visualisation de données sélectionné et cliquez sur "Terminer".
Representative Results
perturbation transcriptomique dans les troubles fonctionnels peut être subtile, et afin de détecter de manière fiable les changements subtils dans l'expression, la quantification de l'expression génique doit être précis. Le système d'expression génique plate-forme de test réduit le bruit technique grâce à sa nature hautement automatisé, et la chimie unique qu'il utilise produit des données d'expression génique de haute précision. Technique réplicats montré à la figure 1 démontrent la reproductibilité élevée dans les deux (points bleus) endogènes et miARN viral (points orange; gènes de ménage sont représentés par des points jaunes) la quantification de l' expression qui est possible en utilisant cette méthode. En utilisant cette méthode, virale (figure 2a) et endogènes (Figure 2b) miARN qui montrent écart par rapport à l' expression attendue, telle que définie par les participants à l'étude en bonne santé, peuvent être identifiés comme des cibles d'intérêt dans IBS. Il convient de noter qu'il est difficile de savoir si les miARN virauxdétecter ici dérivent de gènes viraux intégrés dans le génome humain ou de la charge virale. Comme le test ne compte miARN matures ayant une spécificité de nucléotide unique, hybridation croisée avec miARN humains similaires endogènes est peu probable. Néanmoins, les niveaux d'état stable différentiels de ces molécules sont d'intérêt en tant que biomarqueurs. La précision de la méthode permet de perturbations parmi les cibles de faible expression à détecter, comme la détection précise de ces transcriptions ne sont pas submergés par des transcriptions plus abondantes. Perturbations subtiles peuvent également être observés de manière fiable. Les figures 3 et 4 montrent certains de ces perturbations en circulation miARN dans IBS et IBS sous-types par rapport à des témoins sains, et les figures 5 et 6 ( les deux adaptés de 3) montrer les deux miARN différentiellement élevées les plus importantes (Figure 5: miRNA 342-3p, Figure 6: miARN 150). chez les participants IBS Figure 6 est un exemple de sortie graphique des résultats générés par le logiciel associé.
. Figure 1: Comtes Normalisé de deux réplicats techniques technique réplicats exécuté sur deux cartouches séparées montrent une forte corrélation linéaire (r 2 = 0,90, y = 1,03 - 0,4) sur la plage de l'normalisé (normalisé au top 100 exprimé miARN) miRNA compte (chiffres de log2 sur le x- et y-axe). Le diagramme de dispersion comprend des données pour miARN humains endogènes en bleu (654 miARN), miARN viraux endogènes en orange (80 miARN), et les gènes d'entretien ménager en jaune (8 gènes). miARN viraux endogènes étaient disponibles sur les versions antérieures de l'essai (version 1.4 a été utilisé ici), mais ne sont plus inclus dans le test standard, même si elles sont disponibles comme ajouts personnalisés./54693fig1large.jpg "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Comtes Normalisé de Viral et Endogène miARN humain dans IBS-constipation (IBS - C) par rapport à des témoins sains Perturbations dans (a) virale (orange) et (b) miARN humains endogènes (bleu) sont évidents dans cet exemple, où chiffres de miARN (log2 transformées) des participants IBS-C (axe y) sont une régression par rapport aux chiffres de miARN (log2 transformé) de contrôles sains (axe des x). La majorité des miARN exprimer de manière très similaire dans les deux populations, mais certains écartent notamment de la corrélation. Ces écarts sont évidents entre les deux cibles rares et abondamment exprimés. S'il vous plaîtcliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. MiARN sont significativement et uniformément exprimés de manière différentielle dans IBS Par rapport aux contrôles sains différentiellement exprimé miARN dans IBS sont révélées en utilisant la méthode de la taille linéaire discriminante effet de l' analyse, qui combine les tests de signification statistique avec des contrôles de cohérence au sein des catégories. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. MiARN sont significativement et uniformément exprimés de manière différentielle dans IBS sous - types par rapport aux témoins sains miARN étaient differentially exprimé dans IBS sous-types (-D: diarrhée, -C: constipation). par rapport aux témoins sains en utilisant la méthode de la taille linéaire discriminante effet de l' analyse, qui combine les tests de signification statistique avec des contrôles de cohérence dans les catégories S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
Figure 5:. Expression différentielle des miRNA-342-3p douleur abdominale chronique d'étiologie inconnue est un symptôme principal de l' IBS. La boîte à moustaches montre que miR-342-3p (chiffres normalisés sur l'axe-y), un miARN associés à la douleur chronique de la vessie d'étiologie inconnue, a été trouvé à être présents en circulation à des numérations plus élevées dans tous les sous-types d'IBS par rapport à des témoins sains. Les barres représentent la gamme non-valeur aberrante, la boîtees la gamme inter-quartile et le carré bleu du nombre médian. Modifié à partir de 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Expression différentielle des miRNA-150 Une parcelle de violon montrant que les participants IBS avaient significativement plus élevé de circulation miR-150 chefs d' accusation par rapport aux témoins sains (log2 de comptages transformées sur l'axe des y).. Les courbes indiquent la fréquence des comptes dans la catégorie, les barres verticales représentent le 1 er et 3 e quartiles, et le carré rouge indique le nombre médian. Modifié à partir de 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Étapes critiques dans le Protocole
Pour le dosage de miARN en particulier, il est essentiel de ne pas utiliser des lysats non purifiés (ceux-ci peuvent être utilisés dans l'ARNm et des dosages de protéine), comme les réactifs ne sont pas optimisés pour une utilisation avec des lysats et les réactions de préparation d'échantillon est susceptible d'être inhibée. En outre, les contaminants transportés sur des étapes de lyse et de purification d' ARN (par exemple, des composés de guanidinium, l' éthanol et les phénols) peuvent inhiber la ligature et la purification de l' échantillon réactions. ARN de bonne qualité est donc essentielle à la sensibilité et la précision du dosage miARN.
En utilisant un thermocycleur avec un couvercle chauffé est essentielle pour assurer un contrôle adéquat de la température pour optimiser la performance de toutes les étapes de la réaction. Lors de l'étape 3.5.1, il est important de ne pas enlever les bandes du thermocycleur afin de maintenir la température au cours de l'addition de la ligase. Retrait des bandes pour ajouter le ligasecompromettra la réaction. Lorsque vous effectuez les étapes d'hybridation, il est essentiel d'éviter une agitation vigoureuse, pipetage ou chiquenaude lors du mélange des réactifs dans les tubes, comme cela peut cisailler les sondes rapporteurs. Pour garantir des performances optimales et de cohérence, il est important de bien mélanger les réactifs dans les tubes en tapotant doucement. Toujours tourner vers le bas des réactions après le mélange, et d'utiliser une nouvelle pipette pointe chaque fois un réactif est distribué pour assurer un pipetage précis et d'éviter la contamination croisée accidentelle.
Modifications et dépannage
Les jeux de codes peuvent être personnalisés pour inclure uniquement les cibles d'intérêt. De cette façon, les coûts peuvent être équilibrés pour permettre le test des grands ensembles d'échantillons lors d'enquêtes supplémentaires ou la validation d'un bio-signature. Les sondes de mesure peuvent être conçus pour des gènes ou des cibles non disponibles dans le menu à la carte. Sensibilité des cibles moins abondantes ou l'ARN à faible concentration peut êtremanipulé en permettant un temps d'hybridation plus longues et / ou en utilisant un comptage numérique à résolution plus élevée.
Dans notre étude, nous avons utilisé la 800 cible panneau miRNA prédéfini avec l'ARN total du sang total; Cependant, les essais peuvent être personnalisés pour inclure moins de miARN si une approche plus ciblée est nécessaire. Un total de 24 échantillons peuvent être préparés en une seule journée, en quinconce dans deux ensembles de 12, parce que deux cartouches peuvent confortablement être passés à travers le traitement post-hybridation sur la station de préparation robotique et imagés sur l'analyseur numérique le jour suivant. le traitement des échantillons en quinconce par lots de 12 est important de standardiser le temps d'hybridation. Les cartouches qui ont été imagées peuvent être enregistrées et conservées à 4 ° C pour être réanalysés si des analyses de données suggèrent qu'un scan de résolution plus élevée peut améliorer la détection des miARN plus rares. La détection de molécules rares peut également être améliorée en hybridant les échantillons pendant plus longtemps; Cependant, l'hybridation prolongée peut Result en sursaturation et ne peuvent améliorer les résultats si les concentrations d'ARN de départ sont bas (comme dans l'ARN des vésicules dérivé extracellulaire). La sensibilité et la précision de la plate-forme permettent relativement miARN faible abondance à compter de manière fiable.
Limites de la technique
L'expression du gène plate-forme de test décrit ne peut accueillir jusqu'à 800 cibles par tableau. Il est donc pas adapté pour les études de transcriptome entières toute miRNA-transcriptome /. Seulement connus, décrits, et les cibles spécifiées peuvent être détectés en utilisant la plate-forme, de sorte qu'il ne convient pas à la découverte de nouvelles espèces moléculaires. D'autres méthodes, telles que RNA-seq ou d'autres méthodes de microréseaux traditionnelles, sont plus adaptés à transcriptome ensemble des études exploratoires.
Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives
IBS est caractérisée par une combinaison de symptômes, priny compris palement douleurs abdominales; l'hypersensibilité viscérale; et les changements dans les habitudes intestinales, comme la diarrhée fréquente, la constipation, ou une combinaison des deux 9,10. Symptômes de l' IBS ont aucune cause organique connue, et les patients ne présentent pas d' une inflammation cliniquement significative, perturbations histopathologiques des tissus gastro - intestinaux, ou des marqueurs systémiques 9-12. La recherche suggère que la dysrégulation biologique dans IBS est subtile, subclinique, et hétérogène, avec des thèmes communs émergent autour de l' inflammation et la fonction immunitaire 10. Par conséquent, nous avions besoin pour contrôler la variation de expérimentateur introduit et utiliser une plate-forme qui a été capable de détecter de manière fiable des perturbations subtiles dans l'expression des gènes. Les caractéristiques uniques de l'essai et le système de normaliser le traitement des échantillons et réduire expérimentateur manipulation grâce à l'automatisation, ce qui réduit la variance technique pour produire des données hautement reproductibles. Ces caractéristiques permettent des enquêtes ciblées et produisent une grande précision et rdonnées eplicable. Ceci permet la détection des perturbations subtiles et les perturbations entre les cibles à faible expression qui peut être négligée ou submergés par les signaux de cibles plus abondants lors de l'utilisation intensity- ou à base d'amplification, des méthodes. microarrays basées sur la PCR et les méthodes sont RNA-seq alternatives viables à l'aide de la plate-forme décrite et peut être attrayant comme solution de rechange lorsque des débits plus élevés sont nécessaires ou lorsque l'objectif est de caractériser l'ensemble transcriptome ou à rechercher de nouvelles molécules. Toutefois, des alternatives peuvent ne pas fonctionner aussi bien dans la détection et la quantification des cibles rares et subtiles perturbations avec précision et sensibilité.
Applications futures ou les directions après Maîtriser cette technique
Circulant expression miRNA chez les participants IBS a montré un certain nombre de perturbations qui ont été trouvés être à la fois significative et cohérente au sein des catégories. Les miARN identifiés ont été associés à pathwa pertinentsys et conditions pathologiques, y compris une condition fonctionnelle de la douleur (miR-342-3p: la douleur chronique de la vessie) 8 et de l' inflammation (miR-150) 13. L'étude d'exemple a été basé sur une cohorte exploratoire utilisé pour définir des objectifs et des systèmes d'intérêt. Un plus ciblée, plus petite gamme miRNA a ensuite été construit, en abaissant le coût par échantillon et permettant beaucoup plus grandes cohortes à analyser d'une manière rentable afin de valider et d'affiner les signatures et les biomarqueurs. Le système de dosage de la plate - forme d'expression génique un équilibre entre la nature exploratoire traditionnelle du microréseau et plus ciblée, la collecte de données fondée sur une hypothèse pour affiner et tester les signatures et les biomarqueurs moléculaires 14-16. La méthode sera utilisée pour examiner les perturbations moléculaires et de protéines in vivo et in vitro dans des modèles où les miARN cibles décrites sont expérimentalement surexprimé ou inhibée. De nouveaux tests permettent la quantification simultanée des ARNm et proteins directement à partir de lysats cellulaires et tissulaires. En outre, en optimisant la purification de fractions spécifiques du sang périphérique et des excréta (par exemple, l' urine) et en personnalisant et en optimisant certains paramètres d'analyse, les profils moléculaires et les signatures de faibles fractions de concentration moléculaire (par exemple, des fractions exosomales) seront examinés.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1,000, 100, 20, 10 µl) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
References
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