Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

אפיון proteomic SILAC מבוסס של Exosomes מ- HIV-1 תאים נגועים

Published: March 3, 2017 doi: 10.3791/54799
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 3
1Brown University, 2COBRE Center for Cancer Research, Lifespan Laboratories, Rhode Island and Miriam Hospitals, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Warren Alpert Medical School, Brown University

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה פרוטאומיקה כמותית באמצעות טכניקה של תיוג איזוטופ יציב על ידי חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC) כדי לנתח את ההשפעות של זיהום HIV-1 על proteomes מארח exosomal. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם תאים בתנאי קיצון או זיהום שונים.

Introduction

מחל אנושיות רבות, כוללים זיהומים נגיפיים, הקשורים לעתים קרובות עם תהליכים תאיים ייחודיים המתרחשים בתוך ומסביב התאים הנגועים. חלבונים, לעיתים קרובות מתנהג כמו effectors הסלולר האולטימטיבי, לתווך תהליכים אלה. ניתוח של חלבונים יכול לעיתים קרובות לספק מידע רב ערך לגבי הסביבה המקומית של התאים הנגועים ולעזור לנו להבין את המנגנון הבסיסי של בהיווצרות המחלה. בין טכניקות ניתוח חלבון שונות, פרוטאומיקה מחזיקה במיוחד הבטחה גדולה. ככלי רב עוצמה, בקנה מידה גדול, פרוטאומיקה יכול לספק הבנה מערכתית של תהליכים תאיים, במיוחד בתחום של הפונקציה ואת האינטראקציה של חלבונים. ניתוח חלבונים ספציפיים נעשה פשוט יותר באמצעות הפיתוח של טכניקות תיוג, המאפשרות לחוקרים לעקוב אחר הביטוי של מרכיבים תאיים, במיוחד חלבונים, באתר של חקירה. למרות ניתוחים proteomic רבים בוצעו על הסלולרסולם proteome, אפיוני proteomic על תאי subcellular הוכיח להיות במיוחד אינפורמטיבי 1. זה בא לידי ביטוי גם במחקרים של הידבקות ב- HIV-1.

Exosomes, 30-100 שלפוחית קרום ננומטר המופרש על ידי מגוון רחב של סוגי תאים 2, 3, הם מרכיבים קריטיים של תקשורת בין תאית ותחבורה מולקולרית. הם התגלו בעבר למלא תפקידים חשובים בתהליך 4 ניצני HIV-1, 5. על ידי שילוב של ניתוח proteomic עם לנתיחה פונקציונלית, מצאנו כי exosomes שוחרר מבית HIV-1 תאים נגועים מורכב מולקולות רגולטוריות חתימה ונמל חלבון ייחודיות כמותית שונים המשפיעות תכונות הסלולר על תאי שכנים פתוחים, כוללים אפופטוזיס הסלולר ושגשוגם 6. השיטות מתוארות פרוטוקול זה,כלומר SILAC (תיוג איזוטופ יציב על ידי חומצות אמינו תרבית תאים) 7 אפיון proteomic מבוסס של exosomes מתאי נגועים ב- HIV-1. ניתן ליישם גישות דומות כדי להבין טוב יותר תאים subcellular אחרים בזמן בפתוגנזה ידי התאמת הלחץ ניסיוני לתא או חלק מסוים של עניין ולהפוך את השינויים הדרושים כדי ההליכים המתוארים.

בהינתן ההתפתחות האחרונה של שיטות proteomic כמוני, יש הרבה לבחירה בעת בחירת השיטה היעילה ביותר עבור ניסוי מסוים. ביניהם ניתן למנות את iTRAQ מבוסס הכימי (תגי isobaric כימות יחסית ומוחלטת) 8 ואת ללא התווית MRM (ניטור תגובה מרובה) 9 טכניקות. שתי השיטות הם כלים רבי עוצמה הם בחירה טובה עבור הגדרות ספציפיות. עבור מעבדה אופיינית בעיקר בעבודה עם שורות תאים, עם זאת, יש שתי שיטות אלה relatively עלויות גבוהות יותר והם יותר זמן רב בהשוואה לשיטה המבוססת SILAC. SILAC היא טכניקה תיוג מבוסס מטבולית המשלבת צורות איזוטופי nonradioactive של חומצות אמינו מן התקשורת והתרבות לתוך חלבונים תאיים. בדרך כלל, ניסויי SILAC להתחיל עם שתי אוכלוסיות תאים, למשל, נגוע נגוע. כל שכותרתו דיפרנציאלי בסביבת איזוטופים הספציפית שלה עד תיוג מלא מושגת. Exosomes שכותרתו של תאים אלה חשופים אז כדי מיצוי חלבון. לאחר שחולץ, חלבוני exosomal שכותרתו מנותחים באמצעות ספקטרוסקופיית מסות טנדם כרומטוגרפיה הנוזלית 10. לבסוף, את התוצאות ספקטרומטריית מסה וחלבונים שכותרתו משמעותית חשופים סטטיסטי וביואינפורמטיקה מנתח וכן אימות ביוכימיים קפדנית. התחקירים הקודמים שלנו מראים כי נהלי SILAC / exosome מתאימים יותר עבור שורות תאים מאשר תאים ראשוניים, כמו שורות תאים בדרך כלל נמצאותמדינה מתרבה פעילה עבור תיוג איזוטופי יעיל,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תא תרבות ו- HIV-1 זיהום

הערה: לפני שמתחילים ניסויים, מומלץ לבדוק את הכדאיות של התאים באמצעות Trypan כחול מכתים 11 ושגשוגם שלהם באמצעות assay MTT 12. זה גם קריטי להשתמש בינוני SILAC מוכן חדש. שורות תאים שונות ניתן להשתמש, כל עוד הם נמצאים בשלב שגשוג פעיל, והם רגישים זיהום HIV-1, או תנאי הבדיקה של בחירה. בפרוטוקול זה, השתמש שורת תאי H9 כמו בדוגמא.

  1. Seed 2 x 10 6 תאים H9 לתוך בקבוק אחד תרבית תאים. לגדול קבוצה אחת ב 10 מ"ל שכותרתו RPMI 1640 בינוני המכילה סרום שור 10% dialyzed העובר (FBS), 100 מ"ג / L 13 C 6 L-ליזין 100 מ"ג / L 13 C 6 15 N 4 L-arginine. לגדל את הקבוצה השנייה ב 10 מ"ל בינוני ללא תווית RPMI 1640, עם 10% dialyzed FBS, 100 מ"ג / L L- ליזין ו -100 מ"ג / L L- ארגינין.
  2. לגדל את התאים במשך שש הכפלות ובנקודת החלבונים של התאים במדיום שכותרתו כמעט מסומנים לגמרי (> 99%) עם חומצות אמינו כבדות. הוסף מדיה טריה או לשנות תקשורת באופן קבוע (כל 1-3 ימים, תלוי בסוג של תאים. לקבלת תא H9, לשנות בינוני כל 3 ימים). בסוף תיוג, להגדיל את נפח תרבות (למשל ~ 30 מ"ל) כדי להתאים את הצמיחה של תאים יותר.
    הערה: בדוק תא מדויק זמן הכפלה בתחילת הניסוי באמצעות מכתים Trypan הכחול תא ספירה.
  3. להדביק את התאים שכותרתו עם HIV-1 NL4-3 באמצעות פרוטוקול הידבקות ב- HIV-1 תקן 13 במשך 48 שעות. דגירה התאים עם כמויות מתאימות של וירוס עם ריבוי של זיהום (משרד הפנים) סביב 0.3. בדוק הידבקות ב- HIV-1 על ידי כימות p24 של supernatants תרבות באמצעות ערכת ELISA אנטיגן p24 HIV-1. בצע assay immunofluorescence 14 כדי לאשר זיהום מוצלח של תאים. Keep גדל התאים ללא תווית במדיום ללא תווית ללא הידבקות ב- HIV-1.
  4. קציר supernatants של שתי הקבוצות בסוף זיהום (שלב 2.1).

2. בידוד Exosome

הערה: באמצעות סדרה של צעדי ultracentrifugation, שברי exosomal מן supernatants התרבות מועשרים 15. בצע את כל השלבים הבאים ב 4 ° C, עם הרוטור ultracentrifuge שיכולים להגיע למהירות של g x 100,000 לפחות.

  1. אסוף את supernatants של תרבויות ב 50 צינורות חרוטי מ"ל, הימנעות תאים. צנטריפוגה אותם במשך 10 דקות ב 300 XG כדי להסיר תאים הנותרים.
  2. אסוף את supernatants צינורות חרוטי חדש 50 מ"ל ו צנטריפוגות אותם במשך 10 דקות XG ב 2000 כדי להסיר תאים מתים. העברת וכתוצאה supernatants לצינורות הרוטור תואם מסחרי כי הם מסוגלים לעמוד ultracentrifugation.
  3. הקפד לאזן את צינורות ultracentrifuge. צנטריפוגה צינורות במשך 30 דקות ב XG 10,000 להסירפסולת תא.
  4. אסוף את supernatants צינורות ultracentrifuge ו צנטריפוגות במשך 70 דקות ב 100,000 x ז. מחק את supernatants.
  5. Resuspend את הכדורים עשירים exosome ב 5 מיליליטר של PBS הטרי. מעביר את פתרונות צינורות צנטריפוגות ultracentrifuge טריים שוב במשך 70 דקות ב 100,000 x ז.
  6. supernatants מחק. כדי לאחסן את exosomes לטווח ארוך, resuspend את הכדורים ב 50 μl של PBS ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. לחלופין, להמשיך ישירות מיצוי חלבון כמוצג להלן.

3. חלבון כרייה הכנה

  1. ממיסים כדורי exosomal מבודד 100-200 μl Ripa חיץ תמוגה והפקת עם קוקטיילים מעכב פרוטאז הוסיף. המאגר מורכב של 25 מ"מ טריס-הידרוכלוריד, 150 נתרן כלורי מ"מ, 1% NP-40, deoxycholate נתרן 1%, ו -0.1% SDS (סולפט dodecyl נתרן), ב- pH 7.6. קוקטיילים מעכב פרוטאז צריך להכיל מגוון של מעכבי פרוטאז, כגון aprotinin, bestatin, leupeptin, pepstatin A ו- EDTA (חומצה ethylenediaminetetraacetic), שיכולים לעכב מגוון רחב של פרוטאזות.
  2. צנטריפוגה הפתרונות מומס במשך 10 דקות ב 13,000 XG (4 ° C), ולהעביר את supernatants פינה צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge חדש.
  3. לכמת ריכוז החלבון של כל דגימה של exosomes באמצעות חומצה bicinchoninic (BCA) או ברדפורד assay 16.
  4. מערבבים כמות שווה של חלבונים (2 מיקרוגרם) ממדגמים שכותרתו ללא תווית ולהפעיל את תערובת שווה על ג'ל 4-20% SDS-PAGE ב 120 מילי-אמפר / 200 V למשך 30 דקות.
  5. ג'ל הכתם עם Coomassie כחול ואחריו destaining 17.
  6. באמצעות סכין גילוח, לחתוך את שביל המדגם מן הג'ל. ואז לחתוך את השביל הג'ל לתוך 10-15 חתיכות שווות. שים כל חתיכה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר טרי עבור סכום כולל של 10-15 צינורות.
  7. לטבול קוביות ב 25 מ"מ NH 4 HCO 3 ב אצטוניטריל 50%, מערבולת, וזורקים supernatants. חזור פעמיים. יָבֵשׁקוביות concentrator ואקום 18, 19.
  8. רעננותם קוביות עם 10 מ"מ dithiothreitol (DTT), מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה. לדגור על 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. supernatant מחק.
  9. לטבול קוביות ג'ל ב -55 מ"מ iodoacetamide, מערבולת, ספין. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 45 דקות. supernatant מחק.
  10. לטבול קוביות ב 25 מ"מ NH 4 HCO 3, מערבולת, ספין, וזורקים supernatant.
  11. לטבול קוביות ב 25 מ"מ NH 4 HCO 3 ב 50% אצטוניטריל, מערבולת, ספין. חזור על 3.9 ו 3.10.
  12. ייבש את קוביות concentrator ואקום. הוסף 25 μl כיתה רצף טריפסין שונה ב 25 מ"מ NH 4 HCO 3, דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, וזורקים את הפתרון עודף. לטבול קוביות ב 25 מ"מ NH 4 HCO 3 ללא טריפסין, דגירה לילה בשעה 37 ° C.
  13. בקצרה לסובב קוביות למטה ולהעביר את הפפטיד וכתוצאה נוסףct לצינור חדש. הוסף 30 μl של 5% חומצה פורמית ב אצטוניטריל 50% על קוביות, מערבולת למשך 30 דקות, ספין. מערבבים את supernatant עם תמצית. ייבש את התמציות פפטיד עם רכז ואקום לפחות מ 5 μl.
  14. שלח דגימות למתקן ליבה ספקטרומטריית מסה לניתוח LC-MS / MS. נתוני MS הניתוח, אשר ניתן להפיק מן תוכנות קוד פתוחות, כוללים בדרך כלל מספר הצטרפות עבור כל חלבון המזוהה, שכותרתו / יחסי תווית ומספר פפטידים ייחודיים המזוהים.

4. אימות מערביות סופג

הערה: המערבי סופג מומלץ לוודא תוצאות ספקטרומטריית מסה.

  1. בצע פרוטוקולים מערביים סופג סטנדרטיים להבטיח כמויות שווות של חלבון מכל קבוצה נטענת. השתמש נוגדנים נגד חלבונים בעלי עניין (A5 Annexin למשל, שרשרת B לקטט דהידרוגנאז) מזוהה על ידי MS. זיהוי מערבי סופג, יחד עם צפיפות לניתוחים, יכול לחזור ולאשר כי MS חלבון זיהוי וכימות נכונים.

5. ניתוח נתונים proteomic

הערה: הערכת איכות נתונים, מקדים נתונים, חישוב וקביעת מועמדי חלבון משמעותיים נעשית בנפרד לכל MS לשכפל. לאחר ניתוחים לעיל הושלמו, הנתונים שנותחו מן המשכפל מושווים ומשולבים 6, 20, 21.

  1. להעריך את איכות הנתונים MS.
    1. ראשית, log2 להפוך את SILAC-MS שכותרתו / יחסי תווית של חלבונים לכמת בתוכנית גיליון אלקטרוני.
    2. בשנת גרפים מדעיים תוכנה סטטיסטית, קבוצת היחסים לתוך 40-100 פחי יחס עלילת מספר יחסים לכל בן ליצור היסטוגרמה. התפלגות נורמלית של ההיסטוגרמה מציינת באיכות טובה של נתוני MS 6. האם פעולה זו עבור כל MS משכפל.
  2. כדי להגדיל את הביטחון ואת הדיוק של יחסי פפטיד MS, שקול להסיר חלבונים בעלי פחות משני פפטידים הניתנים לכימות.
  3. כדי לקבוע מועמדי חלבון למעלה ולמטה מוסדר באופן משמעותי, בצע את הפעולות הבאות כדי לחשב משמעות ספי 22.
    1. בשנת גרפים מדעיים תוכנה סטטיסטית, ליצור רגרסיה שאינו ליניארי או עקומה-התאמה לנתוני חלוקת תדר. צעד זה מניב ערכים שניתן להשתמש בהם כדי לחשב את ערכי הסף. חשבת את הערכים החתוכים כמו חציון ± 1.96 σ עבור גבולות סמך 95% או 2.56 σ עבור גבולות סמך 99%.
      הערה: פרטים ספציפיים חישוב הפסקות ניתן למצוא בכתובת Emmott et al. 22.
    2. בחר את מועמדי חלבון יחסיים אשר הם או גבוהים מ -1.96 (או 2.56) סטיות תקן מעל החציון (משמעותי ביטוי יתר) או נמוך יותר מאשר 1.96 (או 2.56) סטיות תקן מתחת לחציון (תת הביע באופן משמעותי).
  4. השווה את המשכפל של המועמדים המשמעותיים-שזוהו לעיל כדי להשיג עקביות. ודא כי הם עומדים בקריטריונים הבאים כדי לעבור שלב בחירה סופי זה: מועמדים חייבים להיות מזוהים באופן עקבי בכל המשכפל; ו משכפל של מועמד חייב להיות עקבי בכיוון של רגולציה שלהם (רצוי, לפחות 2 מתוך 3 משכפל של מועמד צריכים להיות או למעלה מוסדרים או למטה מוסדר).
  5. לסיים נתונים עבור מועמדים העונים על הקריטריונים הנ"ל על זיווג של קובצי 'משכפל שלהם.

6. אימות ביואינפורמטיקה ואפיון

הערה: מידע גנומי bioinformatic קיים מציע שפע של מידע כמעט על כל חלבון. כריית נתונים וניתוח ביואינפורמטיקה על מידע שיכולים לסייע בהשגת מידה רבה של תובנה הנכס והפונקציות של המועמדים המשמעותיים. proce זהss הוא בדרך כלל יש צורך לתכנן את הניסויים רטוב-מעבדה במורד הזרם הנכון.

  1. שימוש במספרי הצטרפות GenBank שלהם או מזהי UniProt, חיפוש המועמדים מול מסדי נתוני exosome נוכחיים (Exocarta 23, Evpedia 24) כדי לוודא את החלבונים המועמדים נמצאו בעבר exosome. צעד זה מוסיף שכבה של ביטחון כי המועמדים הם אכן exosomes.
    1. http://www.exocarta.org/ Access, לחץ על "שאילתה" וקלט גם במספר גנים או חלבונים שם / ההצטרפות. דף סיכום יופיע ראיות exosome יוצגו, ובלבד אם יש.
  2. חיפוש המועמדים כנגד HIV-1 ואת מסד אינטראקציה חלבון אנושי 25. לחלופין, חפש מסדי נתונים הספציפיים שיכול לספק מידע על האינטראקציה של החלבונים המועמדים ואת תנאי הבדיקה.
    1. לגשת אל מסד הנתונים ב- www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVיחסי גומלין. על כניסת חלבון שם תחום ', הזן את מספרי הצטרפות שמות או המועמדים, ולחץ על חיפוש. תוצאות החיפוש יכולים לספק תובנה אינטראקציות בין HIV-1 והמועמדים חלבון, ולהציע איזה מבין המועמדים עלולה להיות באמת HIV-1 קשורים.
  3. מספרי היבוא GenBank הצטרפות או UniProt תעודות זהות של המועמדים לתוך תוכנת ניתוח GO (כגון FunRich, כלי ניתוח העשרה פונקציונלית 26) ולהפעיל את התוכנה.
    1. הורד את התוכנה ב http://www.funrich.org/. לאחר ההתקנה, פתח את התוכנה, תחת ניתוח העשרה, לחץ על "הוסף למערך הנתונים", ולהעלות את רשימת חלבון / גנים. לאחר מכן, בחר את סוג התרשים כדי להמחיש את ניתוח GO.
      הערה: GO תוצאות הניתוח יהיה דמיינו בצורה של תרשימי עוגה. פעולה זו מסייעת לנו לקבל תובנות עולמיים קשורים המועמדים בתחומי תהליכי ביולוגים (BP), רכיב סלולארי (CC), ותפקוד מולקולרי (MF).
  4. גישה דוד http://david.ncifcrf.gov/ 27, לחץ על "ביאור כלי פונקציונלי" באתר האינטרנט שלה. הזן את רשימת המועמדים, בחר "מזהה" של הגן כגון "UniProt ID", בחר "ג'ין רשימת" וחיפוש. תנאי GO המועשרים, p-הערכי, והפרמטרים נוספים ניתן למצוא על ידי לחיצה על "תוצאות סיכום ביאור" הדף תחת קטגורית "Gene_Ontology".
  5. כדי לחקור אינטראקציות פוטנציאל של המועמדים עם חלבונים אחרים, לשימוש באתר STRING נגיש בגלוי 28 להבהיר אינטראקציות חלבון-חלבון פוטנציאליים הביוכימיים אפשרית.
    הערה: GO ניתוח ביאור פונקציונלי (סעיף 6.3-6.4) יכולה גם להתבצע באמצעות תוכנת STRING האחרונה.
    1. לגשת אל מסד הנתונים ב- http://string-db.org/. הזן את המזהה או רצף חלבון לתוך הים המיועדתיבת earch ובחר המין הנכון לניתוח. לחץ על "חפש". התוצאות יתנו מידע משני עמותות ישירה (פיזית) ועקיפים (תפקודית). המשחקים הידועים בעשירייה הראשון עבור מועמד exosomal יוצגו צריך להיחשב לבחירת מועמד משמעותית.
      הערה: מידע רב הקשורים המועמדים ניתן לנתח באמצעות השלבים לעיל. המועמדים המשמעותיים ביותר עשויים להיבחר לניתוח מולקולרי ביוכימיים במורד זרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 א הוא תרשים זרימה המפרט את ההליך תיוג SILAC 21. על מנת לטהר את exosomes, הדגימות חייבות להיות סובבות למטה באמצעות צנטריפוגות. איור 1B מציגה את השלבים של טיהור exosome ידי ultracentrifugation סדר 21. לאחר מטוהרים, את exosomes כפופים ניתוח proteomic ניסיוני כמתואר בהליך.

איור 2 א הוא תרשים זרימה לקביעת המועמדים חלבון משמעותי מנתונים proteomic 21. המועמדים שנבחרו משמשים לניתוח פרוטאומיקה במורד הזרם. תרשים 2B הוא דוגמא היסטוגרמה SILAC מוצגת יחסי נציג תוצאות כימות חלבון טיפוסיות (נתון זה יש הבדל בין Li et al. 6), ולוח 1 הואn למשל קביעת ערכי סף למועמדים משמעותיים 6 מ היסטוגרמות יחס SILAC אלה. על ידי ביצוע השלבים המתוארים בסעיף 6.3, ערכי הסף לקביעת חלבונים למעלה או למטה מוסדרים באופן משמעותי חושבו. מתוך אוסף נתוני נציג זה, חלבונים עם / אור כבד (H / L) יחס מעל ערך הסף העליון נחשבו משמעותי למעלה מוסדר, בעוד חלבונים עם יחס H / L מתחת לערך הסף התחתון נחשבו משמעותי למטה מוסדר . משמעותי חלבוני מועמד מוסדרים יהיו נתונים לחקירה נוספת.

איור מציג 3 ניתוח ביואינפורמטיקה הכוללים ונהלי כריית נתונים עבור המועמדים המשמעותיים שנבחרו. טבלה 2 היא דוגמא כריית נתונים אשר מנצלת exosome ו- HIV-1 / מארח מסדי נתוני אינטראקציה 6 כדי לאסוף מידע על המועמדים (כרטיסייה זוle יש הבדל בין ואח Li. 6). ידי כריית exosome הנוכחי ומסדי נתונים אינטראקציה HIV-1 / מארח, שלוש עשרה מתוך ארבעה עשר המועמדים נמצאו לשייך exosomes. חמישה מתוך ארבעה עשר מועמדים היו ידועים גם לקיים אינטראקציה עם HIV-1. ביניהם, ארבעה מועמדים (HSPA4, הלם חום 70 kDa חלבון 4; NUTF2, גורם התחבורה גרעיני 2; PTGES3, synthase E פרוסטגלנדין 3; LDHB, L-לקטט שרשרת dehydrogenase B) נמצאו לשייך הן עם exosome ו- HIV-1. בין HSPA4, NUTF2, PTGES3 ו LDHB, רק LDHB היה עקבי תחת הביע בשבריר הנגוע (שכותרתו כבדה). באמצעות סדרה של ניתוחים, בחרנו LDHB להיות המועמד המשמעותי ביותר, אשר יכול להיות נתון למחקר נוסף. ניתוחי פרוטאומיקה במורד מוצגים באיור 4. איור 4 א מראה צעדים קצרים של האונטולוגיה גן (GO) ניתוח; איור 4B המדריך מפרט את הצעדים של דבי ביצועניתוח D; איור 4C מראה כיצד לבצע ניתוח רשתות באמצעות STRING. דמויות 5A, 5B, ו -5 ג הם ניתוח DAVID של קבוצה של ארבעה עשר חלבונים BP, CC ו MF; איור 5D מציגה את השותפים באינטראקציה בעשירייה הראשונה של LDHB; איור 5E מראה כי הרוב המכריע של שותפים באינטראקציה של LDHB קשור גם עם exosome ו- HIV-1. תוצאות ניתוח DAVID ראשוניות הציעו מועמדים רבים הקשורים אפופטוזיס ולהשתתף סביר חלבון מחייב. ניתוח STRING בהמשך אישר כי LDHB מחייב השותפים גם מבחינה פונקציונאלית והן locationally הקשורים exosome ו- HIV-1. כל התוצאות האלה נותנים מידע רב ערך עבור חקירות במורד זרם פוטנציאליות.

איור 1
איור 1: תיוג SILAC וטיהור exosome באמצעות ultracentrifugation ההפרש.(א) שתי קבוצות של תאים גדלות בנפרד. קבוצה אחת הוא גדלה במדיום שכותרתו במשך שש הכפלות תיוג מלא. הקבוצה השנייה היא גדלה במדיום ללא תווית הרגיל באותה התקופה. לאחר מכן, התאים שכותרתו נגועים ב- HIV-1, בעוד תאים ללא תווית אינם. לבסוף, exosomes משתי הקבוצות מבודדים במקביל. (ב) הדגימות (supernatants או כדורים) המשמש צנטריפוגה בכל שלב מסומני המבחנות. שברים להיות מושלך מצוין בצד ימין של מבחנות. מהירות אורכו של כל צנטריפוגה גם מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: שלבי אימות נתוני proteomic (ים) וקביעת פרו משמעותימועמדי חלבון. (א) תרשים זרימה של קביעת מועמדי חלבון משמעותיים במערך proteomic (ים). ארבעה שלבים אלה להבטיח מבחר אמין של מועמדים משמעותיים. ראשית, היסטוגרמה יחס SILAC זמם להעריך את איכות הנתונים. הבאים, פחות מועמדים אידיאליים שעלולות לפגוע בדיוק יוסרו. בשלב השלישי, שיטות סטטיסטיות משמשות להגדיר סף משמעות עבור מועמדי חלבון פוטנציאליים. לבסוף, הנתונים לשכפל של המועמדים המשמעותיים מנותחים לעקביויות ימוזגו בסופו של דבר. (ב) היסטוגרמה נציג של יחסי SILAC. ההיסטוגרמה חשפה הפצה סימטרית לאורך יחס = 1 (log2 = 0) קו מגמה. יחסי טרנספורמציה log2 מקובצים לתוך פחי יחס, ואת ציר y מראה את המספר היחסי של יחסים שזוהו במהלך bin. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: ביואינפורמטיקה בסך הכל נהלי כריית ניתוח נתונים עבור מועמדים משמעותיים. הנהלים לכלול כריית נתונים exosomal ו- HIV-1 / מארח, אפיון אונטולוגיה ג'ין, ניתוח DAVID וחיזוי הרשת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: שלבי ביצוע אפיון האונטולוגיה גן, העשרה, נתיב המנתח. (א) שלבי ביצוע האונטולוגיה גן (GO) אפיון. כדי להגיע לתובנה של הפונקציות localizations subcellular של המועמדים המשמעותיים, צעדי ביצוע ניתוח GO באמצעות אפליקציהתוכנת ropriate 26 מומחשים. (ב) צעדים כדי ביצוע ניתוח העשרה GO Term. כדי לקבל מידע העשרה המועמדים המשמעותיים, צעדים קצרים ביצוע ניתוח DAVID מוצגים. (ג) שלבי ביצוע אינטראקציה וניתוח מסלול. כדי להבהיר מסלולים אפשריים ולמצוא שותפים פונקציונליים, צעדי ביצוע אינטראקציה או ניתוח רשת על ידי STRING מוצג. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: נציג DAVID ותוצאות ניתוח STRING. (א) תוצאות העשרת BP של ארבעת עשרת המועמדים על ידי ניתוח DAVID. תהליכי מוות של תאים הקשורים מועשרים באופן משמעותי. (ב) enrichmen CC תוצאות t של ארבעת עשרת המועמדים על ידי ניתוח DAVID. יש חלבונים רבים ממוצא תאי. (ג) תוצאות העשרת BP של ארבעת עשרת המועמדים על ידי ניתוח DAVID. מרבית המועמדים להשתתף חלבון מחייב. (ד) עשר אינטראקצית שותפים של LDHB המזוהה על ידי STRING. (E) מרבית השותפים LDHB קשורים גם עם exosome ו- HIV-1, אשר תומכת בהמשך התפקידים של LDHB ב exosome / HIV-1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שולחן 1
טבלה 1: חישוב נציג של ערכי סף הפרעות חלבון משמעותיים.

e2.jpg "/>
טבלה 2: קשרים בין המועמדים SILAC ו localizations exosomal שלהם ואינטראקציות עם HIV-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בשנת ההליכים המתוארים במאמר זה, אנו הוכחנו את היישום של טכניקת SILAC כדי לחקור את ההשפעה של זיהום HIV-1 על proteome המארח exosomal. בתחילה, נגוע ו- HIV-1 תאים נגועים הם איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. Exosomes שכותרתו דיפרנציאלי אז הם מטוהרים לפני ביצוע מיצוי חלבון. לאחר מכן, ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה-טנדם נוזלי מועסק לנתח את proteome exosomal. לבסוף, הנתונים ספקטרומטריית מסה כתוצאה וחלבונים מועמד פוטנציאלי חשופים סטטיסטי וביואינפורמטיקה מנתח לפני והניתוחים ביוכימיים במורד הזרם.

צעדים קריטיים ברחבי הפרוטוקול צריכים להיות אחריו כדי להשיג תוצאות אופטימיזציה. בשלבים הראשונים של הפרוטוקול, תיוג SILAC יכול להיות מושפע סוג תא מדיום התיוג. תאים בריאים מאוד שגשוג צריך לשמש כדי להשיג יעילות תיוג גבוהה. האנושות, התיוג מedium צריך להיות מוכן טרי תוך שימוש בסרום שור עובר dialyzed (FBS) ולא FBS הקבוע. FBS dialyzed ייגמר של חומצות אמינו פפטידים הוא, אם כן, פחות להפריע תיוג SILAC. זה צריך אבל, יש לציין כי בסרום dialyzed לא יכול להיות מתאים כמה שורות תאים, במיוחד תאים ראשוניים. צמיחה נורמלית בטווח הבינוני עם FBS dialyzed חייבת להיות מאושרת לפני העסקת האסטרטגיה SILAC. בנוסף, באמצעות תיוג איזוטופ "כבד" כפול (13 C 6 L- ליזין ו -13 C 6 15 N 4 L-arginine) במקום להשתמש 13 C 6-ליזין L ביחידים, יכול להגדיל את מספר פפטידים לכמת ב ספקטרומטריית מסה אָנָלִיזָה. המספר המזערי של התאים הדרוש לניתוח proteome עוקבות מוצלח תלוי בגורמים רבים, כגון רגישות ספקטרומטר מסה, המסה של כל תא, ו proteome ממוקד (כולו proteome או שלאחר translational חלבונים מהונדסים). בהתבסס על הממצאים שלנו, אנו ממליצים עשרה מיליון תאים כסכום ראשוני בהערכת המספר המתאים של תאי דרושים ספקטרומטריית המסה.

Exosome במנותק מן supernatants תרבית תאים ניתן לשפר על ידי הוספת שלב סינון כדלקמן. השעייתו של תאים, צעד צנטריפוגה ראשוני ב XG 200 עבור 10 דקות נעשה כדי להסיר תאים מושעים ב supernatant, ואחריו סינון דרך 0.22 מיקרומטר מסנן 29, 30. עבור תאים חסידים, supernatant ניתן לאסוף ישירות המתרבה ומסונן באותו אופן. סינון הוא שלב קריטי להפרדת exosomes מחומרים מזהמים, כגון מולקולות פפטידים קטנות. Exosomes ניתן לבודד אז מן supernatant בשיטת ultracentrifugation קלאסית, או באמצעות ערכות ריאגנטים בידוד exosome זמינים מסחרית. הטוהר של exosome ניתן לאמת על ידי nanopartiניתוח מעקב CLE או במיקרוסקופ אלקטרונים 31.

מאז virions HIV-1 הם בדרך כלל דומים בגודלם exosomes, הם עלולים לזהם exosomes מטוהרים מן דגימות נגועים ב- HIV-1. מסכי proteomic, מזהמי ויראלי פוטנציאל ניתן לסנן על ידי הגבלת החיפוש באתר רק חלבונים אנושיים. טכניקות בידוד נוספות תוך שימוש במתודולוגיות ותיקות כגון מפלי צפיפות iodixanol ובידוד immunoaffinity יכולים לשמש גם כדי להפריד virions HIV-1 מ exosomes 32, 33.

לאחר מכן, אנו דנים כמה הצעות כדי להבטיח ניתוח נתונים אמין לזהות מועמדים פוטנציאליים משמעותיים פעם תוצאות MS מתקבלות exosomes המבודד. בשלב הראשוני של הניתוח, ההיסטוגרמה יחס SILAC צריכה להיות על פי התפלגות נורמלית. אם הפצת הנתונים מוטה לכיוון מסוים, הקורא היה צריך לקבוע הדואר לגרום לפני שתמשיך עם הניתוח. למשל, הדגימות שכותרתו ללא תווית אולי לא מעורבות בשיעורים שווים. כמו כן, כמה פפטידים לא יכול להיות ערכי יחס SILAC כבד / קל, וצריך להתבטל מן המועמדים חלבון פוטנציאליים. לאחר מועמדים נבחרים, תוכנה ומסדי נתונים יכולים להיות מועסקים על מנת לאמת העשרה exosome, אינטראקציות עם תנאי בדיקה, מסלולים אפשריים. האינטראקציות בין חלבוני המועמד ומצבו מבחן צריכות להיות ממוקש דרך מסדי נתונים ספציפיים לפני הניתוח ביואינפורמטיקה. אפיונים ביואינפורמטיקה, ביאורי האונטולוגיה גן ניתן לזהות באמצעות תוכנה ובסיס נתונים שונים,

הטכניקה SILAC מועסק כאן מציעה גישה שיטתית וישירה לניתוח proteome מארח exosomal. רוב המעבדות ביו יוכל לאמץ את הנהלים עם ציוד נוסף מינימאלי עלות נוספת. טכניקת SILAC, לעומת זאת, היא דה בעיקרחתם ללימודים באמצעות שורות תאים. ככזה, שיטות אחרות ייתכן שיהיה צורך להיות מועסק על מנת ללמוד דגימות ביולוגיות שונות. למשל, MRM ללא תווית (ניטור תגובה מרובה) השיטה יכולה לשמש כימות ממוקד של חלבונים ופפטידים בדגימות קליניות 9, 34. בעוד שבמקרה של קביעת תכולת חלבון ממחקרים רבים, טכניקת SILAC יכול לשמש גם כדי לחקור שתיים או יותר דגימות. שיטת התיוג הכימי iTRAQ (תגי isobaric כימות יחסית ומוחלטת) או TMT מבוסס (תג המוני טנדם) שיטות לאפשר הרבה ריבוב גבוה תהיה מתאים יותר עבור דגימות מרובות.

ההליך המתואר כאן אינו מוגבל אפיון proteomic של exosomes מתאי נגועים ב- HIV-1. עם שינויים, זה יכול להיות מותאם לנתח exosomes תחת מגוון רחב של תנאי הבדיקה ומתח כגון זיהום חיידקי, זיהום ויראלי, וראדiation. זה מתאים גם לומד תאי subcellular אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תוספת ערה לאורך החיים / טאפטס / בראון וכפר, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693, ו K24HD080539 כדי BR. עבודה זו נתמכה גם על ידי קרן המחקר פיילוט תוחלת חיים (# 701- 5857), רוד איילנד קרן למחקר רפואי גרנט (# 20,133,969), ו- NIH COBRE URI / קריווי פיילוט מענק מחקר (P20GM104317) כדי ML. אנו מודים ג'יימס Myall ו Vy דאנג לעזרה בהכנת כתב היד דמות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
H9 cell line ATCC HTB-176
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
MTT assay kit Thermo Fisher V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher 26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 Thermo Fisher 89982 DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC Thermo Fisher 88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC Thermo Fisher 88431
HIV-1 NL4-3 NIH AIDS Reagent Program 2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit PerkinElmer NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge Eppendorf 22628045
Refrigerated ultracentrifuge Beckman Coulter 363118 Should be able to reach 100,000 x g
50 mL Conical Centrifuge Tubes Thermo Fisher 14-432-22
Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823
SW 32 Ti Rotor Beckman Coulter 369694
RIPA buffer Thermo Fisher 89900
Protease Inhibitor Cocktails Thermo Fisher  78430
ThermoMixer  Eppendorf 5384000020
BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher 23250
Spectrophotometer Biorad 1702525
SDS PAGE Gel apparatus Thermo Fisher EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels Novex XV04200PK20
Gel staining reagent Sigma Aldrich G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111
SpeedVac Concentrator Thermo Fisher SPD131DDA
Antibody to human annexin A5 Abcam ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain Abcam ab53292
Graphing and Statistical Software Systat  SigmaPlot  Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite Max Planck Institue of Biochemistry Maxquant 
Software and databases Various vendors Refer to main text for details

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
  2. Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
  3. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
  5. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
  6. Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
  7. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  8. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  9. Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
  10. Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
  11. Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
  13. Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
  14. Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
  16. Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  17. Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
  18. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  20. Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
  21. Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
  22. Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  24. Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
  25. Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
  26. Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
  27. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  28. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
  29. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
  30. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
  31. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  32. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
  33. Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
  34. Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).

Tags

זיהום גיליון 121 Exosomes רכב תאי HIV-1 פרוטאומיקה ספקטרומטריית מסה SILAC ביואינפורמטיקה
אפיון proteomic SILAC מבוסס של Exosomes מ- HIV-1 תאים נגועים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheruiyot, C., Pataki, Z., Williams, … More

Cheruiyot, C., Pataki, Z., Williams, R., Ramratnam, B., Li, M. SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells. J. Vis. Exp. (121), e54799, doi:10.3791/54799 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter