Summary
We beschrijven een kwantitatieve proteomics met gebruik van technieken van stabiele isotopen van aminozuren in celcultuur (SILAC) het effect van HIV-1 infectie op host exosomaal proteoom analyse. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan cellen onder verschillende stress of infectie omstandigheden.
Introduction
Veel menselijke ziekten, waaronder virusinfecties, vaak geassocieerd met kenmerkende cellulaire processen die plaatsvinden in en rond de aangetaste cellen. Eiwitten, die vaak optreedt als de ultieme mobiele effectoren, bemiddelen deze processen. Analyse van de eiwitten vaak waardevolle informatie verschaffen over de lokale omgeving van betrokken cellen en helpen om het onderliggende mechanisme van de pathogenese van de ziekte te begrijpen. Tussen de verschillende eiwitanalyse technieken, proteomics houdt bijzonder grote belofte. Als krachtige, grootschalige gereedschap kan proteomics systemische begrip van cellulaire processen, met name op het gebied van de functie en interactie van eiwitten. Analyseren eiwitten wordt eenvoudiger gemaakt door de ontwikkeling van labeling technieken, waarmee onderzoekers om de expressie van cellulaire componenten, met name eiwitten controleren, in de plaats van onderzoek. Hoewel veel proteomics analyses zijn uitgevoerd op cellulairproteoom schaal, proteomics karakteriseringen op subcellulaire compartimenten bleek bijzonder informatief 1 te zijn. Dit wordt goed geïllustreerd in de studies van HIV-1 infectie.
Exosomes, 30-100 nm membraanblaasjes afgescheiden door een groot aantal celtypen 2, 3, zijn kritische componenten van intercellulaire communicatie en moleculair transport. Ze werden eerder ontdekte belangrijke rol spelen in de HIV-1 ontluikende werkwijze 4, 5. Door het combineren proteoomanalyse met functionele dissectie, vonden we dat exosomes vrijkomt uit HIV-1 geïnfecteerde cellen bestaan uit een unieke en kwantitatief andere handtekening en haven eiwit regulerende moleculen die cellulaire eigenschappen beïnvloeden naburige ontvankelijke cellen, inclusief cellulaire apoptose en proliferatie 6. De methoden worden beschreven in dit protocol,namelijk SILAC (stabiele isotoop labeling van aminozuren in celcultuur) 7 op basis van proteomics karakterisering van exosomes van HIV-1 geïnfecteerde cellen. Soortgelijke benaderingen kunnen worden toegepast om beter inzicht andere subcellulaire compartimenten tijdens pathogenese door het aanpassen van de experimentele belasting van de specifieke compartiment of gedeelte plaats en een aantal wijzigingen aan de beschreven procedures.
Gezien de recente ontwikkeling van kwantitatieve proteomics methoden, zijn er veel te kiezen bij het selecteren van de meest efficiënte methode voor een bepaald experiment. Voorbeelden hiervan zijn de chemische basis iTRAQ (isobarisch tags voor relatieve en absolute kwantificatie) 8 en het label-free MRM (meerdere reactie monitoring) 9 technieken. Beide methoden zijn krachtige tools en zijn goede keuzes voor specifieke instellingen. Voor een typische laboratorium vooral bezig met cellijnen, maar deze twee methoden relatively hogere kosten en meer tijdrovend in vergelijking met de SILAC gebaseerde methode. SILAC is een metabole gebaseerde labeling techniek die radioactieve isotopische vormen van aminozuren uit het kweekmedium in cellulaire eiwitten bevat. Gewoonlijk SILAC experimenten beginnen met twee celpopulaties, bijvoorbeeld geïnfecteerde en ongeïnfecteerde. Elke kamer is verschillend gemerkte in zijn specifieke isotoop omgeving tot volledige etikettering is bereikt. De gelabelde exosomes van deze cellen worden vervolgens onderworpen aan proteïne extractie. Eenmaal geëxtraheerd, de gelabelde exosomaal eiwitten worden geanalyseerd met vloeistofchromatografie tandem 10 massaspectroscopie. Tenslotte de massaspectrometrie resultaten en significant gemerkte eiwitten worden onderworpen aan statistische en bioinformatica analyses en biochemische strenge controle. Onze eerdere onderzoeksrapporten suggereren dat de SILAC / exosome procedures geschikter voor cellijnen van primaire cellen, cellijnen zijn gewoonlijk peractief prolifererende staat voor een efficiënte isotopische labeling,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek en HIV-1 infectie
LET OP: Voordat u begint met experimenten, is het raadzaam om de levensvatbaarheid van de cellen door middel van trypan blauwe vlekken 11 en de verspreiding daarvan te controleren door middel van een MTT-test 12. Het is ook van cruciaal belang voor nieuw bereide SILAC medium te gebruiken. Verschillende cellijnen kunnen worden gebruikt, mits ze in een actief proliferatieve fase en zijn gevoelig voor HIV-1 infectie, of de test toestand naar keuze. In dit protocol gebruiken H9-cellijn als voorbeeld.
- Seed 2 x 10 6 H9 cellen in elke cel cultuur kolf. Groeien één groep in 10 ml gelabelde RPMI 1640 medium dat 10% gedialyseerd foetaal runderserum (FBS), 100 mg / l 13 C 6 L-lysine en 100 mg / l 13 C 6 15 N 4 L-arginine. Groeien de andere groep in 10 ml ongelabeld RPMI 1640 medium met 10% gedialyseerd FBS, 100 mg / L L-Lysine en 100 mg / L L-Arginine.
- Kweken van de cellen gedurende zes verdubbelingen waarna de eiwitten van de cellen in het gemerkte medium praktisch volledig gemerkt (> 99%) met zware aminozuren. Voeg vers medium of medium veranderen regelmatig (om de 1-3 dagen, afhankelijk van het type cel. Voor H9 cel veranderen medium elke 3 dagen). Eind etikettering verhogen kweekvolume (bijvoorbeeld ~ 30 ml) om de groei van meer cellen tegemoet.
OPMERKING: Exact cel verdubbelingstijd aan het begin van het experiment via de Trypan Blue kleuring en celtellingen. - Infecteren de gemerkte cellen met HIV-1 NL4-3 met standaard HIV-1 infectie protocol 13 voor 48 uur. Incubeer de cellen met geschikte hoeveelheden van het virus met een multipliciteit van infectie (MOI) ongeveer 0,3. Check HIV-1 infectie door p24 kwantificering van de bovenstaande kweekvloeistoffen met behulp van een HIV-1 p24 antigeen ELISA kit. Voer een immunofluorescentietest 14 succesvolle infectie van cellen te bevestigen. keep kweken van de ongelabelde cellen in ongemerkte medium zonder HIV-1 infectie.
- Oogst de supernatanten van beide groepen aan het einde van infectie (stap 2,1).
2. exosome Isolation
LET OP: Door middel van een reeks van ultracentrifugatie stappen, worden exosomaal fracties uit kweeksupernatanten verrijkt 15. Voer alle volgende stappen bij 4 ° C, met een ultracentrifuge rotor met een snelheid van ten minste 100.000 x g te bereiken.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof van de kweken in 50 ml conische buizen vermijden cellen. Centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 300 xg om de resterende cellen te verwijderen.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof in nieuwe 50 ml conische buizen en centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 2000 xg om dode cellen te verwijderen. Overdracht resulterende supernatanten commerciële rotor-compatibele buizen die kunnen ultracentrifugatie weerstaan.
- Zorg ervoor dat u de ultracentrifuge buizen in evenwicht te brengen. Centrifugeer de buisjes gedurende 30 min bij 10.000 xg te verwijderencelresten.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof in ultracentrifuge buizen en centrifugeer gedurende 70 minuten bij 100.000 x g. Gooi de supernatanten.
- Resuspendeer de exosoom-rijke korrels in 5 ml vers PBS. Breng de oplossing frisse ultracentrifuge en centrifugeer gedurende nogmaals 70 min bij 100.000 x g.
- Discard supernatanten. De exosomes langdurige opslag, resuspendeer de pellets in 50 ul PBS en bewaar bij -80 ° C. Alternatief verrichten meteen eiwitextractie zoals hieronder getoond.
3. Protein Extraction en Voorbereiding
- Ontbinden geïsoleerde exosomaal pellets in 100-200 ui RIPA lysis en extractie buffer met toegevoegde proteaseremmer cocktails. De buffer bestaat uit 25 mM Tris-hydrochloride, 150 mM natriumchloride, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholaat en 0,1% SDS (natriumdodecylsulfaat) bij pH 7,6. De proteaseremmer cocktail moet verschillende proteaseremmers, zoals aprotinine, bestatine, l bevatteneupeptin, pepstatine A en EDTA (ethyleendiaminetetraazijnzuur), die een volledige waaier van proteasen te remmen.
- Centrifugeer de opgeloste oplossingen gedurende 10 minuten bij 13.000 xg (4 ° C) en breng de supernatanten geklaard nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuizen.
- Kwantificeren eiwitconcentratie van elk monster exosomes gebruik bicinchoninezuur (BCA) of Bradford assay 16.
- Meng een gelijke hoeveelheid eiwitten (2 ug) van gemerkte en niet-gemerkte monsters en de werking gelijk mengsel op een 4-20% SDS-PAGE gel bij 120 mA / 200 V gedurende 30 minuten.
- Vlek gel met Coomassie Blue gevolgd door ontkleuren 17.
- Met behulp van een scheermesje, snijd het monster rijstrook uit de gel. Knip dan de gel laan in 10-15 gelijke stukken. Leg elk stuk in een schoon 1,5 ml microcentrifuge buis voor een totaal van 10-15 buizen.
- Dompel kubussen in 25 mM NH 4 HCO 3 in 50% acetonitril, vortex, en gooi supernatanten. Herhaal dit twee keer. Droogblokjes in een vacuümconcentrator 18, 19.
- Hydrateren kubussen met 10 mM dithiothreitol (DTT), vortex en centrifuge kort. Incubeer bij 56 ° C gedurende 1 uur. Teruggooi supernatant.
- Dompel gel kubussen in 55 mm joodaceetamide, vortex en spin. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 45 min. Teruggooi supernatant.
- Dompel kubussen in 25 mM NH 4 HCO 3, draaikolk, rotatie, en gooi supernatant.
- Dompel kubussen in 25 mM NH 4 HCO 3 in 50% acetonitril, vortex en spin. Herhaal 3.9 en 3.10.
- Droog de blokjes in een vacuümconcentrator. Voeg 25 ul sequencing rang gemodificeerd trypsine in 25 mM NH 4 HCO 3, incuberen bij 4 ° C gedurende 30 min en gooi de overmaat oplossing. Dompelen blokjes in 25 mM NH 4 HCO 3 zonder trypsine en incubeer overnacht bij 37 ° C.
- Kort draaien blokjes naar beneden en de overdracht van de resulterende peptide extract naar een nieuwe buis. Voeg 30 ul van 5% mierenzuur in 50% acetonitril blokjes, vortex gedurende 30 minuten en centrifugeren. Combineer de supernatant met het extract. Droog de peptide fragmenten met een vacuümconcentrator tot minder dan 5 pl.
- Dienen monsters massaspectrometrie kernfaciliteit voor LC-MS / MS analyse. De MS analyse, die kan worden gegenereerd uit open source, omvat typisch een volgnummer voor elk eiwit geïdentificeerd label / ongelabelde verhoudingen en het aantal unieke peptiden geïdentificeerd.
4. Western Blotting Verification
LET OP: Western blotting wordt aanbevolen om massaspectrometrie resultaten te controleren.
- Volg standaard Western blotting protocollen en waarborgen dat gelijke hoeveelheden eiwit van elke groep worden geladen. Gebruik antilichamen tegen eiwitten van belang (bijvoorbeeld annexine A5, lactaatdehydrogenase B keten) geïdentificeerd door MS. Western blotting detectie, samen met densitometrie analysis, kan bevestigen dat MS eiwit identificatie en kwantificatie correct zijn.
5. Proteomic Data Analysis
LET OP: De gegevens kwaliteitsbeoordeling, data voorbehandeling, berekening en vaststelling van belangrijke eiwitten kandidaten worden afzonderlijk voor elke MS te repliceren. Zodra bovenstaande analyses zijn afgerond, worden de geanalyseerde gegevens van duplo vergeleken en gecombineerd 6, 20, 21.
- Beoordelen van de kwaliteit van de MS-gegevens.
- Ten eerste, log2 transformeren de SILAC-MS gelabelde / ongelabelde verhoudingen van gekwantificeerd eiwitten in een spreadsheet-programma.
- In wetenschappelijke grafieken en statistische software, de groep van de verhoudingen in 40-100 verhouding bakken en plot het aantal ratio's per bin om een histogram te genereren. Een normale verdeling van histogram geeft een goede kwaliteit van de MS-gegevens 6. Doe deze stap voor alle MS repliceert.
- Om het vertrouwen en de nauwkeurigheid van de MS peptide ratio te verhogen, kunt u overwegen het verwijderen van eiwitten die minder dan twee gekwantificeerde peptiden.
- Aanzienlijk up- en down-gereguleerd eiwit kandidaten bepalen, gebruikt u de volgende stappen om te berekenen betekenis drempels 22.
- Wetenschappelijke grafieken en statistische software, genereert een niet-lineaire regressie en curve-fit aan de gegevens frequentieverdeling. Deze stap levert waarden die kunnen worden gebruikt om de cutoff berekenen. Bereken de cut-off-waarden als mediaan ± 1,96 σ voor 95% -betrouwbaarheidsgrenzen of 2,56 σ voor 99% betrouwbaarheidsgrenzen.
LET OP: Specifieke details van de berekening van de cutoffs is te vinden op Emmott et al. 22. - Selecteer het eiwit kandidaten van wie de verhoudingen zijn ofwel groter dan 1,96 (of 2,56) standaarddeviaties boven de mediaan (significant over-uitgedrukt) of lager dan 1,96 (of 2,56) standaarddeviaties onder de mediaan (aanzienlijk onder-uitgedrukt).
- Wetenschappelijke grafieken en statistische software, genereert een niet-lineaire regressie en curve-fit aan de gegevens frequentieverdeling. Deze stap levert waarden die kunnen worden gebruikt om de cutoff berekenen. Bereken de cut-off-waarden als mediaan ± 1,96 σ voor 95% -betrouwbaarheidsgrenzen of 2,56 σ voor 99% betrouwbaarheidsgrenzen.
- Vergelijk de herhalingen van de boven geïdentificeerde belangrijke kandidaten consistentie. Ervoor zorgen dat ze voldoen aan de volgende criteria om deze laatste selectie stap passeren: kandidaten moeten consequent worden geïdentificeerd in alle replica's; en replicaten van een kandidaat moet consistent in hun richting van regulering is (bij voorkeur ten minste 2 van 3 replicaten van een kandidaat moet ofwel opwaarts gereguleerd of neerwaarts gereguleerd).
- Finaliseren gegevens voor de kandidaten die voldoen aan de bovengenoemde criteria door het samenvoegen van de gegevens van hun replica '.
6. Bioinformatica Verificatie en karakterisering
OPMERKING: Bestaande genomische en bioinformatic informatie biedt een schat aan informatie voor bijna elk eiwit. Data mining en bioinformatica analyse van die informatie kan helpen bij het verkrijgen van een groot deel van inzicht in het pand en de functies van de belangrijke kandidaten. deze process is meestal nodig om een goede downstream wet-lab experimenten te ontwerpen.
- Met behulp van hun GenBank nummers toetreding of UniProt ID's, zoeken de kandidaten tegen de huidige exosome databases (Exocarta 23, Evpedia 24) om te controleren dat de kandidaat-eiwitten zijn eerder gevonden in exosome. Deze stap voegt een laag van het vertrouwen dat de kandidaten inderdaad in exosomes.
- Toegang http://www.exocarta.org/, klikt u op "Query" en voer ofwel het gen of eiwit naam / toegangsnummer. Een overzichtspagina zal verschijnen en het bewijsmateriaal in exosome zal worden getoond, mits als er een.
- Zoek de kandidaten tegen HIV-1 en het menselijke eiwit Interaction Database 25. Ook zoeken in het specifieke databanken met informatie over de interactie van de kandidaat eiwitten en testen voorwaarde kan leveren.
- Toegang tot de database op www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInteracties. Op de 'eiwit domeinnaam ", voert u eerst de namen van de kandidaten of toetreding nummers, en klik op zoeken. De zoekresultaten kunnen inzicht verschaffen in de interacties tussen HIV-1 en de proteïne kandidaten, en suggereren welke kandidaten zou waarlijk HIV-1 geassocieerde.
- Import GenBank nummers toetreding of UniProt ID's van de kandidaten in de GO analyse software (zoals FunRich, Functional Verrijking analyse-instrument 26) en start de software.
- Download de software op http://www.funrich.org/. Na de installatie, open de software, onder verrijking analyse, klik op "Add Data Set", en upload de lijst van eiwit / genen. Vervolgens selecteert u de grafiek type om de GO analyse te visualiseren.
LET OP: GO analyseresultaten worden gevisualiseerd in de vorm van cirkeldiagrammen. Deze stap helpt ons om globaal inzicht in verband met de kandidaten op het gebied van biologische processen (BP), Cellular Component krijgen (CC) en Molecular Function (MF).
- Download de software op http://www.funrich.org/. Na de installatie, open de software, onder verrijking analyse, klik op "Add Data Set", en upload de lijst van eiwit / genen. Vervolgens selecteert u de grafiek type om de GO analyse te visualiseren.
- Toegang DAVID bij http://david.ncifcrf.gov/ 27, klikt u op de "Functional Annotation Tool" op haar website. Voer de kandidatenlijst, selecteer de "Identifier" van het gen zoals de "UniProt ID", selecteer "Gene List" en zoeken. De verrijkte GO termen, p-waarden, en andere parameters kan worden gevonden door te klikken op de "Annotation Summary Results" pagina onder de rubriek "Gene_Ontology".
- Om mogelijke interacties van de kandidaten met andere eiwitten te onderzoeken, gebruiken open toegankelijk STRING gegevensbank 28 mogelijke eiwit-eiwit interacties en eventuele biochemische pathways ophelderen.
LET OP: GO Analyse en functionele annotatie (Sectie 6,3-6,4) kan ook worden uitgevoerd met behulp van de nieuwste STRING software.- Toegang tot de database op http://string-db.org/. Voer de eiwit-ID of sequentie in de daarvoor bestemde search box en selecteer de juiste soort voor analyse. Klik op "Zoeken". De resultaten zullen informatie over zowel de directe (fysieke) en indirecte (functionele) verenigingen geven. De top tien bekende wedstrijden voor de exosomaal kandidaat zal worden weergegeven en moet worden overwogen voor belangrijke kandidaat selectie.
OPMERKING: Een groot deel van de informatie in verband met de kandidaten kunnen worden geanalyseerd met behulp van de bovenstaande stappen. De belangrijkste kandidaten kunnen worden gekozen voor verdere stroomafwaartse moleculaire en biochemische analyse.
- Toegang tot de database op http://string-db.org/. Voer de eiwit-ID of sequentie in de daarvoor bestemde search box en selecteer de juiste soort voor analyse. Klik op "Zoeken". De resultaten zullen informatie over zowel de directe (fysieke) en indirecte (functionele) verenigingen geven. De top tien bekende wedstrijden voor de exosomaal kandidaat zal worden weergegeven en moet worden overwogen voor belangrijke kandidaat selectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A is een stroomkaart die de werkwijze 21 SILAC labeling. Om de exosomes zuiveren, moet de monsters te worden gesponnen via centrifuge. Figuur 1B toont de stappen van exosome zuivering door ultracentrifugatie seriële 21. Eenmaal gezuiverd, de exosomes onderworpen aan experimentele proteoomanalyse zoals bepaald in de procedure.
Figuur 2A is een stroomdiagram voor het bepalen van belangrijke eiwitten kandidaten proteooomdata 21. De geselecteerde kandidaten worden vervolgens gebruikt voor downstream proteomics analyse. Figuur 2B is een voorbeeld van SILAC histogram tonen representatieve verhoudingen typische eiwit kwantificering resultaten (Dit cijfer is aangepast Li et al. 6), en tabel 1 is eenn voorbeeld bepalen cutoff waarden voor belangrijke kandidaten 6 van deze SILAC verhouding histogrammen. Door het volgen van de stappen in paragraaf 6.3 beschreven, werden de cutoff waarden voor de bepaling significant op- of neerwaarts gereguleerd eiwitten berekend. In dit representatieve dataset werden eiwitten met een zware / lichte (H / L) verhouding boven de bovenste grenswaarde als significant up-gereguleerd beschouwd, terwijl de eiwitten met een H / L-ratio onder de lagere cutoff waarde aanzienlijk neerwaarts gereguleerd werden beschouwd . Significant gereguleerde kandidaateiwitten worden onderworpen aan verder onderzoek.
Figuur 3 toont de algehele procedures bioinformatica analyse en data mining voor de geselecteerde belangrijke kandidaten. Tabel 2 is een voorbeeld dat datamining exosome en HIV-1 / interacties te databases gebruikt 6 om informatie over de kandidaten (Deze tab verzamelenle aangepast is Li et al. 6). Door mijnbouw huidige exosome en HIV-1 / host interactie databases, dertien van de veertien kandidaten bleken te associëren met exosomes. Vijf van de veertien kandidaten ook bekend om met HIV-1. Onder hen, vier kandidaten (HSPA4, heat shock 70 kDa 4, NUTF2, nucleair transport factor 2, PTGES3, prostaglandine E synthase 3, LDHB, L-lactaat dehydrogenase B keten) bleken associëren met zowel exosome en HIV-1. Onder HSPA4, NUTF2, PTGES3 en LDHB, alleen LDHB was consequent onder-uitgedrukt in de geïnfecteerde fractie (zware label). Door een reeks analyses, selecteerden we LDHB de belangrijkste kandidaat, die kunnen worden onderworpen aan verdere studie. De downstream proteomics analyses worden weergegeven in figuur 4. Figuur 4A toont korte stappen van gen ontologie (GO) analyse; Figuur 4B toont de stappen van het uitvoeren DAVID analyse; Figuur 4C toont hoe je netwerk analyses uit te voeren met behulp van string. Figuren 5A, 5B en 5C zijn DAVID analyse van een reeks van veertien eiwitten in BP, CC en MF; Figuur 5D toont de top tien interactie partners van LDHB; Figuur 5E toont dat de meeste interagerende partners van LDHB ook geassocieerd met exosome en HIV-1. Initial DAVID analyseresultaten suggereerde dat veel kandidaten zijn apoptose-gerelateerde en waarschijnlijk deelnemen aan eiwit binding. STRING verdere analyse bevestigde dat LDHB bindingspartners ook functioneel en locationeel betrekking tot exosome en HIV-1. Al deze resultaten geven waardevolle informatie voor potentiële downstream onderzoeken.
Figuur 1: SILAC etikettering en exosome zuivering met behulp van differentiële ultracentrifuge.(A) Twee groepen cellen worden afzonderlijk gekweekt. Een groep is gekweekt in medium gelabeld zes verdubbelingen voor volledige etikettering. De andere groep wordt gekweekt in normaal medium ongelabelde dezelfde periode. Vervolgens worden de gemerkte cellen geïnfecteerd met HIV-1, terwijl ongelabelde cellen niet. Tenslotte exosomes van beide groepen worden geïsoleerd parallel. (B) De monsters (supernatanten of pellets) die bij de centrifugering bij elke stap worden in de reageerbuizen. Fracties worden weggegooid zijn vermeld aan de rechterkant van reageerbuizen. De snelheid en de lengte van elke centrifugering wordt ook getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stappen voor het valideren van proteomics dataset (s) en het bepalen van belangrijke proTein kandidaten. (A) Stroomschema voor het bepalen van significante eiwit kandidaten van proteomische dataset (s). Deze vier stappen zorgen voor een betrouwbare selectie van de belangrijkste kandidaten. Eerst wordt een SILAC verhouding histogram uitgezet om de kwaliteit van de gegevens. Vervolgens minder ideale kandidaten nauwkeurigheid kunnen verminderen verwijderd. In de derde stap worden statistische methoden om belangrijkheidsgrenzen potentiële kandidaten eiwit ingesteld. Ten slotte is het repliceren gegevens van de belangrijke kandidaten worden geanalyseerd op consistentie en worden uiteindelijk samengevoegd. (B) Vertegenwoordiger histogram van SILAC verhoudingen. Het histogram onthulde symmetrische verdeling langs ratio = 1 (log2 = 0) trendlijn. De log2 getransformeerde ratio's zijn gegroepeerd in verhouding bakken, en de y-as toont het relatieve aantal gedetecteerde ratio's per bak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Algemeen bioinformatica analyse en data mining procedures voor belangrijke kandidaten. De procedures bevatten exosomaal en HIV-1 / host data mining, Gene Ontology karakterisering, DAVID analyse en netwerk voorspelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Stappen voor het uitvoeren van gen ontologie karakterisering, verrijking, en pathway-analyses. (A) Stappen voor het uitvoeren van gen ontologie (GO) karakterisering. Om inzicht te krijgen van de functies en subcellulaire lokalisatie van de belangrijke kandidaten, stappen te krijgen tot het uitvoeren van GO analyse met behulp van appropriate software 26 geïllustreerd. (B) Stappen aan het uitvoeren van GO Term verrijking analyse. Om verrijking informatie van de belangrijke kandidaten te krijgen, zijn korte stappen om het uitvoeren van DAVID analyse getoond. (C) Stappen voor het uitvoeren van interactie en pathway-analyse. Om mogelijke trajecten op te helderen en vind functionele partners, stappen naar het uitvoeren van de interactie of netwerkanalyse door string worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve DAVID en STRING analyseresultaten. (A) BP verrijking resultaten van de veertien kandidaten door DAVID analyse. Celdood processen aanzienlijk verrijkt. (B) CC enrichmen t resultaten van de veertien kandidaten door DAVID analyse. Veel eiwitten hebben een intracellulaire oorsprong. (C) BP verrijking resultaten van de veertien kandidaten door DAVID analyse. De meeste kandidaten deelnemen eiwitbinding. (D) Top tien interactie partners van LDHB geïdentificeerd door string. (E) De meeste LDHB partners zijn ook geassocieerd met exosome en HIV-1, die verder ondersteunt de rol van LDHB in exosome / HIV-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Representatieve berekening van de cutoff waarden aanzienlijke verstoring eiwit.
e2.jpg "/>
Tabel 2: Associaties tussen SILAC kandidaten en hun exosomaal lokalisatie en interacties met HIV-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de in dit artikel beschreven procedures, we aangetoond dat de toepassing van de SILAC techniek om het effect van HIV-1 infectie bij de gastheer exosomaal proteoom onderzoeken. Aanvankelijk geïnfecteerde en HIV-1 geïnfecteerde cellen verschillend isotoop gemerkte. De verschillend gemerkte exosomes worden vervolgens gezuiverd voordat eiwitextractie. Vervolgens wordt vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie gebruikt om de exosomaal proteoom analyse. Ten slotte is de resulterende massa spectrometrie gegevens en mogelijke kandidaat-eiwitten worden onderworpen aan een statistische en bioinformatica analyses voor downstream biochemische dissecties.
Kritische stappen in het hele protocol moet worden gevolgd om optimale resultaten te bereiken. In de beginfase van het protocol, kan SILAC etikettering worden beïnvloed door het type cel en de etikettering medium. Gezond en sterk proliferatieve cellen worden gebruikt om een hoge labelingsefficiëntie verkrijgen. Kritisch, de etikettering medium moet vers worden bereid met gedialyseerd foetaal runderserum (FBS) in plaats van gewone FBS. Gedialyseerde FBS ontdaan van aminozuren en peptiden en is daarom minder waarschijnlijk verstoort de SILAC labeling. Er zij echter op gewezen dat gedialyseerd serum niet geschikt voor sommige cellijnen, in het bijzonder primaire cellen kunnen zijn. Normale groei in het medium met gedialyseerde FBS moet voorafgaand aan het gebruik van de SILAC strategie worden bevestigd. Voorts worden volgens dubbel "zware" isotopen (13C 6 L-lysine en 13 C 6 15 N 4 L-arginine) in plaats van 13 C 6 L-lysine afzonderlijk, kan het aantal gekwantificeerde peptiden in de massaspectrometrie vergroten analyse. Het minimale aantal cellen nodig voor een succesvolle verdere proteoomanalyse afhankelijk van veel factoren, zoals de gevoeligheid van de massaspectrometer, de massa van elke cel en proteoom gerichte (gehele proteoom of post-translationele gemodificeerde eiwitten). Op basis van onze resultaten wordt aanbevolen tien miljoen cellen als een eerste waarde bij het schatten van het juiste aantal cellen nodig voor de massaspectrometrie.
Exosoom isolatie uit celkweek supernatanten kunnen worden verbeterd door een filtratiestap als volgt. Voor de suspensie van cellen, wordt een eerste centrifugeringsstap bij 200 xg gedurende 10 min uitgevoerd aan cellen gesuspendeerd in de bovenstaande vloeistof, gevolgd door filtratie te verwijderen door een 0,22 urn filter 29, 30. Voor hechtende cellen, de bovenstaande vloeistof worden direct uit de kweek verzameld en gefiltreerd op dezelfde manier. Filtratie is een kritieke stap voor het scheiden van exosomes verontreinigende stoffen, zoals kleine moleculen en peptiden. De exosomes kan vervolgens worden geïsoleerd uit de supernatant ie de ultracentrifuge of in de handel verkrijgbaar exosome isolatie kits reagentia. De zuiverheid van het exosome kan worden geverifieerd door nanopartikel volgen analyse of elektronenmicroscopie 31.
Omdat HIV-1 virions in grootte gewoonlijk vergelijkbaar exosomes, kunnen zij exosomes gezuiverd uit HIV-1 geïnfecteerde monsters besmetten. In proteomics-schermen, kunnen potentiële virale verontreinigingen worden gefilterd door het beperken van de database zoeken alleen voor menselijke eiwitten. Verdere isolatietechnieken gebruikt gevestigde methodologieën zoals iodixanol dichtheidsgradiënten en immuno los kunnen ook gebruikt worden om HIV-1 virions scheiden van exosomes 32, 33.
Vervolgens bespreken we een aantal suggesties om te zorgen voor een betrouwbare data-analyse om potentieel belangrijke kandidaten te identificeren zodra MS resultaten worden verkregen uit geïsoleerde exosomes. In de eerste stap van de analyse, moet de SILAC verhouding histogram een normale verdeling volgen. Als de gegevens verdeling scheef in een bepaalde richting, zou de lezer moeten bepalen the veroorzaken alvorens verder te gaan met de analyse. Bijvoorbeeld kan de gemerkte en niet-gemerkte monsters niet gemengd in gelijke delen. Ook kunnen sommige peptiden geen zware / lichte SILAC verhouding waarden, en moeten worden verwijderd uit de potentiële eiwit kandidaten. Na de kandidaten worden geselecteerd, kan de software en databases worden gebruikt om exosome verrijking, interacties te verifiëren met testomstandigheden en mogelijke wegen. De interacties tussen de kandidaat-eiwitten en test voorwaarde moet worden gewonnen door middel van specifieke databases voor bio-informatica analyse. Voor bioinformatica karakteriseringen, kan gen ontologie aantekeningen worden geïdentificeerd met behulp van verschillende software en databases,
De SILAC techniek hier in dienst biedt een systematische en eenvoudige benadering van het analyseren van gastheer exosomaal proteoom. De meeste biomedische laboratoria zouden kunnen de procedures met minimale extra materiaal en extra kosten nemen. SILAC de techniek wordt echter vooral Dègetekend voor studies met cellijnen. Als zodanig kunnen andere methoden moeten worden toegepast om verschillende biologische monsters te bestuderen. Zo kan de label-free MRM (veelvoudige reactie monitoring) methode gebruikt voor gerichte kwantificering van eiwitten en peptiden in klinische monsters 9, 34. Terwijl in het geval van het bepalen van het eiwitgehalte van verschillende studies, kunnen de SILAC techniek ook worden gebruikt om twee of meerdere monsters te onderzoeken. De methode chemische labeling iTRAQ (isobarisch tags voor relatieve en absolute kwantificatie) of TMT-based (tandem massa-tag) methoden is het mogelijk veel hoger multiplexing en zou beter geschikt voor meerdere monsters.
De hier beschreven werkwijze is niet beperkt tot proteomics karakterisering van exosomen uit HIV-1 geïnfecteerde cellen. Met modificaties kan worden aangepast aan exosomes analyseren onder een groot aantal test- en stresscondities zoals bacteriële infectie, virale infectie, en radiation. Het is ook geschikt voor het bestuderen van andere subcellulaire compartimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een ARRA aanvulling op de levensduur / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 en K24HD080539 tot BR. Dit werk werd ook gesteund door Levensduur Pilot Research Fund (# 701- 5857), Rhode Island Stichting Medical Research Grant (# 20.133.969), en NIH COBRE URI / RIH Pilot Research Grant (P20GM104317) naar ML. Wij danken James Myall en Vy Dang voor hulp bij het manuscript en figuur voorbereiding.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1 NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000 x g |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
- Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
- Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
- Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
- Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
- Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
- Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
- Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
- Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
- Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
- Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
- Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).
