Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore indotto tramite l'infezione con il virus oncogeno herpesvirus-8/KS il herpesvirus umano (HHV-8/KSHV). Il modello di coltura delle cellule endoteliali descritto qui è specificatamente concepito per studiare i meccanismi da cui KSHV trasforma le cellule ospite.
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Articolo metodologico
Un modello In Vitro per lo studio della trasformazione cellulare da Herpesvirus Sarcoma di Kaposi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore insolito composto di proliferazione delle cellule dell'alberino che è iniziato da infezione delle cellule endoteliali (CE) con KSHV e si sviluppa più spesso nella regolazione di immunosoppressione. Nonostante decenni di ricerca, il trattamento ottimale di KS rimane definito male e gli esiti clinici sono particolarmente sfavorevoli nelle impostazioni di risorse limitate. Le lesioni KS sono guidate da angiogenesi patologica, infiammazione cronica e oncogenesi e vari in vitro modelli di coltura cellulare sono stati sviluppati per studiare questi processi. KS deriva dalle cellule di KSHV-infettati di origine endoteliale, così le cellule CE-stirpe di fornire i più appropriati in vitro surrogati del precursore delle cellule dell'alberino. Tuttavia, perché CE hanno una durata limitata in vitro , e come i meccanismi oncogenici impiegati da KSHV sono meno efficaci di quelli di altri virus cancerogeno, è stato difficile valutare i processi di trasformazione primaria o telomerase-immortalized EC. Di conseguenza, è stato sviluppato un modello di romanzo cultura basata su CE che prontamente supporta la trasformazione dopo l'infezione con KSHV. Espressione ectopica dei geni E6 ed E7 del papillomavirus umano di tipo 16 consente estesa cultura di pari età e passaggio mock - e KSHV-infettati CE e supporta lo sviluppo di un veramente trasformato (cioè, cancerogeno) fenotipo in colture di cellule infette . Questo modello altamente riproducibile e trattabile di KS ha facilitato la scoperta di diverse vie di segnalazione essenziale ad alto potenziale per la traduzione in contesti clinici.
Introduzione
Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore di angioproliferative multi-focale che interessano siti cutanei, mucosi e viscerali che si sviluppa più comunemente nella cornice di soppressione immune avanzata1. Sono state descritte quattro forme epidemiologiche: classic, una forma indolent che colpisce in genere persone anziane del patrimonio Mediterraneo e del Medio Oriente; iatrogena, derivando dal trattamento con farmaci immunosoppressori dopo trapianto dell'organo; epidemia, un cancro didefinizione; ed endemiche, una forma di HIV-indipendente comune nei bambini nelle regioni endemiche in Africa. Con l'avvento dei regimi della droga anti-retrovirale com....
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Protocollo
Nota: tutte le procedure descritte in questo protocollo devono essere eseguite in condizioni di BSL-2.
1. preparazione di KSHV Stock
- buffer di preparare TNE: sciogliere 292,24 mg di EDTA in ddH 2 O, portare a 225 mL e regolare a pH 8. Sciogliere mg 605,7 Tris in ddH 2 O portare a 225 mL e regolare a pH 8. EDTA e Tris soluzioni combinate, aggiungere 4,38 g NaCl, regolare il volume finale di 500 mL, filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C .
- Cultura il KSHV-positivo, la linea EBV-negativi di cellule di linfoma primario di effusione BCBL-1 in un incubatore a 37 ° C più 5% CO 2 i....
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Risultati
La morfologia della primaria CE è classicamente descritto come "ciottoli", e questa morfologia non è alterata dall'espressione del papillomavirus E6 ed E7 geni (Figura 1A). Espressione dei geni E6 ed E7 da solo non induce un fenotipo trasformato; così, le cellule sono suscettibili di contattare inibizione e cesseranno dividendo dopo aver raggiunto la confluenza nella cultura. Le cellule saranno tuttavia proliferare e ricrescere alla confluenza su trypsinization e ricromat.......
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Discussione
Oncogenesi sono un processo multifasico che aggira precauzioni importanti all'interno di un organismo36. Come lesione KS esistano lungo uno spettro di infiammazione cronica al veri sarcomi, delucidazione di alcuni processi patofisiologici mediata da KSHV richiede che alcuni studi condotti in modelli di coltura cellulare che supportano la trasformazione9. Va notato che la perdita di inibizione da contatto e la crescita ancoraggio-dipendente, fenotipi indicativi di trasformaz.......
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Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da K12 HD068322 (SCM); CA179921 R01 e P51 OD011092 (AVM); e premio 14PRE20320014 da America Heart Association (SB).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cellule BCBL-1 | Programma di reagenti NIH AIDS | 3233 | |
| cellule PA317 | ATCC | CRL-2203 | |
| Cellule endoteliali microvascolari dermiche neonatali | Lonza | CC-2505 | |
| EBM-2 Medio basale | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| anti-KSHV LANA/ORF 73 | Avanzato Biotecnologie | 13-210-100 | |
| TrypLETMExpress, senza rosso fenolo | ThermoFisher | 12604013 | |
| RPMI | |||
| DMEM | |||
| PBS con calcio e magnesio |
Riferimenti
- Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
- Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R.
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Ristampe e permessi
