Protocol
注：目的の任意のタンパク質のための誘導可能なLAPタグ安定な細胞株の生成の概要を図1に示され、LAPタグ化タンパク質の発現、精製及び質量プロテオミクスのための準備の概要を、図3に示されている分析します。
1. LAPタグベクターに目的の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）のクローニング
- シャトルベクターに目的の遺伝子のORFのクローニング。
- N末端融合またはC末端融合のいずれかのためのプライマー内の適切にattB1およびattB2部位と関心のあるORFを増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用します。 PCR条件のためのプライマー配列および表2は、 表1を参照してください。
- ゲルは、1％アガロースゲル上で、それらを解決することにより、PCR産物を精製します。ゲルから正しいサイズである増幅バンドを切除し、DNAグラムを使用して、ゲルスライスから抽出製造元の指示に従って、エル抽出キット。
- シャトルベクターを含むattP部位とPCR産物は、製造業者の指示に従ってベクターに再結合することを可能にするリコンビナーゼでPCR産物を含む精製するattBをインキュベート（Mのaterialsの表を参照してください）。
注：空のシャトルベクターとLAP-タグ付けベクトルは（ 材料表を参照） のccd B遺伝子が含まれているとCCD B耐性細菌細胞内で増殖しなければなりません。 ORFは、これらのベクターに挿入されたときしかし、ccdB遺伝子は、クローニングされたORFでベクターを増殖させる場合、したがって、標準的なDH5α 大腸菌細胞を使用して再結合されます。 - 反応生成物の1μlのDH5α 大腸菌細胞を形質転換および50mg / mlのカナマイシン13をルリアブロス（LB）寒天プレート上で形質転換細胞をプレート。
- カナマイシン耐性コロニーを選択します。
- LB私の中で選択したコロニーを育てます50 mg / mlでカナマイシンをDIAは、DNAミニプレップを行い、 表3に記載の配列決定プライマーを用いてDNA配列決定によって遺伝子の組込みを確認します。
- LAP-タグVectorにシャトルベクターから目的の遺伝子を転送します。
- LAP-タグベクター（N末端融合のためのpGLAP1）とに従ってLAP-タグベクターにシャトルベクターから目的の遺伝子の転送を媒介するリコンビナーゼで関心のORFの配列を検証遺伝子を含むシャトルベクターをインキュベート製造業者の説明書（材料を参照されたいです）。
注記：所望のプロモーター、エピトープタグに基づいて使用することができるLAP / TAPベクターシリーズ、NまたはC末端タグを表4に見出すことができます。 - 反応生成物の1μlのDH5α 大腸菌細胞を形質転換および100mg / mlアンピシリン13をLB寒天プレート上に形質転換された細胞をプレート。
- アンピシリン耐性結腸を選択NIES。
- 100mg / mlのアンピシリンを含むLB培地中で選択したコロニーの成長、DNAミニプレップを行い、 表5に記載されている配列決定プライマーを用いてDNA配列決定によって遺伝子の統合を確認します。
- LAP-タグベクター（N末端融合のためのpGLAP1）とに従ってLAP-タグベクターにシャトルベクターから目的の遺伝子の転送を媒介するリコンビナーゼで関心のORFの配列を検証遺伝子を含むシャトルベクターをインキュベート製造業者の説明書（材料を参照されたいです）。
関心のLAP-タグ付けされた遺伝子を発現誘導する安定な細胞株の2世代
- 興味のあるプロジェクトに最も適した細胞株を選択します。あるいは、構成のTetRを発現し、（材料を参照）関心のLAPタグ遺伝子が安定的にゲノムに組み込まれることを可能にするFRT部位を含む任意の既存の細胞株からの宿主細胞株を作成します。
注：このプロトコルのTetRとFRT部位を含むHEK293細胞株を使用して、[テトラサイクリン（-tet）を欠いている、10％ウシ胎児血清（FBS）で作ら] -tet DMEM / F12培地中で成長させた4 。 - 1〜2おしっこ内の宿主細胞株を殺すために必要なハイグロマイシンの最小濃度を決定薬剤添加後のKS。濃度は、大部分は、100μg/ mlの800μgの/ mlの間の範囲で、宿主細胞株の間で変化することができます。
注：37℃、5％CO 2が 1〜2週間以内に死亡するで100μg/ mlのハイグロマイシンで-tet DMEM / F12培地中で増殖させたHEK293細胞。 - 製造元の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いてHEK293細胞にLAPタグ付きベクターで（細胞のゲノム内のFRT部位への関心のLAP-タグ付けされた遺伝子の組込みを媒介）フリッパーゼリコンビナーゼを発現するベクターを同時トランスフェクト。 LAPベクトル14にリコンビナーゼベクトルの1：4の比率を使用してください。
注：最適な比率は、トランスフェクションの宿主細胞株および方法に依存し、滴定を必要とするかもしれません。 4：1の比率は、ほとんどの細胞株に適しています。ネガティブコントロールとしてモックトランスフェクションプレートが含まれます。 - ある日、トランスフェクション後、新鮮な培地で-tet DMEM / F12培地を交換してください。
- 二日後transfectiで、25％コンフルエンスに細胞を分割します。 〜5時間、細胞がステップ2.2で所定の濃度でハイグロマイシン含有-tet DMEM / F12培地を追加し、添付することができます。 HEK293ために、細胞を、100μg/ mlのハイグロマイシンを使用します。
注：HEK293細胞株を含むFRTはまた、ブラストサイジン耐性と関連付けられているのTetRを含有するので、5μg/ mlのブラストサイジンをのTetRを選択し、漏出性発現を最小限にするために、安定な細胞株の選択プロセス中に使用されます。 - 必要に応じて、異なる細胞巣はそれが透明板に対して不透明なスポットに似て表示されるまでハイグロマイシン含有-tet DMEM / F12培地を交換してください。
- 各セルの巣の上にトリプシンの20μlを添加して、200μlのピペットチップでダウン2回をピペットと。 24ウェルプレートに入れ細胞およびハイグロマイシン含有-tet DMEM / F12培地中で継続的な成長によって細胞を拡大。
- 固定細胞または生細胞蛍光顕微鏡によって誘導LAPタグ化タンパク質の発現のための画面細胞及び/又はLAP-タグ15内の GFPタグのウェスタンブロッティング。
LAP-タグ付けされたタンパク質複合体の3精製
注：次のLAP-タグ付きタンパク質精製プロトコルは、以前の経験に基づいて、典型的なLAP-タグ付きタンパク質精製のために用いられる条件とボリューム上の推奨事項を詳しく説明します。しかし、注意が経験的な最適化は、任意のタンパク質複合体と最良の結果を提供するために、関心対象のタンパク質の発現レベルについて行われることを確実にするために行使されるべきです。
- 細胞増殖および細胞収穫。
- 継続的に37℃、5％CO 2で-tet DMEM / F12培地中でより大きなプレートおよび/またはローラーボトルの中にすべてのHEK293細胞を継代することにより、タンパク質複合体のTAP分離のための検証LAP-タグ付けされた細胞株を展開します。
- テト/ Doxの誘導性の細胞株について、harvestin前に、0.2 / mlのテト/ Doxの細胞が到達〜70％の密集度の濃度で10〜15時間誘導G細胞。
注：濃度と誘導時間は、各タンパク質について決定されるべきである、10〜15時間、0.1〜1 / mlのテト/のDoxの滴定を推奨します。 - 5-10分間、875×gで攪拌またはトリプシン処理し、細胞をペレット化することにより細胞を回収します。
- プロテインAビーズを抗GFP抗体を結合
- 0.5ミリリットルの細胞ペレット、充填細胞容積（PCV）から調製した溶解物から免疫沈降に抗体40μgのを使用してください。
注：必要な抗体の量は、他の要因の中でも特に、LAP-タグ付けされたタンパク質の量に依存し、最適化が必要になります。 10-40μgのの滴定を推奨します。 - 1.5mlチューブにPBST（PBS + 0.1％のTween-20）中に160μlのパックされた体積（PV）プロテインAビーズを平衡化。 PBST 1mlで3回洗浄します。
注：本明細書中のすべての洗浄は、10秒間5,000×gで、ビーズを遠心分離することによって行われます。 - 再懸濁ビーズを500μlのPBST中との親和性の80μgのを追加します。160μlのビーズを各チューブに-purifiedウサギ抗GFP抗体。室温（RT）で1時間混合します。
- PBST 1mlでビーズを2回洗浄します。その後、0.2 Mホウ酸ナトリウム、pHが9（20 mlの0.2 Mホウ酸ナトリウム+ 15 mlの0.2 Mホウ酸）の1mlでビーズを2回洗浄します。最終洗浄後、1ミリリットルに最終容量をもたらすために、0.2Mホウ酸ナトリウム900μlの、pHが9を追加します。
- 最終濃度20mMに220ミリモルのジメチルピ（DMP）の100μLを加えます。室温で30分間穏やかにチューブを回転させます。 220 mMのDMPは、0.2 Mホウ酸ナトリウム、pHが9の877μlの1 50mgのボトルの内容物を再懸濁し、ビーズ懸濁液にすぐに追加します。
- DMPとのインキュベーションの後、残留架橋剤を不活性化するために、0.2Mエタノールアミン、0.2 MのNaCl pH8.5の1mlでビーズを1時間を洗います。同じ緩衝液1ml中に再懸濁ビーズ、室温で1時間回転させます。ペレットビーズおよび0.2 Mエタノールアミン、0.2 MのNaCl pH8.5の500μlの中に再懸濁ビーズ。ビーズはSeveraのために安定しています4℃でリットルヶ月。
- 0.5ミリリットルの細胞ペレット、充填細胞容積（PCV）から調製した溶解物から免疫沈降に抗体40μgのを使用してください。
- 細胞溶解および複雑な精製のための緩衝液の調製
- pH7.4の溶液を製造することにより、（タンパク質を溶出する前に洗濯ビーズのための最もビーズの洗浄のための細胞溶解のための300ミリメートル、200ミリメートル、100ミリメートル×は、所望の塩濃度であるLAPバッファの[のKCl]）LAPXバッファを準備します50mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、XのKCl、1mMのエチレングリコール四酢酸（EGTA）、1mMのMgCl 2、及び10％グリセロールを含みます。
注：このバッファの構成要素は、生細胞環境を近似するために使用されます。 HEPESは、7.2から8.2のpH怒りのバッファとして使用されています。 KClを緩衝液のイオン強度を維持するために使用される塩です。 EGTAは、マグネシウムに比べてカルシウムのレベルを減少させるためにカルシウムイオンを結合するキレート剤です。グリセロールおよびMgCl 2は、タンパク質の安定性を改善するために使用されます。 - 0.05％ノニルphenoxypolを追加することによってLAPX Nバッファを準備LAPXバッファへyethoxylethanol。
注：ノニルphenoxypolyethoxylethanolは、タンパク質を可溶化、中性洗剤であるが、より高い濃度が、抽出プロセス中に使用されるタンパク質 - タンパク質相互作用を維持し、それが次に、結合及び洗浄の工程の間に低下します。
- pH7.4の溶液を製造することにより、（タンパク質を溶出する前に洗濯ビーズのための最もビーズの洗浄のための細胞溶解のための300ミリメートル、200ミリメートル、100ミリメートル×は、所望の塩濃度であるLAPバッファの[のKCl]）LAPXバッファを準備します50mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、XのKCl、1mMのエチレングリコール四酢酸（EGTA）、1mMのMgCl 2、及び10％グリセロールを含みます。
- 細胞溶解物の調製
- 0.5 mMのジチオスレイトール（DTT）およびプロテアーゼ阻害剤とLAP300の2.5ミリリットルにPCVを500μlを再懸濁します。 10％のノニルphenoxypolyethoxylethanol（最終0.3％）の90μlを添加して、反転により混合します。
- 10分間氷上に置きます。 10分間、21,000×gで遠心分離します。この低速上清（LSS）を収集します。ゲル分析のためのLSSの10μlのサンプルを取ります。
- 4℃で1時間、100,000×gでTLA100.3管とスピンにLSSを転送します。チューブに、この高速上清（HSS）を収集し、氷上に置きます。ゲル分析のためにHSSの10μlのサンプルを取ります。
注：一番上の脂質層ANを服用しないでくださいDボトムほとんどの細胞破片層。脂質層は、HSSを収集する前に、真空吸引によって除去されるべきです。
- 第1の親和性キャプチャ：抗GFPビーズへの結合
- プレ溶出抗体結合されたビーズは、非結合を取り除くために、溶出緩衝液[20 mMトリス、pHが7.4と3.5 MのMgCl 2]の1ミリリットルでそれらを3回洗浄することにより（0.5ミリリットル細胞ペレット（PCV）あたりのビーズの160μlのを使用します）抗体とは、バックグラウンドを低減します。迅速に行います。長時間の高塩中のビーズを放置しないでください。
- LAP200 N 1mlでビーズを3回洗浄。 HSSは、4℃で1時間、抗体ビーズを用いて抽出し混合します。 10分間、21,000×gで遠心分離します。上清の10μlのサンプルを取る（ すなわち 、（FT）を流れる）ゲル分析のために。
- 0.5 mMのDTTおよびプロテアーゼ阻害剤とLAP200 N 1mlでビーズを3回洗浄。 0.5 mMのDTTおよびプロテアーゼ阻害剤とLAP200 N 1mlでビーズを2回（各5分）洗浄します。すぐに2トンを洗いますタバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼを加える前に0.5 mMのDTTなしプロテアーゼ阻害剤とLAP200 Nの1ミリリットルでのIME。
- TEV切断
- LAP200 Nの1ミリリットル中に10μgのTEVプロテアーゼを希釈し、4℃で一晩チューブを回転させます。
注：このステップは、LAP-タグ付けされたタンパク質複合体の維持を助けることができるTEVプロテアーゼの濃度を調整することにより、数時間で完了すべきLAPタグタンパク質のために最適化することができます。 - 新しいチューブへのペレット、ビーズおよび転送上清。任意の残留タンパク質を除去するために、160μlの0.5 mMのDTTおよびプロテアーゼ阻害剤とのLAP200 N（トリプル濃度）で2回ビーズを洗浄します。ゲル分析のために上清の10μlのサンプルを取ります。
- LAP200 Nの1ミリリットル中に10μgのTEVプロテアーゼを希釈し、4℃で一晩チューブを回転させます。
- 第二に親和性のキャプチャ：Sプロテインアガロースへの結合
- 80μlのSタンパク質アガローススラリーの1チューブ（40μlを充填した樹脂）LAP200 Nの1ミリリットルで3回洗浄します。
注：S PROTEINがアクティブのRNaseを再構成しますS-タグに結合し、代替第二のエピトープタグは、RNAを含むタンパク質複合体のために考慮されるべきです。 - TEVを追加Sタンパク質アガロースビーズと4℃で3時間、岩に上清を溶出しました。ペレット、ビーズおよび0.5mM DTTおよびプロテアーゼ阻害剤とLAP200 N 1mlで3回洗浄します。 LAP100 1mlでビーズを2回洗浄します。
- 80μlのSタンパク質アガローススラリーの1チューブ（40μlを充填した樹脂）LAP200 Nの1ミリリットルで3回洗浄します。
- タンパク質溶出
- 10分間97℃で4×Laemmliサンプル緩衝液と熱の50μLを添加することによって、アガロースSタンパク質をタンパク質をオフ溶出。
注記：タンパク質は、溶出緩衝液（20mMのTris、pH7.4で3.5 MのMgCl 2）を用いてビーズから溶出することができます。
- 10分間97℃で4×Laemmliサンプル緩衝液と熱の50μLを添加することによって、アガロースSタンパク質をタンパク質をオフ溶出。
4.質量分析によって相互作用するタンパク質を同定
- 参照（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、銀染色ゲルにより収集されたサンプルを分析することによって、精製の品質をテストします
- 化学量論的および準化学量論的同時精製の種を同定するために、最終的な溶出サンプルを採取し、SDS-PAGEによってそれを分けます。質量分析互換性のタンパク質染色でゲルを染色。最も顕著なバンドやゲルからそれらの間にスペースを切除し、質量分析別途16による分析のためにそれらを処理します。
注：最終精製の溶出液を分離し、質量分析5のためにそれらを調製するための多くのアプローチがあります。例えば、LAP精製複合体は、高塩（3.5 MのMgCl 2）を使用して、Sタンパク質のビーズから溶出することができ、ひとまとめ全タンパク質集団は、質量分析17によって分析することができます。あるいは、最後の溶出液を1 SDS-PAGEによるミリおよびeできる単一の1ミリバンドのために分離することができますxcisedと分析しました。これは、分析を妨害する任意のビーズまたは粒子状物質の複雑な混合物をクリアします。
Representative Results
このシステムの有用性を強調するために、タウの微小管結合タンパク質のオープンリーディングフレーム（ORF）を有するPCR産物にattB1およびattB2部位を含むプライマーを用いてタウORFを増幅した （ 表1）とインキュベートすることによって、シャトルベクターにクローニングしました。シャトルベクター、シャトルベクターへのPCR産物の挿入を媒介するリコンビナーゼ。反応生成物は、タウの挿入を確実にするために配列決定されたカナマイシン耐性コロニーからDH5α細菌13とプラスミドDNAを形質転換しました。シャトルタウのベクトルを検証シーケンスは、その後pGLAP1ベクターでシャトルタウベクトルをインキュベートすることにより、LAP（EGFP-TEV-S-タンパク質）タグとインフレームでタウを融合しpGLAP1ベクターにタウORFを転送するために使用されましたそして、pGLAP1へのシャトルベクターからORFの伝達を仲介するリコンビナーゼ。反応生成物をDH5α細菌を形質転換するために使用しました。アンピシリン耐性コロニーから13プラスミドDNAは、LAP-タウ融合がフレームにあったことを確認するために配列決定しました。 pGLAP1-LAP-タウ検証シーケンスは、その後、LAP-タグ付けされた遺伝子のための組込み部位であるそのゲノム内に単一フリッパーゼ認識ターゲット（FRT）部位を含むHEK293細胞にフリッパーゼの組換え酵素を発現するベクターで同時トランスフェクトしました。 14。この細胞株はまた、LAP-タグ付けされた遺伝子の上流のTetオペレーターに結合し、テト/ドックスの非存在下でのそれらの発現をサイレンシングのTetRを表明しました。安定な組込みは、5日間、100μg/ mlのハイグロマイシンと-tet DMEM / F12培地で選択しました。個々のハイグロマイシン耐性細胞の増殖巣は、トップと上下にピペッティング2倍にトリプシン20μlのを追加することにより回収しました。細胞を24ウェルプレートに入れ、-tet DMEM / F12培地中で継続的な成長により増殖させました。
ハイグロマイシン耐性細胞かどうかを確認するにはsはLAP-タウを発現することができた、HEK293 LAP-タウ細胞は15時間、そしてタンパク質抽出物については0.1μg/ mlのdoxで誘導したが誘導非およびDoxを誘発された細胞から調製しました。これらの抽出物は、SDS-PAGEによって分離し、PVDF膜に転写し、ローディングコントロールとしてGFPおよびチューブリンについて免疫ブロットしました。 図4Aに見られるように、（抗GFP抗体で可視化）、LAP-タウのみのDoxの存在下で発現させました。以前内因性タウ18のために示されていたとしてLAP-タウが正しく、有糸分裂の間有糸分裂微小管スピンドルに局在していたことを検証するために、HEK293 LAP-タウの細胞は、15時間を0.1μg/ mlのdoxで誘導し、細胞を4％パラホルムアルデヒドと共染色DNA（ヘキスト33342）と微小管（抗チューブリン抗体）のために。一貫して、LAP-タウは、有糸分裂の中期（ 図4B）の間、紡錘体に局在していました。そのLAP-タウとその相互作用するタンパク質を確認するには、このSYSで精製することができましたTEM、HEK293 LAP-タウ細胞は、攪拌によって回収し、15時間は0.1μg/ mlのドキシサイクリンで誘導し、ローラーボトルへ〜70％コンフルエントに増殖させLAP300緩衝液で溶解し、そしてLAP-tauが上記のプロトコルを使用して精製しました。 LAP-タウの精製からの溶出液をSDS-PAGEにより分離し、ゲルを銀染色しました。 図4Cは、アスタリスクでマークされたLAP-タウの精製は、LAP-タウとタウ相互作用するタンパク質の指標を見ることができるいくつかの他のバンドであることを示しています。
図1： 関心の任意のタンパク質のためのLAP-タグ付けされた誘導安定細胞株の生成の概要。目的の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）のにattB1およびattB2部位をそれぞれ5 'および3'末端配列を、隣接して増幅される（プライマー配列は、で与えられます 表1）にクローン化しシャトルベクター。目的の遺伝子との配列確認シャトルベクターは、次いでpGLAP1ベクターに目的の遺伝子を転送するために使用されます。配列は、目的の遺伝子とpGLAP1ベクターは、その後LAPのための組込み部位であり、そのゲノム内の単一フリッパーゼ認識標的（FRT）部位を含む所望の細胞株にフリッパーゼリコンビナーゼを含有するベクターで同時トランスフェクトされた検証しましたタグ付きの遺伝子。これらの細胞株はまた、LAPタグ遺伝子の上流のTetオペレーター（のtetO 2）に結合し、テト/のDoxの非存在下でのそれらの発現をサイレンシングTetリプレッサー（のTetR）を発現します。関心のLAP-タグ付けされた遺伝子は、次にFRT部位に組み換えされ、安定した組込みをハイグロマイシンで選択されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図2：LAP- タグ付けされた安定な細胞株のためのアプリケーションの概要。 LAPタグ誘導安定細胞株は、Doxの添加によって関心のLAPタグ化タンパク質を発現するように誘導され、細胞周期の様々な段階で同期することができ、または任意の所望のシグナル伝達経路を活性化する化学物質またはリガンドで刺激することができます。関心のLAPタグ化タンパク質の細胞内局在は、生細胞または固定細胞イメージングにより分析することができます。 LAPタグ付きタンパク質はまた、タンデムアフィニティー精製及びそれらの相互作用するタンパク質を液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS / MS）によって同定することができることができます。最後に、Cytoscapeは、ベイトタンパク質のタンパク質 - タンパク質相互作用のネットワークを生成するために使用することができます。 DOXは、ドキシサイクリンを示し、IPは免疫沈降を示し、EGFPは強化緑色蛍光タンパク質を示し、TEVは、TEVプロテアーゼ切断部位を示し、Sは、Sタグを示しています。http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 質量分析のためのLAPタグ付きタンパク質の発現、精製および準備の概要。 LAP-タグ付きタンパク質発現の1）成長と誘導溶解物、2）細胞の回収および溶解、3）の準備、の4）抗GFPビーズに溶解物の結合、5）TEVプロテアーゼ切断：プロトコルは9段階になっていGFP-タグは、6）S-タンパク質ビーズに溶解物の結合、7）ベイトタンパク質と相互作用するタンパク質、および8-9）質量分析ベースのプロテオミクス分析のためのサンプルの準備の溶出。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図4：LAP- タウ式の検証。非誘導のタンパク質サンプルの（A）ウエスタンブロット（WB）分析とのDox誘導されたLAP-タウHEK293細胞を、それぞれ、LAPタグタウタンパク質およびチューブリン負荷対照を検出するために、抗GFPおよび抗チューブリン抗体でプローブしました。細胞をDoxを用いて誘導されるときLAP-タウのみ発現していることに注意してください。 LAP-タウを発現している（B）有糸分裂細胞を固定し、共染色抗チューブリン抗体およびLAP-タウの細胞内局在を有するDNA（ヘキスト33342）およびチューブリン（タブ）のために、蛍光縮小コピーによって分析しました。そのLAP-タウが有糸分裂時に紡錘体および紡錘体極に局在注意してください。 LAP-タウ精製の（C）銀染色ゲル。 MWは分子量を表し、CLはクリアされた溶解物を示し、EインドATE最終溶出液。サンプルは、4~20％SDS-PAGE上で泳動したゲルを銀は、精製されたタンパク質を可視化するために染色しました。 LAP-タウに対応するバンドが同時精製タンパク質が見られるために、対応するアスタリスクといくつかの他のバンドでマークされていることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| N末端融合 | |
| フォワード | 5'- GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - （> 18gsn）-3 ' |
| 逆 | 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - （> 18gsn）-3 ' |
| C末端融合 | |
| フォワード | 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - （> 18gsn）-3 ' |
| 逆 | 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - （> 18gsn）-3 ' |
表1：シャトルベクターに挿入するためのORFまたは対象を増幅するためのフォワードおよびリバースプライマー。 attB部位は、太字で強調表示され、GSNは、18以上の遺伝子特異的ヌクレオチドがプライマーに付加されていることを意味します。
| ステップ | 温度 | 時間 | |
| 最初の変性 | 94°C | 2分 | |
| PCR増幅サイクル（35） | 変性 | 94°C | 30秒 |
| 焼きなまし | 55℃（プライマーのTmに応じて） | 30秒 | |
| 延長する | 72°C | 1分/キロバイト | |
| ホールド | 4°C | 無期限に | |
表2：利息のORFの増幅のためのPCR条件。
| ベクター | フォワードシークエンシングプライマー | リバースシークエンシングプライマー |
| シャトルベクター | 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' | 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ' |
表3：シャトルベクターのためのフォワードおよびリバース配列決定プライマー。
| ID | 構造 | 親の | プロモーター | バクRES | ママRES | テトREG？ |
| pGLAP1 | N-用語EGFP-TEV-Sペプチド | pcDNA5 / FRT / TO | CMV | アンプ | HYG | はい |
| pGLAP2 | N末端フラッグ-TEV-Sペプチド | pcDNA5 / FRT / TO | CMV | アンプ | HYG | はい |
| pGLAP3 | N-用語EGFP-TEV-Sペプチド; C-用語V5 | pEF5 / FRT-V5 | EF1A | アンプ | HYG | いいえ |
| pGLAP4 | N末端フラッグ-TEV-Sペプチド。 ; C-用語V5 | pEF5 / FRT-V5 | EF1A | HYG | いいえ | |
| pGLAP5 | C-用語SペプチドPreProt×2-EGFP | pEF5 / FRT-V5 | EF1A | アンプ | HYG | いいえ |
表4：変数のプロモーター、エピトープタグ、およびNまたはC末端タンパク質タグ付けのためのDox誘導性発現の機能と利用できるLAP / TAPベクターのリスト。ベクターは、市販されています。 BAC RESは、細菌耐性マーカーを示し、ママRESは、哺乳動物細胞の耐性マーカー、テトREGを示しますか？式はテト/ドックス調節可能であるかどうかを示します。
| ベクター | フォワードシークエンシングプライマー | リバースシークエンシングプライマー |
| pGLAP1 | 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' | 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' |
| pGLAP2 | 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' | 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' |
| pGLAP3 | 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' | 5 'TAGAAGGCACAGTCGAGG 3' |
| pGLAP4 | 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' | 5 'TAGAAGGCACAGTCGAGG 3' |
| pGLAP5 | 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' | 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 ' |
表5：pGLAPベクトルのためのフォワードおよびリバース配列決定プライマー。
Discussion
概説プロトコルは、LAP-タギングベクターに目的の遺伝子のクローニングを記載し、誘導性LAP-タグ付けされた安定な細胞株の生成、およびプロテオーム解析のためのLAP-タグ付けされたタンパク質複合体の精製。他のLAP / TAP-タギングアプローチに関して、このプロトコルは、任意の細胞経路内のタンパク質の局在化およびタンパク質 - タンパク質相互作用をマッピングするための高スループットアプローチに適合するように合理化されています。このアプローチは、広くいくつか例を挙げると、細胞周期進行、有糸分裂紡錘体アセンブリ、紡錘体極の恒常性、およびciliogenesisための重要なタンパク質の機能的特徴に適用されており、これらのタンパク質の誤調節は、ヒトの疾患15に導くことができる方法の理解を助けています16,19,20。たとえば、私たちのグループは最近定義するには、スピンドル・アセンブリ15,21にSTARD9の有糸分裂キネシン（候補癌ターゲット）の機能と規制を定義するには、このシステムを利用しますTctex1d2ダイニン軽鎖間の新たな分子リンク そして、ショートリブ多指症症候群（SRPS）19、およびMID2ユビキチンリガーゼの突然変異は、X連鎖知的障害者16につながることができますどのように理解するための新たな分子リンクを定義します。他の研究室では、正常なTctn1、マウスヘッジホッグシグナリングのレギュレータは、組織に依存した方法22,23で規制繊毛膜組成とciliogenesisこと繊毛病関連タンパク質複合体の一部であると判断したものを含め、この方法を適用しています。したがって、このプロトコルは、広く任意の細胞経路の切開に適用することができます。
このプロトコルにおける重要なステップは、ハイグロマイシン耐性であるLAPタグ安定な細胞株の選択です。特別なケアは、コントロールプレート内のすべてのセルが増幅するための実験プレートに焦点を選択する前に死んでいることを確実にするために注意すべきです。ハイグロマイシンもADDEすることができますLAP-タグ付けされた安定な細胞株のルーチン細胞培養中のdはさらに、すべての細胞がFRT部位での関心のLAP-タグ付けされた遺伝子を維持することを確実にします。我々は、すべてLAPタグタンパク質は機能的で、タンパク質の機能をテストするために使用することができる場所でアッセイを有することが重要であるということだろうと警告します。タンパク質の機能をテストするために使用されるアッセイの例は、siRNA誘導性の表現型のインビトロ活性アッセイで救助を含みます。大LAP-タグを付加した任意の潜在的な問題に対処するために、我々は以前に、目的のタンパク質の機能および局在化を阻害する可能性が低いFLAGのような小さいタグを含むこのシステムと互換性TAP-タグベクトルを生成しています4。また、LAP-タギングベクターは、C末端LAPタグタンパク質またはLAP / TAPタグがNで許容されていない場合に使用することができ、このシステムと互換性のあるC末端TAPタグ化タンパク質を生成するために存在しますタンパク質の末端。また、第精製バッファー（LAPX N）の電子塩と洗剤濃度が増加またはnoneまたはあまりにも多くの相互作用が認められた場合に精製ジェンシーが低下するように改変することができます。同様に、タンデムアフィニティー精製法は、単一の精製手順と弱い相互作用が少ない又は全く相互作用が同定されている場合、単一の精製スキームを使用することができ、したがって、失われる可能性がより厳しいです。
タンパク質の局在化および精製研究24,25のためのタグ付け、大規模なGFPタンパク質を可能にする他のGFPのエピトープ標識のアプローチが存在することに留意することが重要です。これらはすべて、調節要素、模倣内因性遺伝子発現24が含まれ、それらの天然の環境から関心のGFPタグ遺伝子を発現する細菌人工染色体を利用BAC TransgenOmicsアプローチが含まれます。さらに最近では、CAS9 /シングルガイド付きRNA（sgRNA）リボ核タンパク質複合体（RNPを）が終了するために使用されてきましたogenouslyそれらの内因性のゲノム遺伝子座25からGFPタグ遺伝子の発現を可能にするスプリットGFPシステムと目的の遺伝子にタグを付けます。これらのアプローチの両方は、LAP-タギングプロトコルと比較して、内因性の条件の下でタグ付けされたタンパク質の発現を可能にするが、彼らは関心のタグ付けされた遺伝子の誘導および調節可能な発現を可能にしない、ここで説明します。さらに、それらは、TAPのためのタンデムエピトープタグに適用されるには至っていません。他のタグ付けシステムはまた、誘導性エピトープタグ安定な細胞株を生成するために、ここで説明したシステムと互換になるように修正することができることに留意することも重要です。例えば、近接依存ビオチン識別（BioID）が原因で相互作用するタンパク質26の間の空間的および時間的関係を定義する能力にかなりの注目を集めています。この技術は、大腸菌ビオチンリガーゼBirAをの無差別歪み、ビオチン化タンパク質融合を利用します酵素の〜10nmの半径内の任意のタンパク質は、S。ビオチン化タンパク質は、次いで、親和性は、ビオチンアフィニティー捕捉を用いて精製し、質量分析により組成を分析します。 BirAを、複雑な27の中に弱い相互作用パートナーを検出するために特に適していますこれは、あっても一時的に、近接して任意のタンパク質をビオチン化されます。さらに、精製スキームは、内因性のタンパク質 - タンパク質相互作用が無傷のままであり、従って、偽陽性の割合を減少させる、変性条件下で行うことができることを必要としません。私たちの現在のプロトコルの中で、あるBirA-タギングベクターによるpGLAP1ベクトルの置換は、近接性に基づいてそれらを検出するとの親和性に基づいてタンパク質 - タンパク質相互作用を同定するから、このシステムを変換することができます。多くの酵素 - 基質相互作用の間及び時空間のタンパク質 - タンパク質INTEをマッピングする場合のように、このようなシステムは、一過性タンパク質相互作用を検出するために非常に有利であろう中心体と繊毛26,28のために行われているように定義される構造内ractions。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flp-In T-REx Core Kit | Invitrogen | K6500-01 | Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression |
| PETG, 5x | Nunc, Inc. | 73520-734 | Roller bottle for growing cells |
| PETG, 2.5x | Nunc, Inc. | 73520-420 | Roller bottle for growing cells |
| Cell stackers | Corning CellSTACK | 3271 | Cell stacker for growing cells |
| 500 ml conical centrifuge tubes | Corning | 431123 | Tubes for harvesting cells |
| Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | Rabbit anti GFP antibody |
| Affiprep Protein A beads | Biorad | 156-0006 | Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies |
| Dimethylpimelimidate (DMP) | ThermoFisher Scientific | 21667 | Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads |
| TLA100.3 tubes | Beckman | 349622 | Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step |
| TEV protease | Invitrogen | 12575-015 | Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins |
| Precession Protease | GE Healthcare | 27-0843-01 | Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins |
| S-protein agarose | Novagen | 69704 | Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes |
| QIAquick DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704/28706 | For use in purifying PCR products from an agarose gel |
| BP clonase II | Invitrogen | 11789020 | Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector |
| LR clonase II | Invitrogen | 11791020 | Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector |
| ccdB Survival 2 T1R E. coli | Invitrogen | A10460 | Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | Transfection reagent for transfecting vectors into human cells |
| Tetracycline | Invitrogen | Q100-19 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Doxycycline | Clontech | 631311 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | Drug for selecting stable LAP-tagged integrants |
| Kanamycin | Corning | 61-176-RG | Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-5 | Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies |
| 4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels | Biorad | 4561094 | Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates |
| Silver Stain Plus Kit | Biorad | 1610449 | Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process |
| Coomassie Blue stain | Invitrogen | LC6060 | Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible |
| Shuttle vector pDONR221 | Invitrogen | 12536017 | Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest |
| Flippase expressing vector pOG44 | Invitrogen | V600520 | Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 1610747 | Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix |
| Luria broth (LB) media | Fisher | BP9723-2 | Used for growing DH5α bacteria |
| DNA miniprep kit | Promega | A1222 | Used for making DNA plasmid minipreps |
| DMEM/F12 media | Hyclone | SH30023.01 | For growing Hek293 human cells |
| FBS lacking Tet | Altanta Biologicals | S10350 | Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines |
| Trypsin | Hyclone | SH30042.01 | For lifting Hek293 cell foci from plates |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | Used for making protocol buffers, EDTA-free |
| 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol | Roche | 11332473001 | Used for making protocol buffers |
| PBS | Corning | 21-040-CM | Used for making protocol buffers |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | Used for making protocol buffers |
| Sodium Borate | Fisher | S249-500 | Used for making protocol buffers |
| Boric Acid | Fisher | A78-500 | Used for making protocol buffers |
| Ethanolamine | Calbiochem | 34115 | Used for making protocol buffers |
| NaCl | Fisher | P217-3 | Used for making protocol buffers |
| KCl | Fisher | BP358-10 | Used for making protocol buffers |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172-25 | Used for making protocol buffers |
| MgCl2 | Fisher | M33-500 | Used for making protocol buffers |
| Tris base | Fisher | BP152-5 | Used for making protocol buffers |
References
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