Qui, descriviamo una procedura per visualizzare e quantificare con alta sensibilità le interazioni endogeni tra il reticolo endoplasmatico e mitocondri nelle cellule fissate. Il protocollo è dotato di un ottimizzato in test legatura situ prossimità targeting inositolo 1,4,5-trifosfato recettore / glucosio-regolata proteina 75 / D complesso canale anionico / cyclophilin voltaggio-dipendente all'interfaccia membrana mitocondriale associata.
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Articolo metodologico
Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le interazioni strutturali tra il reticolo endoplasmatico (ER) e le membrane mitocondriali, in domini noti come membrane associate ai mitocondri (MAM), sono hub cruciali per la segnalazione cellulare e il destino cellulare. In particolare, questi siti di contatto inter-organelli consentono il trasferimento di calcio dal reticolo endoplasmatico ai mitocondri attraverso il complesso di canalizzazione del calcio del canale anionico voltaggio-dipendente (VDAC)/proteina 75 regolata dal glucosio (GRP75)/recettore dell'inositolo 1,4,5-trifosfato (IP3R). Sebbene questo compartimento subcellulare sia oggetto di intense indagini sia in condizioni fisiologiche che patologiche, non esiste un metodo semplice e sensibile per quantificare la quantità endogena di contatto ER-mitocondri nelle cellule. Allo stesso modo, i MAM sono strutture altamente dinamiche e non esiste un approccio adatto per seguire le modifiche delle interazioni ER-mitocondri senza sovraespressione proteica. Qui, riportiamo un protocollo ottimizzato basato sull'uso di un saggio di legatura di prossimità in situ per visualizzare e quantificare le interazioni endogene ER-mitocondri in cellule fissate utilizzando la stretta vicinanza tra le proteine della membrana mitocondriale esterna (VDAC1) e della membrana ER (IP3R1) all'interfaccia MAM. Esperimenti simili di legatura di prossimità in situ possono essere eseguiti anche con le coppie di anticorpi GRP75/IP3R1 e ciclofilina D/IP3R1. Questo test offre numerosi vantaggi rispetto ad altre procedure di imaging, in quanto è altamente specifico, sensibile e adatto a test in più condizioni. Pertanto, l'uso di questo saggio di ligazione di prossimità in situ dovrebbe essere utile per comprendere meglio le regolazioni fisiologiche delle interazioni ER-mitocondri, nonché il loro ruolo in contesti patologici.
Introduzione
Mitocondri e reticolo endoplasmatico (ER) non sono organelli indipendenti nella cellula, ma interagiscono strutturalmente e funzionalmente a siti di contatto definite membrane reticolo endoplasmatico mitocondri-associato (MAM). Infatti, DAM corrispondono alle regioni in cui le membrane del ER e mitocondri sono strettamente apposto, permettendo interazioni tra proteine da entrambi i lati. Ciò nonostante, le membrane di questi organelli non si fondono in queste regioni, in modo da mantenere le loro entità separate. I DAM svolgono un ruolo cruciale nel calcio (Ca 2+) e il trasferimento dei fosfolipidi da ER a mitocondri, impattando il metabolismo energetico....
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Protocollo
1. preparazione di soluzioni
- Preparare 10% di formaldeide in PBS (bassa percentuale di sale) diluendo 5.5 ml di formaldeide al 37% in 14,5 ml di PBS. Preparare 1 M glicina, pH 8,0, sciogliendo 3,8 g di glicina in 50 ml di PBS; diluire questa soluzione per ottenere 100 mM glicina in PBS 1x.
- Preparare 0,1% Triton-X100 in 1x PBS. Preparare 20x Saline sodio citrato (SSC) utilizzando 3,0 M di cloruro sodico e 0,30 M citrato trisodico preparato in un buffer di acqua deionizzata a pH 7,0 a 25 ° C. Diluire questo buffer a 1x e 0,01X con acqua deionizzata.
2. Fissazione delle cellule
NOTA: Abbiamo ....
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Risultati
Sulla base della nostra esperienza con questo protocollo, possiamo tranquillamente consigliare questo metodo per la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni ER-mitocondri nelle cellule fisse. Immagini rappresentative della legatura in prossimità interazioni ER-mitocondri situ test-visualizzato nella linea di cellule Huh7 epatocarcinoma, utilizzando diverse paia di anticorpi, sono mostrati. Come mostrato in figura 2 mediante microscopia a f.......
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Discussione
Nel complesso, i nostri studi indicano che il saggio di legatura di prossimità in situ è davvero una strategia rilevante per seguire e quantificare le interazioni endogene ER-mitocondri in cellule fisse, senza la necessità di utilizzare fluorofori specifici per organelli o proteine fluorescenti. L'uso specifico degli anticorpi VDAC1/IP3R1 è stato adattato per studiare le interazioni ER-mitocondri nelle cellule HuH7. Tuttavia, possono essere utilizzate isoforme alternative di VDAC e IP3R, a seconda del tipo di ce.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo tutte le persone nel nostro laboratorio che hanno contribuito a ottimizzare e validare il protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da INSERM e l'agenzia nazionale di ricerca (ANR-09-JCJC-0116 E ANR-11-BSV1-033-02). ET è stato sostenuto durante il suo dottorato di ricerca da un assegno di ricerca dal Ministero francese dell'istruzione superiore e della ricerca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Formaldeide | Sigma | F-8775 | |
| Glicina | Sigma | G-8898 | |
| Triton | Sigma | T8532 | |
| 35 mm Piastre di coltura con fondo in vetro | MatTeK corporation | P35G-0-14-C | |
| Soluzione bloccante | Sigma | DUO-92004 o DUO-92002 | fornita nelle sonde Duolink PLA, anticorpo Sigma |
| VDAC1 | Abcam | ab14734 | |
| IP3R1-H80 anticorpo | Santa Cruz | sc28614 | |
| anticorpo CypD | Abcam | ab110324 | |
| Grp75 anticorpo | Santa Cruz | sc13967 | |
| TBS 10x | euromedex | ET220 | Diluire per ottenere 1x |
| Tween 100x | euromedex | 2001-B | diluire in TBS per ottenere 0,01% |
| Sonde PLA Topo MINUS | Sigma DUO-92004 | Duolink, Sigma | |
| PLA Sonde Rabbit PLUS | Sigma | DUO-92002 | Duolink, Reagenti di rilevamento Sigma |
| Duolink rosso | Sigma | DUO-92008 | Duolink, |
| Soluzione di legatura | Sigma | DUO-92008 | Parte dei reagenti di rilevamento Duolink rosso, Sigma |
| Ligasi | Sigma | DUO-92008 | Parte dei reagenti di rilevamento Duolink rosso, Soluzione di |
| amplificazione | Sigma | DUO-92008 | Parte dei reagenti di rilevamento Duolink rosso, Sigma |
| Polimerasi | Sigma | DUO-92008 | Parte dei reagenti di rilevamento Duolink rosso, Supporto di montaggio Sigma |
| Duolink | Sigma | DUO80102 | Duolink, Sigma |
| Softwares | |||
| BlobFinder | è un software distribuito gratuitamente in grado di eseguire calcoli sulle cellule da immagini di microscopia a fluorescenza. Questo software può essere scaricato gratuitamente dal Centro per l'analisi delle immagini dell'Università di Uppsala, che ha sviluppato il software e il lavoro è stato supportato dal progetto europeo ENLIGHT del 6° PQ e da Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm | ||
| software | Può essere scaricato gratuitamente da: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html |
Riferimenti
- Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
- Giorgi, C., et al.
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Ristampe e permessi
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