Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל Published: November 29, 2016 doi: 10.3791/54901
Automatic Translation
1, 1,2
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center

Summary

אנו מציגים שיטת immunofluorescence מבוסס הדמיה ללוקליזציה במרחב ובזמן של ERK הפעיל הגזור ג בלוטת מין elegans. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים להדמיה של כל איתות או חלבון מבני ג elegans בלוטת המין, סיפק מגיב נוגדן מתאים זמין.

Abstract

האות התאי השמור באבולוציה transducing ומסלול RTK-RAS-ERK הוא קינאז-איתות חשוב מפל השולט תהליכים תאיים ו התפתחותיים מרובים בעיקר באמצעות הפעלה של ERK, קינאז המסוף של המסלול. רגולציה הדוקה של פעילות ERK חיונית להתפתחות נורמלית הומאוסטזיס; תוצאות פעילות ERK יתר על מידת תרבות תאים מופרזת, תוך תת ERK גורמת מוות של תאים. ג elegans היא מערכת מודל רב עוצמה סייעה לאפיין את הפונקציה ורגולציה של מסלול איתות RTK-RAS-ERK במהלך הפיתוח. בפרט, ומסלול RTK-RAS-ERK חיוני ג elegans פיתוח germline, המהווה את המוקד של שיטה זו. באמצעות נוגדנים ספציפיים הצורה הפעילה, diphosphorylated של ERK (dpERK), דפוס הלוקליזציה הסטריאוטיפי ניתן דמיין בתוך germline. בגלל דפוס זה הוא במרחב ובזמן בשליטהed, היכולת assay dpERK reproducibly שימושית כדי לזהות הרגולטורים של מסלול המשפיעים משך אות dpERK משרעת ובכך פיתוח germline. כאן אנו מדגימים כיצד לנתח בהצלחה, כתם, ותמונה dpERK בתוך ג בלוטת מין elegans. שיטה זו יכולה להיות מותאמת עבור לוקליזציה המרחבי של כל איתות או חלבון מבני ג elegans בלוטת המין, ובלבד נוגדן תואם immunofluorescence זמין.

Introduction

טירוזין קינאז קולטן (RTK) סרקומה -RAt (RAS) אות -Extracellular מוסדרים קינאז (ERK) מסלול ומשדר אותות תאיים דרך מפל קינאז משומר שתוצאתו זירחון והפעלה של ERK 1-3. חלבונים ERK הם חברי MAP סרין / תראונין פרולין מכוונת משומר (חלבון הופעל mitogen) המשפחה קינאז, ושמופעלים ישירות על ידי MEK באמצעות זירחון כפול על תראונין (T) ו טירוזין (Y) של מוטיב טיי משומר. ERK Active (המכונה diphosphorylated ERK, או dpERK) אז מסדיר תהליכים תאיים והתפתחותיות רבים באמצעות זירחון של סוללה של מצעים במורד 1-3. לפיכך פעילות ERK חריגה מובילה סלולארי רבים ופגמים התפתחותיים 4-7.

רגולצית מחמירות פעילות ERK היא קריטית להתפתחות נורמלית: במערכות יונקות יותר מדי פעילות ERK מובילה מוביל תרבות תאים מופרזתלצמיחה בשעור; מעט מדי פעילות מוביל מוות של תאים 4,6. בנוסף, שינויי משך פעילות ERK גם יכולים להוביל לתוצאות ברורות: בתאי PC12, הפעלת ERK למשך 30 דקות או פחות פרוליפרציה תא, אך הפעלת ERK למשך 60 דקות או יותר גורם בידול עצבי 8,9. רגולציה הדוקה של פעילות ERK כן חיונית בבירור לפיתוח הומאוסטזיס נורמלי.

סי אלגנס הוא מערכת מודל עצמה, וגנטי נזילה לנתח את הפונקציה ורגולציה של ומסלול RTK-RAS-ERK איתות 3,10-15. יחסית למערכות יונקות, אשר מכילות מספר רב של גנים עבור ראס ERK, ג elegans מכיל גן אחד RAS (לתת-60) ואת גן ERK אחד (MPK - 1), מה שהופך אותו מערכת קלילה גנטי יותר שבו לנתח את הפונקציה של מסלול זה 3,10-14. ג germline elegans הוא למעשה צינור שמורכב mitoticתאי גזע בסופת דיסטלי ו ביציות בוגרות בקצה הפרוקסימלי שלו (איור 1) 16. תאי נבט ליזום המיוזה רק הפרוקסימלי לאזור mitotic דיסטלי, והתקדמות דרך prophase meiotic המורחבת (pachytene), לאחר מכן הם מתחילים להיווצר ביציות באזור לולאה, ולבסוף עוברת הבשלת הביצית באזור הפרוקסימלי 16.

מחקרים גנטיים ממעבדות מרובות, כולל משלנו, הראו כי ומסלול RTK-RAS-ERK חיוני להתפתחות germline ב C. elegans 12,13,15,17-19. באופן ספציפי, מצאנו כי בקרות ERK ומתאם לפחות תשעה תהליכים ביולוגיים ברורים במהלך ההתפתחות germline, החל מתגים התפתחותיים כגון אפופטוזיס תאי נבט לתא תהליכים ביולוגיים כגון 11,18 צמיחה הביצית. בדומה במערכות יונקות, יותר מדי פעילות ERK ב ג elegans תוצאות germline בייצור ביציות קטנות מרובות, בעוד מדי liתוצאות פעילות ttle ב ביצית אחד גדולה 11. לפיכך רגולציה הדוקה של dpERK חיונית להתפתחות germline נורמלית. הצורה הפעילה של ERK, דמיין כפי נוגדן ספציפי dpERK, מציגה דפוס לוקליזציה סטריאוטיפי, דינמי, bimodal: dpERK הוא גבוה במהלך אמצע pachytene (1 אזור, איור 1), נמוך באזור הלולאה וגבוה שוב בוגר ביציות (2 Zone, איור 1). לאחרונה, מצאנו כי תזונה פועלת באמצעות פקטור הגדילה דמוי האינסולין לרצפטור 1 (DAF-2) כדי להפעיל ERK אזור 1 12; עבודות קודמות הראו כי האות הזרע (באמצעות טירוזין קינאז קולטן Ephrin) מפעיל ERK אזור 2 13.

בהתחשב בכך פונקציות ERK כהיותו רֵיאוֹסטָט ב germline להסדיר צמיחת ביצית, לוקליזציה במרחב ובזמן, כמו גם משרעת של dpERK, הוא מפתח להבנת תוצאת האיתות הרגילה שלו. באמצעות השיטה המתוארת כאן, שינוייםלוקליזציה סטריאוטיפית של dpERK ניתן לנטר בקלות תחזיות נגזרו על ההשפעה של ההפרעות הסביבתיות או גנטיות על פעילות ERK ובכך פונקציה. לכן, מנסה לאמוד עבור dpERK מאפשר הבנה מקיפה של התפקיד שלו בעת פיתוח germline.

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן הוא בעיקר עבור מערכת המודל חסר חוליות ג elegans, ועוקב כל קווים מנחים אתיים שנקבעו על ידי המוסד.

1. תחזוקת בעלי החיים

  1. לשמור על ג elegans עבודת תרבויות מניות על 20,21 צמיחה נמטודות בינוני (NGM, ראה לוח חומרים) אגר זורעים עם E. coli OP50.
  2. לשמור על מניות תולעת בטמפרטורות שבין 16 ° C ו- 25 ° C.
    הערה: Culturing תולעי תוצאות בטמפרטורות גבוהות בשיעור צמיחה מהיר יותר, לעתים קרובות, פיתוח germline סוטה וגדלי גוזלים נמוכים. בנוסף, גנוטיפים רגיש טמפרטורה יציג פנוטיפים שונים בטמפרטורות שונות.
  3. עבר תולעי צלחות חדשות NGM כל 2 - 3 ימים, תלוי בקצב הצמיחה שלהם כדי לשמור על אספקה ​​קבועה של תולעים שיאכלו טוב.
    הערה: עבור כל בניסוי נתון המעורבים רמות dpERK, תולעים אסורים להיות מתקבל מורעב או קהלצלחת ed. צפיפות או משפיע רעב אינסולין איתות בתולעים 22, ואיתות אינסולין המווסת פעילות 12 ERK. לכן תולעי מצלחות מורעבות או צפופות תגרומנה דפוסי מכתים משתנים וקשים אל-להתרבות.

2. Dissection של תולעים בוגרות עבור קבלת בלוטות המין

  1. פיק 100 - 150 WT (N2) או הגנוטיפ הרצוי של תולעים בשלב ההתפתחותי הרצוי וספציפי (L1, L2, L3, L4, מבוגרים, וכו '.) ב 100 μL של חיץ M9 בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
  2. מלאו את צינור microcentrifuge עם 900 μL של חיץ M9 (ראה לוח חומרים). בצנטריפוגה צינורות ב 1000 XG ב microcentrifuge עבור 1 דקות בטמפרטורת הסביבה.
  3. הוצא בעדינות 900 μL של למאגר M9 וזורק. הסר את החוצץ תחת מיקרוסקופ לנתח כדי להבטיח את התולעים אינם מוסרים בטעות.
  4. חזור על שלבים 2.2 - 2.3 פעמיים נוספות עם M9 טרי חיץ בכל פעם.הדבר מבטיח כי כל חיידקים כי בוצעו על עם התולעים נשטפים ביעילות משם.
  5. לאחר שטיפה של דבר להסיר 900 μL של חיץ M9 מהצינור וזורקים.
  6. מעבירים את חיץ 100 μL של M9 הנותרים המכיל את 100 - תולעים 150 עם טיפ 200 μL-micropipette לצלחת שעון זכוכית תחתית שטוחה. ודא קצה micropipette נחתך ב -10 בסימן μL לפני השימוש. לא חיתוך הקצה יגרום מריחה של התולעים.
  7. להוסיף 1 - 3 μL של 0.1 M levamisole כדי בצלחת זכוכית שעון המכיל את התולעים חיץ M9. מערבולת בעדינות את levamisole ואת M9 לאפשר אפילו ערבוב עד תולעים להפסיק לנוע.
    הערה: מניות Levamisole ניתן לאחסן ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. הנה, להשתמש הריכוז הגבוה של 1 - 3 מ"מ ממה תואר בספרות 23 של 0.2 - 0.25 מ"מ של levamisole על מנת לקבל אובדן מהיר של ניידות החיות. אם החיות להתנגח במקום במשך מדי lאונג בתרחיף הנוזלי, הדפוסים כתוצאה של dpERK ב בלוטות המין יכולים להיות משתנים (עקב מתח או חוסר תזונה או שניהם). עוד דפוסי מכתים לשחזור הושגו עם 1 - 3 levamisole מ"מ לנתיחה.
  8. צרף שני 25 מחטים G לשני 1 מזרקים מ"ל (בגודל של המזרק לא משנה, מד של מחט הוא קריטי). מזרק תפקיד אחד בכל יד (איור 2).
  9. תחת מיקרוסקופ לנתח, למקם את כל מחט מתחת ומעל כל תולעת כפי שמוצגת באיור 2 ומקום חתוך דק על התולעת ליד נורת בלוע השנייה בתנועה מספרית דמוית. לאחר חתך אחד התולעת הלאה לבעל החיים הבאים עד שכל החיות בצלחת קוצצו לפחות פעם אחת.
    הערה: שימו לב כי צעדים 2.8 - 2.9 הם בתקופה רגישה. לנתח כל התולעים בצלחת בתוך פחות מחמש דקות עבור דפוס dpERK לשחזור. פעמים לנתיחה ארוכות תגרומנה כיבוי של אות dpERK, במיוחד Zאחד 1. התאם את מספר תולעים בכל סבב של דיסקציה (כלומר, 50 תולעים לעומת 150) במידת הצורך להישאר בתוך מסגרת הזמן המוקצב.
    1. אם ברצונכם לקבל בלוטת מין מעוקמת אינה גלויה במהלך הניתוח, אל תנסו לבצע קיצוץ נוסף חיה אותו. בדרך כלל כי רק גזירת החיה ולא לגרום שחול של בלוטת המין. במקום, על מנת להעביר את החיה הבאה. תולעים שבו בלוטות המין לא extrude יופיעו ככזה בשקופיות כי תיעשה בסעיף 6 וניתן להתעלם ממנו במהלך הדמיה
      הערה: דרך כל השלבים לנתיחה ועיבוד, חשוב לזכור כי בלוטת המין יישאר מחובר לגוף / הפגר. אל תכריחו את בלוטת המין והגוף בנפרד עם המחט. פעמים רבות דמעה סוטה ברקמת האשכים בניסיון לנתק את בלוטת המין מהגוף יכולות לגרום אות נוגדן מזויפת. הגוף / פגר ניתן להתעלם במהלך שלבי ההדמיה (סעיף 6), ורק בלוטת המין צלם. בנוסף, סוםetimes התאים במעי יכולים גם לשמש בקרה פנימית כפי / שולט סומטיים עבור הנוגדן להיות assayed.

3. קיבוע בלוטת מין

  1. לאחר דיסקציה תושלם, להוסיף 2 מיליליטר של 3 paraformaldehyde% (PFA) ישירות צלחת זכוכית שעון המכילה את 100 μL של M9 והחיות הגזורות ומכסי Parafilm. מניחים את צלחת זכוכית שעון מכוסה במנדף כימי.
    זהירות: PFA הוא חומר כימי מסוכן. לפיכך, קיבעון צריך להתבצע במנדף כימי קטר.
  2. לדגור על RT במשך 10 דקות.
  3. בעזרת פיפטה פסטר זכוכית 9 הפנויה "להוסיף 3 מ"ל של 1x PBS-T (ראה לוח חומרים) כדי בצלחת זכוכית שעון המכיל את חיות מבותרות. מערבבים על ידי ציור הפתרון PFA ואת 1x PBS-T עם החיות גזור לתוך פסטר פיפטה ושחרור בעדינות בחזרה לתוך צלחת זכוכית שעון. לא מערבולת הצינורות במהלך הכביסות.
  4. באמצעות freפיפטה זכוכית פסטר sh לצייר את 5 מ"ל של נוזל (המכיל תולעים גזור, PFA ו 1x PBS-T) מצלחת שעון זכוכית לתוך פיפטה פסטר ולהעביר את התוכן לתוך צינור 5 מ"ל זכוכית חרוטי טרי.
  5. צנטריפוגה צינורות חרוטים במשך 30 שניות בצנטריפוגה קלינית ב 1000 x ז. השתמש טפטפות פסטר זכוכית צינורות חרוטים כמו בלוטות מין גזורות מקל הפלסטיק.
  6. סר וזורק supernatant מטפל כדי לא להפריע לבעלי החיים הגזורים. הסר את הנוזל לאחר כל שטיפה מצינור החרוטים תחת מיקרוסקופ לנתח כדי לא להשפיע על בלוטות המין הגזורים, ולמזער אובדנם.
  7. בעזרת פיפטה פסטר טרי, מוסיפים 5 מ"ל של 1x PBS-T אל צינורות חרוטי. צנטריפוגה צינורות חרוטים בצנטריפוגה קליני במשך 30 s ב 1000 x ז. סר וזורק supernatant מטפל כדי לא להפריע לבעלי החיים הגזורים.
  8. חזור על שלב 3.7 עבור סכום כולל של שלוש פעמים.
  9. בעזרת פיפטה פסטר טרי, להוסיף 2 מ"ל של 100%מתנול אל הצינורות, בעדינות לערבב את בלוטות המין עם מתנול ידי עריכה לתוך פיפטה פסטר. דגירה הצינור ב -20 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 1 ח.
    הערה: גזור בלוטות המין ניתן לאחסן מתנול עד 2 ימים עבור מכתים dpERK. אחסון עבור יותר מ -2 ימים ועד 2 שבועות תואם עם יישומים מכתימים נוגדן אחרים, כגון נוגדנים נגד Lamin, אבל לא עם נוגדן dpERK.
  10. לאחר זמן דגירה הרצוי, חזור על שלב 3.7 עבור סכום כולל של שלוש פעמים כדי לשטוף את בלוטות המין. לא מערבולת הצינורות במהלך הכביסות. לאחר שטיפה של דבר לעזוב 500 μL של 1x PBS-T בצינור חרוטי 5 מ"ל.
  11. בעזרת פיפטה פסטר טריים להעביר את תכולת שפופרת זכוכית חרוטי לתוך צינור 1 מ"ל זכוכית טריים (6 מ"מ x 50 מ"מ). אפשר החיות גזור להתיישב על ידי כוח המשיכה במשך 5 - 10 דק '.
  12. בעזרת פיפטה פסטר טריים תחת מיקרוסקופ לנתח, להסיר כמה שיותר לשטוף ככל האפשר מן שנינות צינורות זכוכית 1 מ"לHout מפריע בלוטות המין הגזורות.

4. חסימת וטיפול נוגדן ראשוני

  1. הוספת 100 μL של 30% רגיל עיזים סרום (NGS) המדולל 1x PBS-T (ראה לוח חומרים) לבעלי החיים גזורים צינורות זכוכית 1 המ"ל. 30% NGS משמש למאגר החסימה. מכסים את הצינור עם Parafilm כדי למנוע אידוי של הנוזל. לדגור על RT במשך שעה 1 או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. לאחר זמן הדגירה הרצוי, להסיר את חיץ החסימה בעזרת פיפטה פסטרה טריה, לניקוז נוזלים ככל האפשר. שימוש במיקרוסקופ לנתח כדי להבטיח כי בלוטות מין אינם נערכו לפי פיפטה פסטר.
  3. לדלל את הנוגדן MAPKYT (ראה לוח חומרים, הנזכרים בשיטה זו כמו dpERK) בשעה 1: 400 ב 30% NGS. הכן דילול נוגדן מספיק כדי להשתמש 100 μL לכל צינור. נוגדן בשימוש, בדילול יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע.
  4. הוספת 100 μL של נוגדנים נגד dpERK בדילול כךlution אל צינורות זכוכית 1 המ"ל המכיל חיות הגזורות. חותם את הצינורות עם Parafilm. דגירת הצינורות ב לילה 4 ° C..
  5. לאחר הדגירה לילה, להוסיף 800 μL של 1x PBST אל צינורות ב RT.
  6. צייר את המדגם בתוך פיפטה פסטר זכוכית טרי לשחרר בעדינות על מנת להבטיח כי בלוטות המין מושעות בצורה אחידה בתוך-T PBS 1x. תנו בלוטות המין ליישב לתחתית עם כוח הכבידה. הסר את supernatant. הדבר מבטיח כי בלוטות המין הגזור נשטפות אבל לא ניזוקו במהלך התהליך.
  7. חזור על שלבי 4.5 - 4.6 סך של שלושה שוטף. לא מערבולת הצינורות במהלך הכביסות. לאחר לשטוף השלישי הקפד להסיר ולסלק supernatant ככל האפשר מבלי להפריע את החיות המבותרות. ודא פיפטה פסטר טרי משמש בכל פעם.

5. טיפול נוגדנים משני

  1. במהלך הנוגדן הראשוני ושוטף להכין דילול עבור הנוגדנים משני. לדלל את והעכבר אנטי seנוגדן condary ב 1: 500 ב 30% NGS. כמו עם הנוגדן הראשוני, השתמש 100 μL לכל צינור. ניתן לאחסן נוגדנים בשימוש ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע.
  2. הוספת 100 פתרון משני נוגדן μL עד 1 צינורות זכוכית המ"ל המכיל חיות הגזורות. כיסוי כל צינור עם Parafilm, ולאחר מכן לעטוף את הצינורות בנייר אלומיניום כדי לשמור את תוכנו של הצינור בחושך. דגירת הצינורות ב RT עבור 2 שעות, ולחלופין על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. לאחר זמן הדגירה הרצוי, להוסיף 800 μL של 1x PBS-T אל הצינורות וחזור על שלבי 4.5 - 4.6 סך של שלוש פעמים. לאחר שטיפה של דבר, להסיר ולסלק כמה שיותר supernatant ככל האפשר תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות פיפטה פסטר טריים.
  4. הכן את הפתרון DAPI במהלך הכביסות עבור נוגדנים משני. לדלל 1 μL של DAPI (ממלאי 1,000x של 1 מ"ג / מ"ל ​​ומאוחסנים ב -20 ° C) in-1 מ"ל של 1x PBST.
  5. להוסיף 800 μL של פתרון DAPI מדולל אל צינורות המכילים אתחיות מבותרות. מכסה את הפה של הצינור עם Parafilm, ועוטף כל צינור בנייר אלומיניום. לדגור על RT במשך 20 דקות.
  6. לאחר הדגירה עם DAPI, להסיר כמה שיותר פתרון DAPI ככל האפשר עם פיפטה פסטר טרי, תחת מיקרוסקופ לנתח כדי לא להפריע לבעלי החיים הגזורים.
  7. להוסיף 1 טיפה של פתרון הרכבה של חצוצרות. עוטפים כל צינור בנייר אלומיניום.
    הערה: המאפשר הדמיה מכתימה dpERK, בלוטות מין מוכתמים צריכות להיות מותקן על מיקרוסקופ מייד. עבור יישומים נוגדנים אחרים כגון סרין פוספורילציה 10 היסטון H3, בלוטות המין יכולים להישמר התקשורת גובר עד 2 שבועות 4 ° C בחושך.

6. שקופיות רכבת והדמיה

  1. מניח שכבה של מעבדה קלטת לאורכו, על גבי, של שתי שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית (25 מ"מ x 75 מ"מ x 1 מ"מ) כפי שניתן לראות באיור 3. מקום שקופית מיקרוסקופ הזכוכית נקיה טרי בין שתי השקופיות המוקלטות.
    הערה: העובישל הקלטת עוזר ליצור כרית agarose בשקופית באמצע. עובי של כרית agarose הוא כמעט שווה לזה של הסרט, כמו הקלטת משמשת spacer ליצירת כרית agarose.
  2. זרוק ~ 200 μL של 2% agarose מומסת (תוצרת מים מזוקקים) בשקופית מיקרוסקופ באמצע. למקם במהירות שקופית נקיה טריה, בניצב ועל גבי, של agarose.
  3. תנו לחזק agarose (1 - 2 דקות).
  4. להסיר את שקופית מיקרוסקופ העליונה בעדינות רבה, כך כרית agarose אינה נהרסת. כרית agarose יכול להישאר מחובר או לחלק העליון או התחתון השקופית. זה לא משנה איזו שקופית כרית agarose נשארת מחוברת, כל עוד הוא משטח חלק של agarose.
  5. בעזרת פיפטה פסטר להעביר חיות גזורות על כרית agarose. הסר את נוזלי עודפים משקופית בעזרת פיפטה פסטר תחת מיקרוסקופ לנתח.
  6. שימוש שיער עפעף או נימי משורטטים בדייקנות, לדחוף א בלוטות המין והמעייםדרך אחת משנייה על מנת לפזר את בלוטות המין החוצה בשקופית.
  7. מכסים את השקופית מיקרוסקופ עם coverslip בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ. תשמור על מנת להבטיח כי coverslip הוא הוריד בעדינות לשקופית עם בועות אוויר מינימאליות מתהוות בין coverslip לבין השקופיות.
  8. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתוך קופסא שקופיות (תיבת שקופיות אטומה עם השקופיות שוכבות, coverslip עד) כדי לאפשר נוזל עודף להתאדות ואשכים להיות משוטחים מעט (בשל המשקל של coverslip על בלוטות המין). ההשטחה הקלה של בלוטות המין מאפשרת הדמיה טובה יותר של צינור אשכים עגול אחר.
    1. לאחר coverslip הוא רכוב, לא להפעיל לחץ על החלק העליון של coverslip עם האצבעות. לעתים קרובות זה לעיוות של בלוטות מין ואובדן אות dpERK.
    2. שטחו את בלוטות המין לילה רק הדמיה אפקטיבית יותר. השקופיות מוכנות לראות ברגע שהם מורכבים. כדי לצלם תמונות מיד, בעדינות לספוגאת הנוזל העודף בין coverslip לבין השקופיות מהזוויות באמצעות רקמות במעבדה נקיות.
  9. לאחר תקופת הלילה, לאטום את שקופיות coverslip עם מייבש לק השקוף על ארבע הפינות של coverslip לבין הגבול שקופית. הלק / coverslip החותם מבטיח כי coverslip לא זז תוך הדמיה ומגן מפני חורבן הדגימות.
  10. תמונת בלוטות המין עם מיקרוסקופ מתחם ב 63X. עם זאת עדשת מיקרוסקופ המטרה יכולות להיות מגוון המבוססת על הזמינות של מיקרוסקופי יישום משתמש. בגלל הגודל של בלוטת המין כולו מאזור השגשוג כדי הביציות גדול יותר ניתן ללכוד בתמונה אחת, את התמונות נלקחות כמו מונטאז 'עם גבולות חופפים כפי שמוצגות באיור 4. 11-14, 18.
    1. במקרים רבים, לערוך את הפגר לאחר הדמית ההרכבה הסופית, כל עוד לא לשינויים גדולים נעשים על תמונת germline. חנות tהוא תמונות גולמיות לאורך התמונה התאספו כדי לאפשר השוואה בין 'לפני' הרכבה / עריכה 'אחרי' הרכבה / עריכה של תמונות.
      הערה: תמונות מיקרוסקופיה אין לשנות שעוצמת אות או רוויה במהלך רכבת מונטאז.

Representative Results

אצל בעלי חיים hermaphroditic מבוגר WT, dpERK הוא מדמיין בדרך כלל באזור אמצע pachytene, 1 אזור, ובסופו של ביציות בוגרות ביותר מ -1 דרך -4 או -5 (אזור 2). הפרעות בדפוס הפעלה זה לשקף שינויים מסלול איתות. Germlines נקבה לא תציין זרע, ובכך אינו מוצגת הפעלה של ERK ב Zone 2, עם הפעלת התורפה היחידה Zone 1. אלו מיוצגות באיור 5.

איור 1
איור 1: ג elegans germline מורפולוגיה. התערבות הפרש לעומת זאת (DIC) תמונה של אנדרוגינוס מבוגר עם אחד בצורת U בלוטת מין זרוע התווה עם הקו הלבן. בלוטת המין למבוגרים hermaphroditic מכיל תאים mitotic בקצה הדיסטלי. התאים mitotic להיכנס המיוזה והתקדמות דרך prophase meiotic (pachytene) מלהתפתח מטורביציות דואר ב בלוטת המין הפרוקסימלי. אזור 1 ו Zone 2 סימן לוקליזציה סטריאוטיפית של dpERK בתוך בלוטת המין למבוגרים hermaphroditic. סולם:. 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: הפגנה של פוזיציות מחט במהלך וניתוחי שמאל:. תצלום של דיסקציה בתהליך. מימין:. מחט עמדות תוך התייחסות התולעת אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: הפגנה של שקופיות Agarose כנות. (א) מניחים קלטת lengthwisדואר ברחבי 2 שקופיות מיקרוסקופ נקיות. מקום שקופית מיקרוסקופ נקי טרי בין שתי השקופיות עם הקלטת כמוצג. השלוש השקופיות הן אחד ליד לאורכו אחר. (ב) הוספה נמס agarose לשקופית במרכז. (C) מקום שקופית מיקרוסקופ טרי בניצב, ועל גבי, השקופית באמצע, נושא את טיפת agarose. ( D) אפשר agarose כדי לחזק. (E) להסיר את השקופית העליונה והותיר אחריו כרית agarose הקרושה. השתמש שקופיות התחתונות עם כרית agarose להרכבת גזור ומוכתמת germlines. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: הדמיה השקופית כמו Montage Montage של germline סוג בר עם DAPI (t.op) ו dpERK (ערוץ תחתון). תמונות שצולמו ב 63X עם גבולות חופפים, תיבות לבנות עבור פנל ו- B ותיבות ירוקות עבור לוח ב 'ו-ג DAPI ו dpERK תמונות עבור כל לוח נלקחו בו זמנית בשני ערוצים שונים. התמונה התאספה מוצגת איור 5 א. סרגל קנה מידה:. 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: Dynamic Temporal / מרחבית הפעלת ERK. (AC) WT (N2) מבוגר (24 השעות האחרונות אמצע L4 שלב הפיתוח) אנדרוגינוס germlines מוכתם עבור DNA (B, DAPI, לבן) dpERK (C, אדום). אות dpERK אזור 1, באזור pachytene, ואת האזור 2, הביציות הבשלות מודגשת. (DF)ערפל-2 (oz40) germlines נקבה (ב 8 שעות האחרונות אמצע L4 שלב הפיתוח) מוכתם עבור DNA (E, DAPI) ו dpERK (F). germlines נקבה צעירה להציג dpERK החלש אזור 1, וב ביצית יחידה באופן זרע עצמאי. אזור 2 הוא זרע תלוי, ובכך נעדר germline הנשי. סרגל קנה מידה:. 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

ERK Active (dpERK) כדלקמן דפוס לוקליזציה מרחבית ודינמי סטריאוטיפית של ג germline elegans. דפוס מרחבי שבלונות dpERK זה (איור 5), משרעת ב מבוגר ג בלוטת המין elegans, יכול להיות מתואמים באופן יעיל עם תהליכים ביולוגיים רבים ERK מסדיר. לדוגמה, חוסר יכולת להפעיל ERK ב Zone 2 תוצאות מעצר ביציות ב prophase של המיוזה, פנוטיפ שנצפתה germlines נקבה שלא צוין הזרע, ובכך לא תפעיל ERK ב ביציות בוגרות (איור 5). הזדווגות עם התוצאות של הזכרים בצבירת יעיל של dpERK אזור 2 germlines נקבת 11,13, בשילוב עם הופעת התבגרות ביוץ ביצית. לכן ניתוח של דפוסים מרחביים והפעלה זמנית של dpERK על הפרעות גנטיות מסוימות (כגון איון גן בתיווך התערבות RNA) או טיפולים כימיים מאפשר זיהוי של גורמי reguאיתות ERK מאוחר ולכן תהליכים ביולוגיים ERK תלויים. ניתוחים כאלה גם לאפשר גילוי אינטראקציות גנטיות רומן בין מסלולי איתות.

צוואר בקבוק קריטי עבור כל ניתוח מבוסס הדמיה הוא הזמינות של חומרים כימיים פונקציונליים, כגון נוגדנים ספציפיים ליישום. אם ריאגנט כזה אז שיטות כגון זה המתואר לעיל ניתן להתאים בקלות לניתוח דפוס לוקליזציה עבור כל חלבון של עניין. היישום ובכך הוא מוגבל על ידי הזמינות של נוגדני תפקוד. בנוסף, כיוון שאמצעי מתאר דיסקציה מכתים בכל פעם התפתחותי נתון, זה רק מאפשר לכידה של מידע במסגרת אחת זמן, ואינו לשפוך אור על הדינמיקה או תקנה חלבון בזמן אמת או שיעור מחזור חלבון.

השיטה המתוארת לעיל מותאמת אל פרנסיס et. 23, והוא שונה מן מ סידו ו דאןethod 24 לשחול בלוטת המין מכתים נוגדן. השיטה המבוססת על פרנסיס et al. תיקרא "שיטת ההשעיה" ושיטת סידיו ו דאן נקראה "שיטת פיצוח להקפיא" להשוואה. שיטת ההשעיה הייתה יעילה מאוד בידינו לקבלת דפוסי לוקליזציה לשחזור של מולקולות איתות כגון dpERK, כי מטבעם רגישים יותר לתנאי טיפול קשים. במקרה של לוקליזציה dpERK שעל פי ניסיוננו, אות אזור 1 היא כמעט בלתי ניתנת לגילוי באמצעות שיטת פיצוח ההקפאה. בנוסף, ייבוש מדגם, אשר לעתים קרובות יכול להתרחש עם שיטת פיצוח ההקפאה, תוצאות אותות נוגדן מזויפים. שיטת ההשעיה ממזערת ייבוש מדגם, מאז בלוטות המין מושעות בתוך נוזל לאורך כל התהליך. כמו כן, אנו מוצאים כי שיטת ההשעיה שימושית הדמית גנוטיפים שונים מרובים בשקופית אחת. לדוגמה, אם שני גנוטיפים, כגון הרמפרודיטים vsהנקבות כדי להשוות ישירות ללוקליזציה dpERK, שני גנוטיפים ניתן לערבב יחד ומעובד. זה אפשרי מכיוון פנוטיפים הם ברורים ניתן להבחין באמצעות מורפולוגיה DAPI. מכתים באותו צינור ואחריו הדמיה באותו שקופיות מאפשר השוואה ישירה בין בלוטות המין מן גנוטיפים שונים. לחלופין, אם מורפולוגיה DAPI אינן שונות, אז מכתים נוגדן שני שלבים יכולים להיות מאומץ. ראשית כל גנוטיפ פרט מטופל עם שני נוגדנים שונים, נוגדן A עבור WT ו נוגדן B עבור מוטציה (שני הנוגדנים שיועלו לארח נבדלת נוגדן dpERK). לאחר שני גנוטיפים כבר מוכתם עם הנוגדן הראשוני, ורחצו, הם יכולים להיות מעורבים יחד צינור אחד ועכשיו מוכתם נוגדן dpERK, ואחריו טיפול נוגדנים משני לדמיין את כל הנוגדנים בצינור. יכולת להשוות גנוטיפים שונים בשקופית אחת, במיוחד כאשר דeductions של דפוסי הפעלה נעשה מבטיח פרשנויות מדויקות לא שנפגעו ממחלות או מכתים ברורה.

בעוד יתרון, ישנם צעדים רבים ברחבי שיטת ההשעיה הדורשים מניפולציה זהירה. זה קריטי, כי והניתוחים להתרחש בתוך זמן בצורה יעילה; חשוב, והניתוחים לא צריכים לקחת יותר מ -5 דקות. פעמים לנתיחה עוד ליצירת אות dpERK משתנית, אשר לעתים קרובות יכול להיות שלא כהלכה כשינויים מוסדרים הפעלת ERK, ולא תקלות טכניות כמו. זה חיוני כדי להתחיל עם למעלה מ 100 - 150 חיות עבור כל לנתיחה משום שבמהלך לשטוף השונה צעדי בלוטות המין יכול ללכת לאיבוד בקלות מן הצינורות בגלל שגיאות pipetting. הפסד של בלוטות המין, ניתן להפחית באמצעות לנתח בקבוצות קטנות מרובות (כגון שלוש קבוצות של 50 חיות כל) כי ניתן לשלב, או על ידי לנתח אצווה אחת גדולה של 150. אתגר נוסף הוא מקבל את בלוטות המין לשכב באר כמרווח היווצרותניתן הדמיה בשקופית כך בלוטת המין דיסטלי כולו. כדי לאפשר זאת, השתמש עפעף על גפרור או טפטפת משך לחלל את בלוטות המין. עם זאת, יש להיזהר כדי לא לפגוע בלוטות המין במהלך תהליך זה. לעתים קרובות עם טכניקות אלה שנדרש ניסיונות מרובים להשתלט על והניתוחים וכן הסדרים של בלוטות המין על השקופיות.

לאחר הטכניקה הזו כבר שולטת, היא משמשת שיטה חזקה ניתוחים ביולוגיים מגוונים, וניתן להשתמש בו כדי ללמוד יותר מסתם רמות dpERK. לדוגמה שיטה זו יכולה לשמש כדי לחזות רמות p38 פעילות, או רמות CDK פעילות, או כל חלבון עבורו מגיב נוגדן קיים. בנוסף, השיטה יכולה להיות בשילוב עם מסך עיכוב כימי בחיות כולו assay למעכבי רומן או activators של המסלול, באמצעות assaying עבור רמות dpERK. זה יאפשר שהוקרא ממחשב in vivo של שניהם התגובה ורגישה לכל מעכבים שעשויים interact עם מסלול איתות RTK-RAS-ERK. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להשתמש בצירופי נוגדן עם יציאות איתות רבות שיכולים לשמש כל ו מדמיינים בבת אחת. באמצעות מספר נוגדנים מאפשר קורלציה בין מסלולים, מצב ההפעלה שלהם, ותוצאות כל זאת במסגרת של אותה הרקמה, המאפשר הבנה טובה יותר של האינטראקציות הללו. אלה הם רק כמה דוגמאות של יישומים נוספים של שיטה זו, אך מערכת זו יכולה להיות שונה כדי ללמוד תחומי מחקר מרובים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Inc. A9539 Dissolve 2 g in 100 mL to make the 2% solution
Flat bottom glass watch dish Agar Scientific AGL4161 We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles BD PrecisionGlide 305122
Syringes (could be 1 or 5 mL) BD Syringes 1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisherbrand 12-550-343
Coverslips (24 x 50 mm) Corning 2935-245
5 mL glass conical tube Corning 8060-5
9" disposable Pasteur pipette Fisherbrand 13-678-20D
Clinical bench top centrifuge
Glass  tubes (6 x 50 mm) Fisherbrand 14-958-A
*M9 solution
Levamisole Sigma L9756
3% Paraformaldehyde (PFA) Electron microscopy services 17500 Obtained as 16% solution in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer
1x PBS-T 1x PBS with 0.1% Tween 20
Methanol Electron microscopy services 18510
Normal goat serum (NGS) Cell Signaling 5425 Diluted to 30% in 1x PBS-T
MAPKYT (dpERK) antibody  Sigma Inc. M9692 Dilution 1:400 in 30% NGS
Secondary antibody Invitrogen A-11005 Dilution 1:500 in 30% NGS
DAPI Sigma D9542
Vectashield Vector Labs H-1000
*M9 Buffer Recipe 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. 
**PBS (1x) 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2, 0.10 g MgCl2, H2O to 1 L
Nematode Growth Medium (NGM) 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 min. Cool, and add 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1 M MgSO4 and 25 mL of 1 M KPO4. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410, 37-40 (2001).
  2. McKay, M. M., Morrison, D. K. Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK. Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).
  3. Sundaram, M. V. Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways. WormBook. , 1-38 (2013).
  4. Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer. Liver Int. 27, 155-162 (2007).
  5. Hackett, A., Rowe, L. FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report. Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).
  6. Murphy, L. O., Blenis, J. MAPK signal specificity: the right place at the right time. Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).
  7. Vogels, A., Fryns, J. P. Pfeiffer syndrome. Orphanet J Rare Dis. 1, 19 (2006).
  8. Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells. Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80, 179-185 (1995).
  10. Chang, C., Sternberg, P. W. C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling. Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).
  11. Lee, M. H., et al. Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development. Genetics. 177, 2039-2062 (2007).
  12. Lopez, A. L., et al. DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis. Dev Cell. 27, 227-240 (2013).
  13. Miller, M. A., et al. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation. Science. 291, 2144-2147 (2001).
  14. Ohmachi, M., et al. C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation. Curr Biol. 12, 427-433 (2002).
  15. Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121, 2525-2535 (1995).
  16. Hubbard, E. J., Greenstein, D. The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology. Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).
  17. Arur, S., et al. MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module. Dev Cell. 20, 677-688 (2011).
  18. Arur, S., et al. Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).
  19. Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline. Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).
  20. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans. Genetics. 141, 1399-1406 (1995).
  23. Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139, 579-606 (1995).
  24. Seydoux, G., Dunn, M. A. Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster. Development. 124, 2191-2201 (1997).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 117 RAS-ERK, Germline, immunofluorescence איתות חלבונים
ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial… More

Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (117), e54901, doi:10.3791/54901 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter