기계적 스트레스는 줄기세포의 연골형성 분화를 유도하여 손상된 연골 복구를 위한 잠재적인 치료법을 제공할 수 있습니다. 원심 중력(CG)을 사용하여 지방 유래 줄기세포(ASC)의 연골 분화를 유도하는 프로토콜을 제시합니다. SOX9의 CG 유도 상향 조절은 연골 형성 표현형의 발달을 초래합니다.
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이 논문에서
요약
초록
손상된 연골은 자연적으로 치유될 수 없습니다. 현재 연골 결손증에 대한 가장 발전된 치료법은 사이토카인을 사용하여 줄기세포에서 분화된 연골세포를 이식하는 것입니다. 안타깝게도, 사이토카인에 의한 연골형성 분화는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며 in vitro 분화 중 오염 위험이 높습니다. 그러나 생체역학적 자극은 연골 형성에 대한 중요한 조절 요인으로도 작용합니다. 예를 들어, 기계적 스트레스는 줄기세포의 연골형성 분화를 유도할 수 있으며, 이는 손상된 연골을 복구하기 위한 잠재적인 치료법을 제시합니다. 본 연구에서는 원심분리에 의해 쉽게 가해지는 기계적 응력인 원심중력(CG, 2,400 × g)이 지방 유래 줄기세포(ASC)에서 성 결정 영역 Y(SRY)-box 9(SOX9)의 상향 조절을 유도하여 연골 생성 표현형을 발현하도록 한다는 것을 입증했습니다. 원심분리된 ASC는 아그레칸(ACAN), 콜라겐 유형 2 알파 1(COL2A1) 및 콜라겐 유형 1(COL1)과 같은 연골 형성 분화 마커의 수치가 더 높았지만, 비후성 연골 세포의 마커인 콜라겐 유형 10(COL10)의 수치는 더 낮았습니다. 또한, 연골형성의 전제 조건인 연골형성 응집체 형성이 원심분리된 ASC에서 관찰되었습니다.
서론
관절 연골의 결함은 자연적으로 치유되지 않습니다. 따라서, 세포 이식이 손상 연골의 수리를 위해 유망한 방법으로 제안 된 줄기. 그러나,이 방법은 줄기 세포의 충분한 수의 취득 및 연골 분화를 받아야하는 이러한 세포의 유도를 모두 요구한다. 골수 (BM)은 널리 줄기 세포의 공급원으로서 사용되었지만, BM 세포의 분리는 두 가지 단점이있다 : 침입 불충분 수율. 때문에 취득 용이성, 지방 조직에서 줄기 세포의 바람직한 소스이다. 이전의 연구는 지방 조직으로부터 줄기 세포를 분리 및 TGF-β1 (1, 2)과 같은 사이토 카인을 사용하여 이들 세포의 연골 분화를 유도하는 가능성을 입증 하였다. 이러한 방법은 효과가 있지만 비싸다.
사이토킨에 대한 저비용 대안으로서, 기계적 응력에 사용될 수있다연골 분화를 유도한다. 기계적 부하는 관절 연골 (3)의 상태를 유지하는데 중요한 역할을하고, 여러 가지 세포의 연골 세포 표현형을 유도 할 수있다. 예를 들어, 수압은 MAP 키나아제 / JNK 경로 4를 통해 활막 유래 전구 세포의 연골 세포 표현형을 유도하고,....
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프로토콜
이 연구 프로토콜은 NIH 지침에 따라 가톨릭 대학교 (KC16EAME0162)의 기관 검토위원회의 승인을 수행 하였다. 모든 조직은 서면 통보 동의를 얻었다.
1. 원심 중력로드 및 펠렛 문화
- 세포 배양 및 수확
- 배양의 ASC (P2-P3, 자재 목록 참조), 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 배지 낮은 글루코즈 (DMEM-LG)에서 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터있다.
- 세포가 80 % 합류에 도달했을 때, 배지를 버리고 1X 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)으로 세포를 세척 하였다.
- PBS 함유 1mM의 EDTA 1 ㎖를 첨가하고, 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 2 분간 배양한다.
- 에 세포를 전송, 부드럽게 문화 판을 눌러 새로운 배지 4 mL를 넣고15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기 실온에서 2 분 (RT) 250 × g에서 세포.
- 원심 중력 하중
- 원심 분리 (단계 1.1.4) 후, 펠렛을 교란시키지 않고 상층 액을....
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결과
원심 중력 지방 유래 줄기 세포의 연골 세포 분화 마커의 과다 발현을 유도한다.
연골 분화를 유도하기에 적합한 원심 중력의 정도를 결정하기 위해,의 ASC는 15 분 동안 다른 CG의도 (0, 300, 600, 1,200, 2,400 XG)로 자극 하였다. 자극 후, ASC를 배양 플레이트에 다시 접종하고 24 시간 동안 배양 하였다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, SOX9 mRNA 발현은 현저히 2400 XG 증가시켰다 이 약 (의 ASC는 CG로드되지 않음) 제어에 비해 2,400 XG에서 높은 1.5 배이었다. CG는 연골 분화를 유도 여부를 확인하기 위해, 우리는 CG로드 또는 TGF-β1 처리에 의해의 ASC를 자극. 음성 대조군으로는 ASC를 자극하지 않고 배양 하였다. 샘플은 14 일에 수확하고, QRT-PCR을 실.......
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토론
세포의 stemness 상태는 SOX9의 CG에 의한 과잉 발현에 매우 중요합니다. 우리의 연구에서, SOX9 표현은 아니지만 나중에-통로의 ASC에서, 초기 통로의 ASC (2-3)에서 CG에 의해 유도 될 수있다. 배양 동안의 ASC 3 통로 (16)까지 CD34 + 세포를 포함하는 것으로보고되었다. 의 ASC는 세포가 CG로 낮은 반응의 결과로 계대 CD34의 발현을 상실하는 경향이있다.
원심 중력으로, 수압은 CG 자극하는 동안 세포에로드 할 수 있습니다. 따라서, 매질의 부피 SOX9의 유도에 영향을 미치는 하나의 요인 일 수있다. 각 실험에 대한 짝수 정수압 환경을 유지하기 위해, 배지 1 ㎖를 15 ㎖의 튜브에 1 × 105 세포 당 사용 하였다. 또한, 스윙 버킷 로터가 균일 (직각을 형성함으로써) 세포에 CG를 적용 하였다.
TGF-β1에 비해 C.......
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공개 사항
우리는 이 작업과 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
본 연구는 보건복지부(보조금번호: HI14C2116)의 지원을 받은 한국보건산업진흥원(KHIDI)의 한국보건기술연구개발사업(Korea Health Technology R&D Project)의 지원금과 가톨릭대학교 서울성모병원 연구기금의 지원을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Plasticware | |||
| 100 mm 접시 | TPP | 93100 | |
| 60 mm 접시 | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical 관 | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical 관 | SPL | 50015 | |
| 10 mL 일회용 피펫 | Falcon | 7551 | |
| 5 mL 일회용 피펫 | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM 저당 | Life Technologies | 11885-084 | 성장 기반 매체 |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | 연골 생성 분화 기본 매체 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 덱사메타손 | 시그마 알드리치 | D2915 | 100 nM |
| 페니실린 스트렙토마이신 | 생명 기술 | P4333 | 1% |
| 태아 소 혈청 | 생명 기술 | 16000-044 | 1% |
| 아스코르베이트-2-인산염 | 시그마 알드리치 | A8960 | 50 μ g/mL |
| L-프롤린 | 시그마 Aldrich | P5607 | 50 μ g/mL |
| ITS | BD | 1% | |
| Human TGFβ 1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm 커버 유리 | 우수한 | HSU-0111580 | |
| 4% 파라포름알디히드 | Tech & 혁신 | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| 소 혈청 알부민 | 벡터 랩 | SP-5050 | |
| 안티콜라겐 II 항체 | abcam | ab34712 | 1:100 |
| 염소 anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, 코팅 | 현일 Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| 클로로포름 | 시그마 알드리치 | 366919 | |
| 이소프리필알코올 | 밀리포어 | 109634 | |
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| 인간 지방 유래 줄기 세포 (ASC) | 카톨릭 마스터 세포 |
참고문헌
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al.
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재인쇄 및 허가
