本文介绍了一种利用原子力显微镜（AFM）通过单分子力谱测量技术，研究明确定义的无机表面与肽或氨基酸之间相互作用力的实验方案。该测量所获得的信息对于深入理解肽-无机材料界面具有重要意义。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质或肽与无机材料之间的相互作用会引发多种有趣的物理化学过程。例如，将蛋白质与无机矿物结合可形成具有独特性能的复合材料。此外，生物污损（biofouling）这一不利过程始于生物分子（主要是蛋白质）在材料表面的吸附，所形成的有机层为细菌提供了附着基础，使其能够与表面发生相互作用。因此，理解调控有机-无机界面相互作用的基本作用力，对于光学、力学及生物医学应用中的新材料设计等多个研究领域均具有重要意义。本文介绍了一种利用原子力显微镜（AFM）测量肽或氨基酸与明确表征的无机表面之间黏附力的单分子力谱技术。该技术包括通过共价柔性连接臂将生物分子固定于AFM探针尖端的实验方案，以及利用原子力显微镜进行单分子力谱测量的方法。此外，还包含了对这些测量数据的分析方法。
引言
蛋白质与无机矿物之间的相互作用可形成具有独特性质的复合材料，包括具有高强度机械性能或特殊光学性质的材料。1,2 例如，蛋白质胶原与矿物羟基磷灰石的结合可形成具有不同功能的软骨或硬骨。 3 短肽也能够以高特异性结合无机材料。 4,5,6 这些肽的特异性已被用于设计新型磁性与电子材料7,8,9、制备纳米结构材料、晶体生长 10以及合成纳米颗粒。11 因此，理解肽或蛋白质与无机材料之间相互作用的机制，将使我们能够设计出具有更优吸附性能的新型复合材料。此外，由于植入物与免疫反应之间的界面由蛋白质介导，更深入地理解蛋白质与无机材料的相互作用将提升我们设计植入物的能力。另一个涉及蛋白质与无机表面相互作用的重要领域是防污材料的制备。
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方案
1. 针尖修饰
- 购买带有硅探针的氮化硅（Si3N4）原子力显微镜（AFM）悬臂梁（标称悬臂梁半径约为 2 nm）。
- 将每个AFM悬臂梁浸入无水乙醇中清洗20分钟，在室温下干燥，然后将其暴露于O2等离子体中处理5分钟。
- 将清洁后的探针悬置于含有甲基三乙氧基硅烷和3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷（体积比为15:1）的溶液上方约3 cm处，置于惰性气氛（氮气或氩气）下的干燥器中，并将干燥器连接至真空泵。抽真空2小时，以形成这两种混合硅烷化合物的单分子层。
- 使用专为此过程制备的金属探针夹具将探针放置于加热板上，然后在大气条件下于70 °C干燥10分钟。使用前，用乙醇清洁加热板、金属夹具和镊子。
- 将探针在室温下冷却，随后将其浸入含5 mM浓度的芴甲氧羰基-聚乙二醇-氮羟基琥珀酰亚胺（Fmoc-PEG-NHS，分子量5,000 Da）的氯仿溶液中，该溶液另含0.5%（v/v）三乙胺，反应1小时。
- 将探针在氯仿中浸洗5分钟，再在二甲基甲酰胺（DMF）中浸洗5分钟。为脱除连接的PEG分子上的Fmoc保护基团，将探针在含20%（v/v）哌啶的DMF溶液中浸泡30分钟。随后将探针在DMF中浸洗4分钟，再在N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中浸洗4分钟。重复此顺序浸洗步骤三次。
- 进行氨基酸偶联时，将探针浸入5 mL NMP溶液中，该溶液含有N端保护的氨....
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结果
图1展示了针尖修饰的流程。第一步中，通过等离子体处理改变氮化硅针尖的表面，使其表面生成羟基（OH基团），这些基团随后与硅烷发生反应。此步骤结束后，针尖表面将被游离的-NH2基团覆盖。这些游离的氨基随后与Fmoc-PEG-NHS（一种共价连接剂）发生反应。PEG连接剂中的Fmoc基团通过去保护试剂哌啶去除。最后，利用偶联试剂HBTU，将待研究的氨基酸或肽分子通过PEG上的游离氨基进行偶联。
使用经过修饰的AFM探针，可以检测氨基酸或肽与表面之间的相互作用（图2）。PEG分子将肽或氨基酸与探针尖端隔开，使其能够自由取向。典型的力测量结果为力-距离曲线（图3）。该曲线具有探针与表面分离的特征点，以及单分子黏附事件。第一个峰代表探针与表面之间的非特异性相互作用，第二个峰则对应特异性黏附事件。通过对数百条力-距离曲线进行分析，可绘制黏附事件.......
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讨论
在操作步骤1.3、1.4和1.7时应格外小心，并以极其轻柔的方式进行。在步骤1.3中，移液枪头不应与硅烷混合物接触，且硅烷化过程应在惰性气氛（无湿气）中进行45。这是为了防止多层结构的形成，因为硅烷分子在水分存在下极易发生水解45。
在步骤1.4中，应适当控制温度和时间。在开始步骤1.5之前，须将小柱冷却至室温；否则小柱可能受损。在偶联步骤（1.7）中，HBTU与待测氨基酸或肽应完全溶解于混合液中。偶联完成后，须用不同溶剂以非常温和的方式洗涤小柱，以避免对小柱造成任何损伤。
该报道的技术可应用于任何肽或氨基酸。为了修饰硅探针，我们使用硅烷化合物。这是一种通用的化学方法，可以进行调整。例如，可以使用一种或两种聚乙二醇化硅烷来修饰探针表面。23,25,26
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由玛丽·居里国际回归基金（EP7）资助。P. D. 感谢以色列高等教育委员会提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带硅探针的氮化硅（Si3N4）原子力显微镜悬臂 | Bruker (Camarilo, CA, USA) | MSNL10，悬臂名义半径约 2 nm | |
| 甲基三乙氧基硅烷 | Acros Organics (New Jersey, USA) | 用于原子力显微镜探针的硅烷化 | |
| 3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷 | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | 用于原子力显微镜探针的硅烷化 | |
| 三异丙基硅烷 | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | 用于多肽去保护 | |
| N-乙基二异丙基胺 | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | 用于探针修饰 | |
| 三乙胺 | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | 用于探针修饰 | |
| 哌啶 | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | 用于探针Fmoc去保护 | |
| 芴甲氧羰基-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺（Fmoc-PEG-NHS） | Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany) | 用作共价柔性连接臂 （分子量 = 5,000 Da） | |
| 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU） | Alfa Aser (Heysham, England) | 用作偶联试剂 | |
| N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP） | Acros Organics (New Jersey, USA) | 用于探针修饰过程中的溶剂 | |
| DMF（二甲基甲酰胺） | Merck (Darmstadt, Germany) | 用于探针修饰过程中的溶剂 | |
| 氯仿 | Bio-Lab (Jerusalem, Israel) | 用于探针修饰过程中的溶剂 | |
| 乙醇（无水） | Gadot (Netanya, Israel) | 用于探针修饰过程中的溶剂 | |
| 三氟乙酸（TFA） | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| 乙酸酐 | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| 多肽 | GL Biochem (Shanghai, China) | ||
| 苯丙氨酸和酪氨酸 | Biochem (Darmstadt, Germany) | ||
| 30% 二氧化钛（TiO2）分散液，溶剂为2-(2-甲氧基乙氧基)乙醇（DEGME）和3-乙氧基丙酸乙酯（EEP）的混合物 | Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel) | （30%）溶于2-(2-甲氧基乙氧基)乙醇（DEGME）和3-乙氧基丙酸乙酯（EEP）的混合溶剂中。用于制备TiO2基底 | |
| 云母基底 | TED PELLA, INC. (Redding, California, USA) | 直径 9.9 mm |
参考文献
- Addadi, L., Weiner, S. Control and design principles in biological mineralization. Angew. Chem., Int. Ed. 31 (2), 153-169 (1992).
- Meyers, M. A., Chen, P. Y., Lin, A. Y. M., Seki, Y. Biological materials: Structure and mechanical properties. Prog. Mater. Sci. 53 (1), 1-206 (2008).
- Villee, C. A. J.....
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重印与许可
